다양한 pH 조건하에서 휴믹물질 흡착적 분획현상에 의해 변화하는 용존 및 kaolinite에 흡착된 휴믹물질(Aldrich 휴믹산)과의 pyrene의 결합변화를 조사하였다. 먼저 흡착효과를 배제한 흡착 전 상태에서 bulk 휴믹산은, pH에 따른 분배(partitioning)과 크기별 배제효과 영향 차이에 의해 유기탄소 결합계수의 변화를 보였다. 모든 용액 pH 조건에 서 Aldrich 휴믹산은 kaolinite에 흡착하는 과정에서 분자량별 분획이 일어났으며 용존 휴믹산의 분자량은 흡착전의 분자량과는 달랐다. 그에 따라 흡착 후 남은 휴믹산과의 pyrene 결합계수는 흡착 전의 경우와 달랐다. pH 7과 9 조건에서 흡착 후 남은 휴믹산은 그 분자량과 pyrene 결합계수 사이에 양성 상관관계를 보였으나 그러한 상관관계가 pH 4의 조건하에서는 관찰되지 않았다. 이러한 차이는 흡착적 분획과정에서 pH 4인 경우 고분자에 대한 독점적 분획현상이 없었고 분자량에 대해 다소 균일한 분획이 일어났다는 점으로 설명할 수 있었다. 또한 관찰되는 분획현상 차이는 pH 조건에 따라 달라지는 흡착포화 정도 차이 때문인 것으로 사료된다. 흡착된 PAHA의 경우, 형태변화 (conformational changes) pyrene 결합에 중요한 것으로 나타났다. pH 7과 9 조건 하에서, 흡착전의 휴믹산의 경우 더 낮은 pyrene 결합계수를 보였고 이러한 형태변화효과는 pH가 높을수록 더 크게 나타났다.
말징버섯 Calvatia craniformis의 culture broth 40 liter를 여과하여 얻은 균사채를 열수 추출하여 진한 갈색 건조분말(Fr. A) 13.1g을 분리하였다. Fr. A에 대하여 DEAE-cellulose ion chromatography를 시행하여 중성분획인 흰색 분말 (Fr. B) 2.50g을, 산성분획인 갈색 분말 (Fr. C) 3.50g을 각각 분리하였다. Fr. B 500mg에 대하여 Sepharose CL-4B gel filtration chromatography를 시행하여 흰색분말 Fr. D(Calvatan) 350mg을 분리하였다. Calvatan 350mg에 대하여 Con A-Sepharose 4B affinity chromatography를 적용하여 미흡착 분획인 Fr. F($\alpha$-form)와 흡착 분획인 Fr. E ($\beta$-form)로 정제하였다. 항암작용의 기전을 구명하고자 마우스에 대하여 면역학적 실험을 시행하였다. macrophage의 활성에 대한 영향을 조사하였던 바, 투여군의 활성화된 macrophage에 의해 유리되는 superoxide anion의 양은 대조군에 비해 1.4배 증가하였고 Calvatan 투여군의 용혈반 형성세포(PFC)는 대조군에 비해 3.1배 증가하였다. 화학 분석에 의해, Calvatan은 다당체 87.2%, 단백질 1.8% 및 hexosamine 1.3%로 구성되어 있었다. 따라서 항암성 분획들은 protein-bound polysaccharide임을 알 수 있었다. 또한 각 분획의 다당체를 구성하고 있는 단당류는 glucose, galactose, mannose 및 xylose 였으며 단백질 부분은 16종의 아미노산으로 구성되어 있었다. IR 스펙트럼은 3300-3400 $cm^{-1}$에서 0-H stretching frequency, 2900 $cm^{-1}$ 에서 C-H stretching frequency, 1630 $cm^{-1}$ 에서 C-0 stretching frequency. 1000-1100 $cm^{-1}$에서 C-H 및 C-0 bending frequency를 나타내는 다당체의 전형적인 특성을 보여주었다.을 보여주었다.
흑목이 버섯의 자실체로부터 열수추출에 의해 흑갈색 색소를 함유한 조다당(crude polysaccharide)을 분획하였고, 이 조다당 분획의 흑갈색 색소 성분을 탈색 제거하기 위해 활성탄을 이용한 흡착공정을 검토하였다. 흡착 평형은 10분 이내의 빠른 시간에 도달하였으며, 최적의 흡착 조건은 pH 7.0 및 온도 40$^{\circ}C$에서 조다당 용액 1 mL당 활성탄 16.7 mg을 첨가하였을 때 얻어졌다. 이 때의 최대 흡착효율은 약 80%이었고, 색소 성분의 제거로 다당은 정제되어 1.25배의 정제율을 나타내었다. 한편, 활성탄에 의한 색소의 등온흡착은 Langmuir 등온식에 따랐으며, 흡착속도는 2nd order model 식으로 나타낼 수 있었다. 또, 흡착은 확산을 통해 조절되는 물리적 흡착공정인 것으로 나타났다. 흑목이 버섯 조다당으로부터의 활성탄에 의한 색소흡착 공정은 그동안 보고된 바 없으며, 경제적이고 간편하여 향후 흑목이 버섯 조다당의 색소 제거와 정제 및 이에 의한 다당 정제공정으로서의 가능성이 있는 것으로 판단하였다.
1. 서론 : 장 흐름 분획법(Field-Flow Fractionation, FFF)의 개발은 고분자 및 미세한 콜로이드 입자의 분리, 분석, 분취를 위한 빠르고 선택적인 분리방법의 필요성과 액체 크로마토그래피 의 경우 고정상에서 유발되는 시료흡착에 의한 칼럼 효율저하의 문제를 극소화하기 위한 필요에 의해서 출발하였다. 본 연구의 목적은 중공사막 흐름장 흐름 분획법에 사용되는 중공사막 칼럼을 개잘하여 칼럼내의 시료의 거동을 이론적으로 해석하여 분리능과 분리효율을 기존의 방식보다 향상시켜 여러 용도로 응용이 가능한 저렴한 칼럼의 개발의 가능성을 제시하는데 있다.
막분리공정에서 분리막 오염은 투과율 감소에 큰 영향을 받는데 그 이유는 주로 막재질의 변질 및 막 표면에서의 농도 분극 현상에 기인하고 분리막의 종류 및 분획분자량의 차이에 따라 막분리 능력이 달라질 수 있다. 본 연구에서는 상용화되어 있는 UF/MF 중공사막에 미치는 막오염 정도와 세정 특성을 알아보았다. 막오염 정도는 막의 Pore size, 소재, 막구조에 따라서 단백질 수용액을 처리하여 막의 오염이 어떻게 일어나는지를 알아보았고 막오염 정도를 검토하기 위하여 초기순수에 대한 흡착후 투과량을 DOF(Degree of fouling)로 정의하였다. 막의 세정특성은 0.1N-NaOH을 사용하여 화학적 세정효과를 확인하였고 초기 순수에 대한 세정후 회복정도를 DOC(Degree of Cleaning)로 정의하였다. 또한 UF막에서 분획분자량별 특성과 MF막에서 소재별/구조적 특성이 DOF와 DOC에 미치는 영향에 대해서 알아보았다.
유지방을 초임계 이산화탄소로 추출한 후 흡착제를 통과시켜 콜레스테롤이 제거되고, 지방산 조성이 다른 유지방 분획들을 얻기 위하여, 콜레스테롤 흡착능이 있는 것으로 알려진 몇 가지 흡착제를 선택하여, 추출온도 $40^{\circ}C$, 추출압력 276, 345 bar에서 3 또는 4시간 동안 추출하면서 흡착제의 종류별, 입자크기별, 비율별로 추출시간에 따른 유지방의 수율, 콜레스테롤 함량, 지방산 조성을 측정하였다. 흡착제로서 ${\beta}-cyclodextrin,\;talc,\;celite,\;florisil$ 중에서 florisil이 유지방으로부터 콜레스테롤 제거율이 가장 높았다. Florisil의 입자크기별로 콜레스테롤 제거율은 30/60 mesh가 가장 높았으며, 그 다음 100/200, 60/100 mesh순이었다. 유지방에 대하여 흡착제의 비율이 높으면 콜레스테롤 제거율은 높은 반면, 지방의 수율은 감소하였는데, 유지방의 수율을 높이면서 콜레스테롤 제거율을 높이기 위해서는 유지방과 흡착제의 비율은 20:10이 적당하였다. 추출분획물의 지방산 조성을 측정한 결과 저급 지방산들은 초기 추출물 분획들에 농축되었고, 고급 지방산들은 추출잔류물 분획에 농축되었다. 이상의 결과로부터 초임계유체 추출 및 흡착법은 유지방으로부터 콜레스테롤을 제거하는 동시에 저급지방산, 불포화지방산, 버터향, 색소가 농축된 분획 등을 얻을 수 있었다.
본 연구에서는 상지에 배양한 상황버섯 균사체 유래 다당류의 기능성 식품 소재로의 활용 가능성을 확인하기 위해 조다당류의 분리 및 정제를 통해 분획을 얻었으며, 다양한 면역증강 효과를 확인하였다. 건조된 조다당류를 DEAE-sepharose CL-6B를 이용하여 크로마토그래피한 후 340 nm에서의 흡광도, 단백질, 당 및 uronic acid 함량을 분석한 결과, 증류수로 용출되는 비흡착 분획(PF-1, 분획번호 3~15)과 흡착된 후 NaCl 용액에 의해 용출되는 분획(PF-2, 분획번호 24~33)을 얻었다. 분획물 PF-1 및 PF-2의 유용성분 함량으로 총당 함량은 각각 75.51%, 52.38%, 총단백질 함량은 1.63%, 8.41%, uronic acid 함량은 17.53%, 15.04% 및 ${\beta}-glucan$ 함량은 28.33%, 25.04%로 나타났다. PF-1 및 PF-2에 대해 대식세포주에 처리하여 세포생존율을 확인한 결과 $100{\mu}g/mL$ 농도까지 유의적으로 세포사멸이 나타나지 않아 세포독성이 없음을 확인할 수 있었다. Nitric oxide 생성량은 PF-1 $100{\mu}g/mL$에서는 nitric oxide 생성량이 $23.11{\mu}M$로 나타나 양성대조군으로 사용된 LPS 100 ng/mL 처리군($30.30{\mu}M$)의 약 76%의 효과가 있는 것으로 확인되었으며, cytokine 생성량($TNF-{\alpha}$ 및 IL-6) 또한 무처리군에 비하여 높은 생성량을 나타내었다. Polymerase chain reaction을 통한 면역 관련 유전자 발현분석 결과, iNOS, COX-2, $TNF-{\alpha}$, IL-6에서 PF-1 분획에서 높은 발현량을 나타내어 면역 증강을 목적으로 한 기능성 식품 개발에 활용 가능하다고 판단된다.
포유동물의 암컷 생식기관에 존재하는 다양한 종류의 matrix metallo-proteinase (MMP)는 난소와 자궁의 구성성분의 주기적인 변화를 조절하며 이중 난소의 MMP는 난포의 성장과 배란 그리고 퇴화 동안 조직재구성에 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 본 실험에서는 근래에 새로 발견된 사람의 난포액에 존재하는 분자량 약 110kDa인 MMP-2 isoform GA110을 동정하고 자 하였다. 난포액으로부터 GA110 단백질을 분리하기 위하여 난포액에 5mM ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)를 처리한 후 DEAE Sepharose Fast Flow를 이용한 chromatography를 시행하였다. 그 결과, 난포액 단백질들은 0.2M NaCl 의 분획에서 GA110 활성을 나타내었고 anti-human MMP-2 antibody에 대한 면역반응도 뚜렷이 나타났다. DEAE Sepharose Fast Flow에서 얻은 분획 중 GA110의 활성과 면역반응을 모두 나타내는 분획만을 모아 Gelatin Sepharose 4B affinity chromatography로 다시 분리하였다 분리한 결과 resin에 흡착된 단백질 (eluate) 분획들에서 매우 뚜렷한 GA110 gelatinase 활성을 나타내었으며 면역반응 또한 관찰되었다. 이 분획들의 단백질을 농축한 후 zymography를 시행하여 나타난 GA110 단백질 band를 잘라 내었으며 이로부터 단백질을 electroelution하여 농축한 후 reducing agent인 2-mercaptoethanol를 처리하였다. 이를 전기영동 후 MMP-2 (propeptide region) antibody를 사용하여 immunoblotting 한 결과 70-72kDa의 단백질만이 면역반응을 나타내었다. 마지막으로 위와 같이 준비된 70-72kDa 단백질의 아미노산 서열을 Edman degradation 방법으로 분석하였다. 그 결과 이 단백질의 N 말단의 10개의 아미노산 배열 순서가 알려진 사람의 proMMP-2의 전체 배열순서 중 propetide domain의 N 말단에서부터 다섯 번째에서 시작하여 10개의 아미노산의 서열과 정확하게 일치하였다. 위 결과들로 미루어 사람의 난포액에 존재하는 MMP-2의 새로운 isoform인 GA110은 70-72kDa의 ProMMP-2가 disulfide bond를 통해 homodimer 구조를 이루고 있는 것으로 여겨진다.
본 연구는 폐 금속광산으로부터 발생한 중금속이 주변 환경으로 오염 확산되는 특성과 이를 중금속으로 오염된 토양의 효과적인 복원 방안을 모색하기 위하여 토양내 중금속의 거동 특성을 바탕으로 한 반응 특성을 조사하였다. 토양내 중금속의 이동성과 생물에 의한 흡수에 영향을 미치는 화학적 존재 형태를 중금속이 다량 함유되어 있는 충남 청양의 구봉 폐 금광의 광미와 인위적으로 중금속을 오염시킨 농경지 토양에서 중금속의 토양과의 화학적 결합 형태를 연속 축출법에 의해 분리하였으며, 그 순서에 따라 토양 내에서 다음과 같이 용해도와 이동성이 감소한다: Soluble fraction> exchangeable>carbonate>Fe-Mn oxide>organic>residual fraction. 광미중에 결합 부위에 가장 높은 친화력을 보인 Pb는 대부분 Fe-Mn Oxide와 Carbonate fraction에 존재하였고 이 두 Fraction에 각각 48.3%와 26.8% 나타났다. Cu와 Cd는 각각 organic과 carbonate fraction이 71.8% 42.9%로 가장 높게 나타났다. 이들 fraction은 비교적 이동성이 강한 fraction으로 중금 속의 오염 조사시 반드시 평가되어야 하며, 복원방안 결정시 반드시 고려되어야 할 것이다. 중금속을 인위적으로 흡착시킨 토양에 있어서 중금속은 대부분 Exchangeable, carbonate 그리고 Fe-Mn oxide fraction 흡착되어 있는 것으로 나타났다. 예산통에 있어서 흡착된 Pb는 이들 fraction에 91%가 존재하였고, Cu는 Fe-Mn Fraction에 30.4% 그리고 Cd는 exchangeable fraction에 67.9% 가 존재하였다. 월곡통에 있어서는 흡착된 Cd는 Exchangeable fraction에 93.2%가 존재하였고, Pb와 Cu는 대부분 exchangeable, carbonate와 Fe-Mn Oxide에 흡착되어 있었다. 따라서 토양내 이들 중금속이 가해질 경우 대부분 독성이 강한 오염원으로서 잠재적인 이동성과 생물학적 흡수가능성을 갖는 것으로 나타났다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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