황색 포도상구균은 급성 구강 감염에 있어서의 병원균이다. 그러나 그러한 황색 포도상구균의 병원성 기전은 완전히 이해되지 않았다. 이전 실험에서 황색 포도상구균의 단백질 A와 골격근의 액틴 필라멘트는 인체 상피 세포로의 황색 포도상구균의 침입에 관여한다. 구강 내 감염에 있어서의 황색 포도상구균의 병원성 기전을 조사하기 위해 인체의 치은 섬유모 세포에 대한 침입이 연구되고 있다. 급성 구강 감염을 가진 환자로부터 분리된 ATCC 25923 황색 포도상구균과 OPT 2 황색 포도상구균의 침입은 시간(0-120분)에 의존한다는 사실을 밝혀냈다. 60분을 초과하는 배양시간은 다시 배양된 균집락수 증가를 가져왔다. 배지에 접종한 세균의 숫자가 증가할 때 (100?10,000,000 cfu/ml/well), 직선적으로 증가한다. 단백질 A가 결핍된 Wood 46 황색 포도상구균의 침입은 단백질 A가 발현된 균주(ATCC 25923과 OPT 2)의 침입보다 훨씬 낮았다. 액틴 필라멘트의 합성을 방해하는 Cytochalasin D는 인체 치은 섬유모세포로 황색 포도상구균 (ATCC 25923과 OPT 2)이 침입하는 것을 방해한다. 이러한 결과는 구강내 감염을 일으키는 황색 포도상구균의 병원성 기전이 세포내 침입에 관여하고, 황색 포도상구균 단백질 A와 골격근의 액틴 필라멘트가 인체 치은 섬유모세포로의 황색 포도상구균의 침입 조절에 관여한다는 것을 보여준다.
황색포도상구균이 정상인 피부의 경우 $2{\sim}25%$에서 검출되는 반면 아토피 피부염이 있는 소아와 어른에 있어 $78{\sim}100%$의 높은 비율로 검출되며, 황색포도상구균과 초항원으로 작용하는 독소가 아토피 피부염의 악화 및 발병기간에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 본 연구는 아토피 피부염 환자 피부의 황색포도상구균의 분석과 함께 아토피 피부염 환자의 연령, 성별, 발병 연령과 투병기간, 악화되는 계절 및 진물과 황색포도상구균과의 관계에 대하여 알아보고자 실시하였다. 아토피 피부염 환자 대부분(84%)에서 병변부에 S. aureus가 집락을 형성하고 있는 것으로 나타났으며, 대부분의 아토피 피부염 환자의 피부에 S. aureus가 분포하고 있음을 알 수 있었고 아토피 피부염 병변부의 진물과 S. aureus의 밀접한 관계를 확인할 수 있었다. 따라서 아토피 피부염 환자의 피부에서 황색포도상구균 및 초항원독소를 차단한다면 아토피 피부염의 개선에 많은 도움이 될 것으로 사료된다.
황색포도상구균은 병원에 의한 감염, 혈류 감염을 포함하는 중요한 병원체이다. 특히, 포도상구균의 혈액 수집의 신속한 동정과 메치실린 내성이 일어나게 되면 폐혈증으로 추측되어 진다. 본 저자는 적은 양의 핵산을 등온증폭반응에 적응시켜 증폭산물을 SYBR Green I을 결합하여 염기서열에 특이적으로 검출할 수 있는 새로운 방법을 제시하고 있다. 그리고 이 독특한 유전자 증폭방법은 등온의 상태에서 하나의 효소만으로 증폭이 가능하다. 포도상구균-등온증폭반응은 황색포도상구균에 특이적인 protein A를 암호화하는 spa 유전자와, 메치실린 내성인 pennicillin-binding protein-2를 암호화하는 mecA 유전자를 타겟으로 하여 MRSA와 MRSE를 검출하였다. 본 연구에서는 등온증폭법을 사용하여 황색포도상구균과 표피포도상구균의 임상샘플을 검출하였다. 황색포도상구균과 표피포도상구균을 10배위 정량 희석하여 시리즈별로 샘플을 만들어 실험을 수행하였다. 칩을 기반으로 하는 LAMP법은 포도상구균 감염여부를 쉽고, 빠르고, 정확하게 민감도 있는 검출을 가능하게 해 주었고, 샘플을 측정할 수 있는 한계값을 넘는 상황에 특이적으로 적용할 수 있다.
우리나라 식중독 발생 중에 중요한 원인이 되고 있는 황색포도상구균에 대해 초밥, 김밥, 식육 제품, 크림이 포함된 빵, 케이크 류, 냉면의 다양한 식품 종류에서 평균적으로 매년 5.3% 분리율을 보였으며 가열 과정을 거친 식품에서도 황색포도상구균이 완전히 사멸하지 않고 남아 있음을 알 수 있었다. 또한 유통 과정 및 판매과정이 식품 오염의 매우 중요한 원인이 되므로 냉장을 유지하는 유통 판매과정이 필요하며 소비자도 식품을 구매하고는 바로 섭취를 하거나 섭취하기 전 까지는 냉장 유통을 유지하여야 한다. 황색포도상구균의 한국 식품위생법 기준치 100 cfu/g 이상으로 검출된 시료는 김밥이 1.5%, 냉면이 1.5%, 초밥이 0.5%이고 평균 균수는 냉면이 7,682 cfu/g로 가장 높았다. 초기에 균에 의해 오염된 식품은 냉장 유통 과정을 거치지 않는다면 오염균이 급격하게 증식되어 식중독을 유발할 가능성이 매우 높으므로 초기 오염에 대한 철저한 관리가 요구되어진다. 황색포도상구균은 온도에 영향을 받으며 계절별로 여름철에 황색포도상구균의 오염이 높았으나 상대적으로 관리가 소홀해지는 겨울철에도 주의를 요한다. 식품에서 황색포도상구균은 장독소 SEA가 표현형, 유전형 우점형 이였으며 총 150주 (33.1%)에서 장독소 유전자가 검출되었으며 sea=sei, seh 순으로 검출되었다. 식품별로는 독소 유전자 유형이 다양하게 검출되었으며 특히 tst 유전자가 10주(3.6%) 검출되었다. SED 독소는 표현형과 유전형이 일치 하지 않았다(p>0.05). 새로운 독소들에 대한 PCR 법에 의한 독소 유전자 검출로 분리주를 구별은 신뢰할 수 있었다. 최종적으로 우리나라 식품에서 분리된 황색포도상구균의 특징을 연구를 통해서 향후 식중독 발생 예방 방지를 위해서 사용할 수 있는 기초 자료를 제공하고자 하였다.
본 연구는 삼각김밥에서 황색포도상구균 위해평가를 통해 삼각김밥의 섭취에 따른 황색포도상구균 식중독 발생 가능성을 분석하였다. 삼각김밥에 대한 황색포도상구균 오염도를 조사한 결과 170개의 시료가 모두 황색포도상구균 음성이었으며, 확률분포 조사를 통해 확인된 삼각김밥에서의 황색포도상구균의 초기 오염수준은 평균 -3.88 log CFU/g이었다. 삼각김밥의 섭취량 및 섭취자 비율은 미생물 위해평가를 위한 50대 주요 식품의 섭취량 및 섭취패턴 자료를 바탕으로 적정 확률분포모델을 도출하였으며, 삼각김밥의 1일 평균 섭취량과 섭취자 비율은 각각 191.31 g과 0.033으로 나타났다. 유통환경에 따라 시나리오를 구성하여 최종적으로 1일 1회 삼각김밥을 섭취하였을 때 황색포도상구균에 의한 식중독 발생확률은 평균 1.44×10-10로 추정되었다. 민감도 분석에서는 황색포도상구균 오염수준, 섭취량, 편의점 보관온도, 편의점 보관시간 등의 변수가 위해도와 가장 높은 양의 상관관계를 보였다. 본 연구에서는 삼각김밥에서의 황색포도상구균 식중독 발생 가능성은 인구 100,000명이 삼각김밥을 1일 1회 섭취했을 때 0.0000144명에게서 식중독이 발생할 수 있는 것으로 나타나 계속적으로 안전한 삼각김밥이 소비자에게 유통되기 위해서는 지속적으로 삼각김밥의 안전한 제조, 매장 내 보관온도 및 시간에 대한 모니터링이 필요할 것으로 사료된다.
본 연구는 Lightcycler (Roche)를 이용한 Real-Time PCR(LC-PCR)기법을 통하여 원유시료에서 신속, 정확하게 황색포도상구균을 검출하는 기법을 개발하고자 하였다. coagulase 전구체를 coding하는 113 bp의 coa 유전자의 증폭, melting curve 분석 및 DNA염기서열을 분석하여 황색포도상구균 특유의 유전자 검출하는 기법을 개발하였다. 또한 분리된 균주중 메치실린에 내성을 나타내는 균주를 검출하고자 penicillin-binding protein, PBP2a (mecA)를 coding 하는 209 bp의 mecA 유전자의 증폭, melting curve 분석 및 DNA염기서열을 분석하여 메치실린내성 황색 포도상구균을 real-time PCR 기법으로 검출하는 기술을 개발하였다. 본 실험에 따르면 647개의 원유시료중 6개의 시료에서 황색포도상구균이 검출되었으며 이중 2개의 시료에서 분리된 황생포도상구균이 메치실린내성 황색포도상구균임을 확인하였다. 또한 DNA 검출한계는 10 fg으로 기존 PCR에 비해 매우 감도가 우수한 것을 확인하였다. 또한 3개의 원유시료에서 돼지나 소의 삼출성 피부염의 원인균인 Staphylococcus chromogenes가 분리되었다.
향후 소비가 더욱 증가할 것으로 예상되는 즉석섭취식품 중 샌드위치를 대상으로 제조공정의 특성상 생물학적 위해 중 높은 빈도로 검출될 것으로 예상되는 황색포도상구균에 대해서 정성적${\cdot}$정량적 검출실험을 실시하였다. 분석시료는 편의점, 대형할인마트, 샌드위치 전문점, 개인운영제과점, 패스트푸드점, 급식소에서 판매되는 샌드위치를 대상으로 하였다. 분석결과 전체 174개의 시료 중 18개, 전체 10.3%에서 황색포도상구균이 검출되었으며 검출량은 평균 1.74 log CFU/g으로 0.30 log CFU/g에서 최대 4.08 log CFU/g까지 검출되었다. 황색포도상구균의 계절에 따른 검출량은 여름철(3.24 log CFU/g)이 겨울철(1.10 log CFU/g)에 비해서 3배 정도 많아 통계적으로 유의적인 차이가 있었다(p<0.001). 영국 PHLS의 즉석섭취식품의 황색포도상구균에 대한 미생물 가이드라인을 기준으로 평가했을 때 본 실험의 전체 분석 대상 시료 중 95.4%가 허용할 수 있는 수준이었다. 또한 햄 치즈샌드위치에 대한 독소형성 확인 실험 결과 4.95 log CFU/g 이상으로 황색포도상구균이 증식되지 않으면 독소가 생성되지 않는다는 것을 알 수 있었다. 샌드위치의 황색포도상구균에 대한 정량적 오염도 분석에 대한 본 실험 결과는 샌드위치를 포함한 즉석섭취식품의 정량적 위해평가를 위한 기초자료로써 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
전국 4개 대도시(서울, 부산, 대전, 광주)를 중심으로 시중에서 유통되는 김밥 중 황색포도상구균의 오염도 자료와 환경조건별 미생물 변화를 예측하는 Food MicroModel$^{(R)}$ 을 활용하여 김밥 중 황색포도상구균으로 인해 식중독이 발생하지 않을 유효기간을 산정 하였다. 분식점(n=79), 백화점(n=10),편의점(n=20)으로 구분하여 분석한 여름철 평균 황색포도상구균 모니터링자료(검출률 각각 39.2%, 30%, 15%)를 시중에서 유통되는 김밥 중 황색포도상구균의 최대섭취유효시간 산정에 활용하였으며, 모델 운영 시 김밥 중 황색포도상구균으로부터 enterotoxin이 생성되는 균수인 2 ${\times}$$10^{7}$ 에 도달하는데 소요되는 시간을 최대섭취유효시간으로 추정하였다. 하절기의 환경조건을 고려하기 위하여 $25^{\circ}C$∼3$0^{\circ}C$ 온도 조건 하에서, pH 5.4, NaCl 0.2%, aw 0.99의 조건을 적용하였다. 추정된 최대섭취유효시간은 일반적인 성인이 김밥 1인분(171g)을 섭취하는 것을 기준으로 하였을 때 구입 이후 28∼3$0^{\circ}C$에서 방치할 경우 분식점은 3.9∼4.5시간, 백화점은 6.7∼7.9시간, 편의점은 7.4∼8.7시간이었다. 또한 구매한 김밥이 황색포도상구균에 기인한 식중독으로부터 안전할 최대섭취 유효시간은 99%안전 확률에서 여름철 분식점 자료를 근거하여 3$0^{\circ}C$에서 1.9시간이었으며 15$^{\circ}C$인 경우는 17.7시간이었다.
급식규모와 운영형태가 유사한 3곳의 급식소를 대상으로 원재료, 조리기구 및 조리종사원 손과 최종조리음식간의 미생물 오염실태를 분석한 결과는 다음과 같다. A 급식소에서는 닭볶음탕, 잡채, 비빔밥, 콩나물무침에서 황색포도상구균이 검출되었다. 닭볶음탕은 조리종사원의 손, 재료를 손질한 도마, 양파에서 황색포도상구균이 검출되었으므로 조리종사원의 손이나 도마를 통한 교차오염이 발생한 것으로 판단된다. 잡채는 조리종사원의 손, 당면을 삶아 건진 바구니, 양파와 양파를 손질한 도마에서 모두 황색포도상구균이 검출되었으므로 이들 간의 교차오염이 발생했을 것으로 생각된다. 비빔밥과 콩나물무침은 해당일 조리를 담당한 종사원의 손에서 황색포도상구균이 검출되었으므로 조리종사원 손에 의한 오염이 발생한 것으로 판단된다. B 급식소의 쥐어채조림은 원재료의 황색포도상구균이 조리과정에서 그대로 전이되어 조림 후에도 검출되었다. C급식소의 오징어채무침에서는 대장균이 검출되었다. 오징어채무침은 가열조리공정을 거치지 않는 메뉴로서 원재료인 오징어채에서 검출되었던 대장균이 그대로 최종조리 후까지 전이된 것으로 판단된다. 급식소 최종음식의 안전성 확보를 위해서는 위생적인 원재료의 구매와 사용, 조리종사원 개인위생의 개선, 조리기기의 철저한 세척 및 소독관리가 선행되어야 할 것으로 사료된다.
우리나라의 세균성 식중독의 주된 원인은 식중독성 황색포도상구균에 의한다. 따라서 식품공전에는 도시락, 빵, 떡으로부터는 이 미생물이 검출되지 않도록 규정되어있다. 현행의 황백포도상구균의 검사 방법은 적어도 5일 이상을 요하므로 이 식중독에 대한 대처가 미흡한 설정이다. 이 연구에서는 식중독성 황색포도상구균의 검출법을 중합효소 연쇄반응을 이용하여 개선하였다. 이 반응을 위해 황색포도상구균의 장도속도를 암호하는 유전자를 유형별로 증폭할 수 있는 시발물질들을 고안하였다. 한 황색포도상구균으로부터 중합효소 연쇄반응에 적합한 DNA를 신속하게 추출하는 방법을 개발하였다. 중합효소 반응조건은 다음과 같다. 반응액의 총부피, $(50\;{\mu}l)$; 표적 DNA, $2\;{\mu}l$ (약 20ng); 10배 진한 반응완충액, $5\;{\mu}l$; 시발물질, 100pmole; dNTP (10 mM), $4\;{\mu}l$; Taq DNA 중합효소, 205단위, 작동조건은 변성전, $94^{\circ}C$-5분; 변성, $94^{\circ}C$ 15초; 냉각, $50^{\circ}C$15초; 연장, $72^{\circ}C$ 20초; 연장후, $72^{\circ}C$-5분이었으며 변성-냉각-연장을 30회 되풀이하였다. dlj한 검출조건으로 황색포도상구균을 5시간 이내에 독소 유형별로 확인할 수 있었으며 이를 시판되는 떡과 빵에 적용하여 이 미생물의 존재를 확인하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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