일산화탄소를 이용하여 자가영양적으로 성장한 Acinetobacter sp. 1 의 세포추출액은 혐 기성 실험조건하에서 thionin, methylene blue, 2,6-dichlorophenol-indophenol둥올 일산화탄소의 산회를 위한 전자수용체로 사용할 수 있었으나 NAD, NADP, FAD, 또는 FMN등은 천자수용체로 이용하지 못하였다. 이 세균에 존재하는 일산화탄소 산화효소는 유도효소로 밝혀졌고, pH 7.5와 $60^{\circ}C$에서 최대의 활성을 나타내었다. 이 효소의 활성화에너지는 6.1kcal/mol (25.5 kJ/mol)이며 일산화탄소에 대한 Km값은 $154{\mu}M$로 밝혀졌다. 그리고 잘 알려진 몇가지 금속 chelat tIng agent와 2가의 양이온들은 이 효소의 활성에 거의 영향을 미치지 않았는데 $Cu^{2+}$ 이온만은 이 효소의 활성을 완전히 억제시켰다. 또한 이 효소는 포도당과 숙신산에 의해 활성이 저해되었으며, hydrogenase의 활성도 나타내었다. 그리고 Acinetobacter sp. 1의 일산화탄소 산화효소는 Pseudomonas carboxydohydrogena의 일산화탄소 산화효소와 연역학적인 연관성이 없는 것으로 나타났다.
페롭스카이트형 산화물을 능금산법으로 합성하여 TG/DTA, XRD, XPS, TEM 및 $H_2$-TPR 등에 의해 특성분석을 하였고, 벤젠의 연소반응에서의 활성을 조사하였다. 대부분의 촉매들은 페롭스카이트 결정구조를 잘 가지고 있었으며 15에서 70 nm의 크기를 나타내었다. $LaMnO_3$ 촉매가 가장 높은 활성을 보여주었고 $350^{\circ}C$에서 거의 100%의 전환율을 나타내었다. 반응활성을 증가시키기 위해 페롭스카이트 산화물의 A-와 B-위치에 다른 금속이온의 치환을 행하였다. $LaMnO_3$ 촉매의 A-위치에 Sr을 일부분 치환시키면 벤젠의 전환율이 증가하였다. 또한, B-위치에 Co 및 Cu 이온의 치환 역시 촉매 활성을 증가시켰고, $LaMn_{1-x}B_xO_3$ (B = Co, Fe, Cu)형 페롭스카이트에서 촉매활성은 Co > Cu > Fe의 순서로 감소하였다.
전통 메주로부터 plasmin의 혈전용해 활성보다 약 58% 더 높은 활성을 나타내는 MJ-226을 분리하여 동정한 결과, Bacillus subtilis와 유사한 형태학적, 생화학적 및 당 발효능을 나타내었다. B. subtilis MJ-226은 Tryptic Soy Broth (TSB) 배지 상에서 최대의 혈전용해효소 활성을 나타내었고, $37^{\circ}C$에서 24~26시간 배양했을 때 가장 높은 활성을 나타내었고, TSB 배지 내에 glucose와 fructose 2.0%와 peptone 및 yeast extract 1.0% 각각을 첨가한 경우 활성이 증가되었다. 하지만 lactose, sucrose, beef extract, casein 및 tryptophan 등에 의해선 활성이 오히려 감소되었다. B. subtilis MJ-226이 생산하는 혈전용해효소는 pH 6.0~8.0 및 온도 $35\sim40^{\circ}C$에서 매우 안정하였으며, 또한 $MnSO_4$, $CaCl_2$, KCl 및 NaCl 5 mM 농도의 금속이온에 대해서도 비교적 안정함을 유지하였다. 그러나 $CuSO_4$, $MgSO_4$, $ZnSO_4$, $FeSO_4$와 $BaCl_2$에 등의 금속이온과 iodoacetic acid, leupeptin, phenylmethanesulphonyl fluoride (PMSF), sodium dodecyl sulfate (SDS), thiourea, trans-1,2-diaminocyclohexane-N,N,N',N'- tetraacetic acid (CDTA) 및 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 등의 저해제들과 반응한 경우에는 매우 불안정한 것으로 나타났다.
생체내에 존재하는 효소 등의 단백질은 그 골격을 이루는 아미노산 이외에 다양한 형태로 금속 원소들과 킬레이션을 이루고, 고유한 생리활성을 나타낸다. 단백질과 금속과의 킬레이션을 체계적으로 연구하기 위하여 가수분해하여 얻은 펩타이드와 Zn(II) 이온을 반응시키고, MALDI-TOF 질량분석기로 킬레이트 반응전 후의 펩타이드의 분자량을 측정하여 킬레이트 반응 생성물을 확인하는 분석법을 개발하고자 한다.
예비농축 및 분리를 위한 온라인 시스템을 소개하였다. 이 방법은 활성탄소에 흡착된 메틸티몰 블루로 납(II)의 착체형성을 기저로 한다. 간섭이온의 효과는 물론 수용액상의 산성도, 고상의 용량, 흐름변수와 같은 희석용액으로부터 납(II)의 정량회수와 고상 시약의 준비 상태에 대해 연구되었다. 예비농축 후에 금속이온은 0.5M HNO3 용액의 5 ml에 자동적으로 용출되고 납이온의 양은 불꽃원자 흡수 분광법로 측정하였다. 최적조건하에서, 수용액시료의 납이온은 컬럼에 의해 약 1000배 분리 및 농축되었다. 검출한계는 0.001mg mL-1였다. 납은 강과 수돗물시료에서 98에서 102% 회수율을 보였다.
능이버섯 〔Sarcodon aspratus(Berk.) S.Ito〕으로부터 단백질 가수분해 효소를 추출하여 75%(NH$_4$)$_2$SO$_4$ 염석과 DE52 anion exchange column chromatography 와 sepharyl-S 200 column 및 Mono s column chromatography 에 의해 정제하였는데 조 효소의 특이 활성은 55.2U/mg protein으로 조효소액에 비하여 11.26배 증가하였고 수율은 49.5%로 나타났다. 정제된 효소는 전기영동을 행한 결과 단일 band를 나타내었으며 분자량은 29,300으로 추정되었다. pH의 안정성은 4$^{\circ}C$에서 48시간 보존하였을 때 pH 8.5에서 가장 안정하였고, pH 5.5~10.5까지 높은 활성을 유지하였다. 온도에 대한 안정성은 30분간 보존 한 후 활성을 검토한 결과 단백분해능은 5$0^{\circ}C$까지 비교적 처음활성을 유지하다가 6$0^{\circ}C$에서는 53%정도의 활성이 유지되었으나 그 이상의 온도에서는 급격히 실화하여 7$0^{\circ}C$에서는 완전히 실화하였다. 금속 이온에 의해서는 크게 저해를 받지 않았으나 PMSF 저해제에 대하여 저해되어 본 효소가 serine protease임을 시사하였다.
산소라디칼-질병모델을 보다 간편한 방법으로 만들어 생화학적 발병 기전을 추구하므로서 신약창출에 필요한 기초자료를 제시하고자 본 실험을 실시하였다. 미세혈관의 혈류이상은 과잉의 활성산소를 생산하게되며 이로 인해 여러 종류의 난치성 질환 및 염증을 수반하는 많은 질병이 발병하게 된다. 일반적으로 흔히 이용되어지는 허혈-재관류모델이 아닌 환경독성물질을 활용한 병태모델을 만들어 이 모델조건에서 활성산소생성과 밀접한 관계를 갖는 잔틴 옥시데이즈(Xanthine Oxidase)의 변화와 과산화지질생성정도를 연관지어 검토하였다. 수은, 구리, 몰리브덴등의 금속이온들은 잔틴 디하이드로저네이즈(Xanthine dehydrogenase)로 부터 옥시데이즈(Oxidase)형으로의 전환을 촉진시켰으며 막독성의 지표로 이용되어지는 과산화지질의 생성도 현저히 증가시켰다. 또한 알데하이드류의 첨가실험에서도 잔틴산화효소의 형전환이 촉진되었으며 첨가한 알데하이드의 탄소수와 수소수 그리고 탄소와 탄소의 결합상태와도 밀접한 관계가 있음이 관찰되었다.
이전의 연구에서 토양으로부터 많은 양의 세포외 단백질분해 효소를 생산하는 신종 중온세균 Chryseobacterium sp. JK1를 분리하였다. 이 균주가 생산하는 단백질 분해효소의 특성조사 결과 최적반응온도와 pH는 각각 $40^{\circ}C$와 7.0이였으며, 좁은 최적온도 구간과 비교적 넓은 pH 구간인 pH 6.0-9.0에서 높은 활성을 보여주었다. 그리고 단백질 분해효소는 EDTA 또는 EGTA, PMSF와 금속이온 $Ag^+$ 또는 $Cu^{2+}$의 첨가에 의해 강하게 저해 되었으며, $Al^{3+}$의 첨가에 의해 약하게 저해되었다. Pepstatin과 금 속이온 $K^+$, $Ca^{2+}$, $Na^+$, $Fe^{2+}$ 또는 $Mg^{2+}$의 첨가는 저해에 큰 영향을 주지 않았다. 이와 반대로 단백질분해효소는 이가 금속이온인 $Mn^{2+}$ (5 mM)의 첨가에 의해 효소활성이 향상되었다. 농축된 배양 상등액의 활성염색 분석으로 67과 145 kDa 크기의 주요 밴드 두 개가 관찰되었다. 이러한 결과들로 Chryseobacterium sp. JK1 균주가 식품산업에 응용 가능한 세포외 중성의 serine 단백질 분해효소를 생산한다는 것을 알 수 있었다.
Pseudomonas tolaasii에 의해 분비되는 톨라신은 펩티드 독소로서, 버섯 자실체 구조와 세포를 파괴하여 갈반병을 일으킨다. 톨라신의 독성은 용혈활성을 측정함으로서 평가하며, 이는 톨라신 분자가 적혈구 막에 pore를 형성하여 세포 구조를 파괴하기 때문이다. 이전 연구에서, $Zn^{2+}$ 뿐만 아니라 $Ni^{2+}$이 톨라신의 세포독성에 억제효과를 가짐을 확인하였다. $Ni^{2+}$은 농도가 증가함에 따라 톨라신에 의한 용혈작용을 저해하였으며, 이의 $K_i$ 값은 1.8 mM이었다. 용혈활성은 10 mM 이상의 농도에서 완전히 저해되었다. $Ni^{2+}$의 효과는 pH에 따라 크게 변하지 않았으나, $Zn^{2+}$의 톨라신 세포독성 억제 효과는 염기성 pH에서 크게 증가하였다. 완충액의 pH를 7에서 9로 증가시키면, 50% 용혈작용이 일어나는 시간인 $T_{50}$은 1 mM $Ni^{2+}$에 의해 조금 증가하였으나 $100{\mu}M$$Zn^{2+}$에서는 크게 증가하였다. $Zn^{2+}$와 $Ni^{2+}$을 반응용액에 동시에 처리하였을 때, 두 양이온의 상승효과는 모든 pH에서 나타났다. 서로 다른 pH 의존성을 보이는 두 금속이온의 분자적 설명은 톨라신의 pore 형성과 세포 독성에 관한 기작의 이해에 기여할 것이다.
해양세균 Pseudoalteromonas psicida TA20의 ethanol 색소 추출물에 대한 안정성과 기능성을 검토한 결과, 본 해양세균 색소는 pH 4.0에서 pH 8.0의 조건과 $40^{\circ}C$ 이하에서 매우 안정하였으며, $25^{\circ}C$ 14일간 90% 이상의 잔존율을 나타내어 빛에 대한 안정성이 매우 우수한 것으로 나타났다. 금속이온의 경우 $Al^{3+}$과 $Cu^{2+}$를 제외한 실험된 모든 금속이온에 대하여 매우 안정하였으며 특히, 다른 색소추출물들에 비해 $Fe^{2+}$에 대한 안정성이 높은 것으로 나타났다. 해양세균 색소추출물에 대한 생리활성 실험 결과, free radical 소거 활성 (3495 ${\mu}g/ml$)이 나타났으며, 색소농도 10 ${\mu}g/ml$일 때 44%의 인체세포 DNA 손상 회복능이 있음을 보여 항산화능이 우수함을 알 수 있었다. 또한 주요 식품유해세균에 대하여 항균활성을 나타내었다. 따라서 본 해양세균 색소는 항산화능과 항균활성을 갖는 식품 색소로의 적용을 검토할 수 있을 것으로 기대된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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