• 제목/요약/키워드: 형질전환 동물

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CHEMOPREVENTION OF COLON CANCER BY THE KOREAN FOOD STUFFS COMPONENTS

  • Kim, Dae-Joong;Shin, Dong-Hwan;Ahn, Byeong-Woo;Jang, Dong-Deuk;Hiroyuki Tsuda;Shoji Fukushima
    • 한국독성학회:학술대회논문집
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    • 한국독성학회 2002년도 국제심포지움
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    • pp.106.2-132
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    • 2002
  • 형질전환 (유전자 결핍; Knockout) Min 마우스를 이용하여 대장암 발생에서 배추, 양배추 주성분인 indole-3-carbinol (I3C)의 대장암 예방효과를 규명하고자 하였다. 실험동물로는 C57BL/6J-Apc$^{min/+}$(Min 마우스)계의 5내지 6주령의 수컷 이형접합체 형질전환 마우스 70마리와 C57BL/6J계의 동일 산자, 동일 주령의 수컷 wildtype 비형질전환 마우스 10kfl를 The Jackson Laboratory 사 (Bar harber, ME, USA)로부터 직접 구입하였다. C57BL/6J-Apc$^{min/+}$계 수컷 이형접합체 형질전환 (Min)마우스 70마리를 각 군 20내지 25마리씩 세군으로 나누었다. Group 1에는 20마리, Group 2에는 25마리, Group 3에는 25마리를 배치하고, I3C 투여 실험군 (Group 1과 2)에는 실험시작시에 AIN-76A 분말사료에 I3C가 각각 100 및 300ppm이 함유되도록 조제하여 공급하였다. 그리고 실험군(Group 3)에는 실험시작부터 종료시까지 AIN-76A 정제고형사료(Teklad사, WI, USA)를 자유로이 급이하였다. 각군간의 체중, 사료 및 음수소비량을 매 2주마다 측정하였고, 10주간 (16주령)의 실험종료시에는 최종체중과 간장, 신장, 비장 등의 장기무게를 측정하여 상대장기 무게비를 산출하였다. 대조군으로서 C57BL/6J계의 동일 산자, 동일 주령의 수컷 wildtype 비형질전환 마우스 10마리는 같은 조건의 사육실에서 AIN-76A 정제고형사료를 33주간 자유로이 급이하였다. 실험동물은 부검전에 하룻밤 동안 절식하고 이산화탄소 흡입 마취하에서 흉대동맥을 절단하여 방혈하고 각 장기(심장, 폐, 위)를 적출하여 생리심염수에 넣어 장기무게를 측정하고 포르말린에 고정하였다. 소장과 대장의 검사를 위하여 위의 식도부위와 직장을 실로 결찰하여 적출하고 생리심염수를 주입하여 팽창시켜, 십이지장, 공장, 및 회장, 그리고 대장으로 나누어 여과지에 펼친 후 포르말린에 고정하였다. 소장과 대장은 육안 및 자동 영상분석길ㄹ 이용한 분석이 끝난 후에 각 부위별로 4-6개의 절편을 작제하여 포르말린에 재고정하고, 통상적인 조직처리과정, 파리핀 포매 및 3-4$\mu$m 두께의 조직절편을 제작하여 H&E 염색을 실시하여 현미경으로 검경하였다. 약 1주일간의 포르말린 고정이 끝난 소장 및 대장을 부위별, 별 종양개수 및 분포를 자동영상분석기(Kontron Co. Ltd., Germany)로 분석하였다. 체의 변화, 장기무게, 사료소비량 및 마리당 종양의 개수에 대한 통계학적 유의성 검증을 위하여 Duncan's t-test로 통계처리 하였고, 종양 발생빈도에 대하여는 Likelihood ration Chi-square test로 유의성을 검증하였다. C57BL/6J-Apc$^{min/+}$계 수컷 이형접합체 형질전환 마우스에 AIN-76A 정제사료만을 투여한 대조군의 대장선종의 발생률은 84%(Group 3; 21/25례)로써 I3C 100ppm 및 300ppm을 투여한 경우에 있어서는 각군 모두 60%(Group 1; 12/20 례, Group 2; 15/25 례)로 감소하는 경향을 나타내었다. 대장선종의 마리당 발생개수에 있어서는 C57BL/6J-Apc$^{min/+}$계 수컷 이형접합체 형질전환 마우스에 AIN-76A 정제사료만을 투여한 대조군은 1.40$\pm$0.24(100%)에 비하여 I3C 저농도 투여 실험군(Group 1; 0.85$\pm$0.23; 61%, P<0.01), 그리고 I3C 고농도 투여 실험군(Group 2 ; 1.32$\pm$0.29 ; 94%)의 순으로 감소하였다. 선종의 크기별 종양의 발생개수의 분포에 있어서 I3C 저농도 투여 실험군에 있어서는 선종의 크기가 3mm이하의 수가 현저하게 감소하였다. C57BL/6J-Apc$^{min/+}$계 수컷 이형접합체 형질전환 마우스에 AIN-76A 정제사료만을 투여한 대조군의 부위별 소장선종의 발생수는 십이지장부위를 제외하고 각 군에서 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 십이지장 종양의 발생개수에서만 I3C 저농도 투여 실험군(Group 1 ; 3.11$\pm$0.85)이 대조군 (Group 3: 1.48$\pm$0.35) 및 I3C 고농도 투여 실험군(Group 2: 1.56$\pm$0.47)에 비하여 유의성 있게 증가하였다. (P<0.05). 따라서 I3C은 소장에서는 암예방 효과가 뚜렷하지 않으나, 대장에 대한 암에방 효과가 있을 것으로 생각된다. 소장 및 대장을 제외한 간장, 신장, 비장, 심장, 폐 그리고 위 등의 기타 장기에서의 조직병리학적 변화는 관찰되지 않았다. 소장 및 대장의 종양은 선종(polyps)으로 관찰되었다. 지난 10여년간 형질전환 및 유전자 결핍 실험동물의 종류가 기하 급수적으로 증가하여 이용되고 있다. 가족성 대장 선종성 용종증(FAP)의 대표적인 모델로 이용되고 있는 C57BL/6J-Apc$^{min/+}$계 수컷 이형접합체 형질전환 마우스를 사용하여 배추나 양배추의 주요성분인 Indole-3-carbinol(I3C)의 대장암 예방효과가 있는지를 검색하여 본 결과 AIN-76A정제사료만을 투여한 대조군의 대장선종의 발생률 84%에 비하여 I3C 100 및 300ppm을 투여한 실험군에 있어서 각군 모두 60%로서 감소하는 경향을 나타내었으며, 대장선종의 마리당 발생개수에 있어서는 대조군의 1.40$\pm$1.041를 100%로 환산하였을 경우 I3C 저농도 및 고농도 투여 실험군에서는 각각 약 61%와 94%를 나타내여 감소하였다. 특히 대장선종의 크기별 분포에 있어서 선종의 크기가 3mm이하의 수가 현저하게 감소하였다. 따라서 저농도 I3C의 투여는 실험적 유전성 가족성 대장 선종성 용종증 모델에 있어서 어느정도 암 예방효과가 있는 것으로 생각된다. 그러나 소장 선종의 발생에는 별 영향이 없는 것으로 생각된다. 그러나 본 실험에 사용된 C57BL/6J-Apc$^{min/+}$계 수컷 이형접합체 형질전환 마우스는 실험개시 시점이 7내지 8주령이 경과하여 이미 태생기부터 소장 및 대장의 선종 발생이 진행되어 온 것을 감안하고 특히 비스테로이드계 항염증 소염제(NSAIDS)와 같은 강력한 COX-2억제제가 아님을 고려하면, 상당한 선종의 발생을 억제할 수 있는 가능성이 매우 높다고 생각한다. 또한 이제까지 배추나 양배추 성분의 복합성분들에 대한 실험적 대장암 모델에서의 촉진효과 등에 대한 보고들이 있어 온 점을 고려할 때 위암(Kim 등, 1994) 간암(Kim 등, 1994), 유방암(Grubbs, 등, 1995; Bradlow 등, 1995)에 대한 예방효과가 있을 것으로 생각된다. 앞으로 이러한 종양조직내에서의 COX-2 및 iNOS mRNA와 단백질의 발현정도를 분자병리학적으로 연구중에 있으며, 향후 십자화과식물 성분인 indole-3-carbinol이 마우스뿐 만 아니라 랫드의 화학발암물질에 의한 대장종양에 대한 억제효과 있는지 연구 필요가 있다. Min 마우스와 같은 형질 전환(유전자결핍;knockout) 실험동물을 이용한 새로운 중기 발암성 시험범의 확립을 통한 각종 환경 유해물질의 발암성 유무 및 COX-2 억제작용이 있는 식품인자의 암예방 후보물질을 체계적으로 검색하는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 생각한다.

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형질전환 체세포로부터 소 복제수정란의 효율적인 생산 (Efficient Production of Cloned Bovine Embryos from Transformed Somatic Cells)

  • Wee G.;B. H Sohn;Park, J. S.;D. B. Koo;Lee, K. K.;Y. M. Han
    • 한국가축번식학회지
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    • 제27권1호
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    • pp.25-34
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    • 2003
  • 인체 트롬보포이에틴(hTPO)은 megakaryopoiesis 과정에 주요한 역할을 하는 사이토카인이다. 따라서 이러한 트롬보포이에틴을 유선조직에서 직접적으로 발현시키기 위하여 소 베타 카제인 프로모터, 인체 트롬보포이에틴 cDNA 및 네오유전자로 구성된 발현벡터를 구축하였다. 소 귀조직 세포로부터 유도된 섬유아세포에 lipoffctamine을 이용하여 발현벡터(pBT-L n대)의 삽입을 유도하였다. G4l8 저항성을 지닌 세포의 콜로니 형성을 유도하기 위하여 2주 이상 배양을 실시하였다. 형질전환 콜로니는 PCR에 의해 동정하였으며, 이들 콜로니를 핵치환 전까지 계속적으로 증식을 유도하였다. 형질전환 세포에 의해 재구성된 난자는 전기적인 융합과 calcium ionophore와 6-DMAP를 이용한 활성화를 실시하였으며, 체외에서 7일간 배양을 실시하였다. 총 35개의 콜로니를 PCR에 의해 분석한 결과, 이 중 29(82.9%)개가 형질전환된 콜로니였다. 형질전환된 세포로 재구성된 난자의 난할율 및 배반포로의 발달율은 65.1%와 23.8%로 나타났다. 형질전환된 세포로 재구성된 난자로부터 발달한 29개의 배반포 중 27개가 형질전환으로 확인되었다. 따라서 이러한 결과들은 형질전환 소 수정란을 형질전환된 세포를 이용한 체세포 복제 기법을 통해 효과적으로 생산할 수 있다는 것을 제시하고있다.

재래산양의 과배란처리에 의한 체내 및 체외성숙유래 난자의 회수시간에 따른 회수율

  • 박희성;김태숙;이윤희;정수영;박성빈;문태식;이명열;김충희
    • 한국동물번식학회:학술대회논문집
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    • 한국동물번식학회 2004년도 춘계학술발표대회
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    • pp.266-266
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    • 2004
  • 재래산양은 우리나라 고유의 재래가축이라는 특성과 산양육의 경우 건강보조식품으로서의 인식이 팽배해 왔기 때문에 그동안 체계적인 개량이 이루어지지 못하였다. 동물복제 또는 형질전환 등과 같은 첨단생명공학연구를 위해서는 무엇보다도 oocyte의 대량확보가 가능해야 한다. 본 연구는 재래산양에 있어서 과배란 처리에 의한 oocyte의 회수방법과 회수란의 질적 개선을 확립하기 위하여 과배란 처리 후 회수시간이 난포의 발달과 난자의 회수율에 미치는 영향을 조사하였다. (중략)

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생명공학 기술 적용을 위한 닭 수정란의 체외 배양법

  • 전익수;박진기;이연근;노환국;최철환;김학규;이지현;김선화;이필헌
    • 한국동물번식학회:학술대회논문집
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    • 한국동물번식학회 2002년도 춘계학술발표대회 발표논문초록집
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    • pp.45-45
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    • 2002
  • 닭 수정란을 이용한 생명공학 기술은 일반적인 포유류 가축의 수정란에 적용되고 있는 기술과 비교 해 볼 때, 기본적인 배 발생 단계에서부터 개체 탄생에 이르기까지 상당 부분에 걸쳐 상이한 점이 많다. 왜냐하면, 조류는 발생학적 특성상 수정과 초기 배 발생을 제외한 거의 대부분의 개체 발생 과정이 난각 속에서 진행되기 때문이다. 또한, 포유류는 새끼를 낳는 반면, 조류는 몸밖에 알을 낳아 적당한 습도와 온도에서 일정기간 품은 다음 병아리를 부화시키는 동물이다. (중략)

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Electroporation 방법을 이용한 포유동물 세포내 GFP 유전자 도입

  • 양병철;성환후;김동훈;이상기;오현주;임석기;박수봉;이은주;민관식
    • 한국수정란이식학회:학술대회논문집
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    • 한국수정란이식학회 2002년도 국제심포지엄
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    • pp.70-70
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    • 2002
  • 형질전환 가축을 생산하기 위하여 최근 체세포 복제 기법을 이용하고 있다. 이러한 체세포를 이용한 형질전환 동물의 생산에는 체세포내에 유전자의 도입 효율이 직접적인 영향을 주게 된다. 따라서 본 연구는 세포내 유전자의 transfection 효율을 높이고자 한우의 체세포를 이용하여 여러 가지 조건에서 유전자 도입을 실시하였다. 세포내 유전자 도입 방법은 electroporation (EP) 방법을 이용하였다. 사용한 세포는 소의 귀세포(KbESF), 태아섬유아세포 (KbFF), 그리고 대조구로서 CHO cell을 이용하여 GFP 유전자를 도입하였다. EP는 0.4 cm cuvette을 사용하였고, voltage는 0.25 kV, 그리고 field strength 는 0.625 kV/cm 조건으로 실시하였으며, pulse times은 각각 1, 2, 또는 3회를 사용하였다. KbFF와 KbESF에서는 각각 pulse times을 증가시킬수록 유전자도입 세포수가 증가하였으나 (KbFF: 81, 634, 1,065 cells/$10^{6}$ cells, KbESF: 1,011, 5,567, 15,408 cells/$10^{6}$ cells), CHO cell에서는 pulse times을 증가시킬 수록 오히려 유전자도입 세포수가 감소하였다 (CHO: 1,591, 687, 297 cells/$10^{6}$ cells). 그리고 2주 동안 neo selection을 실시 한 결과 KbFF, KbESF, CHO에서 각각 93, 35, 184 colony가 선발되었으며, 이 중 65.6%, 8.6%, 4.3% 가 GFP 형광 발현 colony로 나타났다. 한편 CHO cell에서 transfection cell수가 감소된 것은 EP의 자극으로 인해 손상된 세포가 많이 발생한 것으로 나타났다. 또한 neo selection에서 선발된 colony중 GFP가 발현되지 않거나 일부만 발현되는 colony들이 많이 발생하였는데, 이것은 세포내 유전자가 transfection되지 않은 세포도 neo selection에서 선발된다는 것을 제시하고 있다. 따라서 체세포를 이용한 형질전환동물 생산을 위해서는 세포내 유전자 도입과 선발 과정에서 나타난 colony에 대하여 보다 엄격한 screen을 하는 것이 필요한 것으로 생각된다.

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해양동물의 세포유전과 분화연구 (A Study on the Cytogenetics and Differentiation of Marine Animals)

  • 손진기
    • 한국발생생물학회지:발생과생식
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    • 제6권2호
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    • pp.71-76
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    • 2002
  • 최첨단 연구로 성장하고 있는 해양생물공학 연구 중 염색체공학 연구의 배수체 조작, 성분화, 자성 발생, 형질전환 어류와 유전자 조작에 관한 최근의 연구 동향을 분석하고 향후 발전 방향에 관하여 살펴보았다. 배수체 연구 중 3배체 어류 생산 연구는 20여종의 어류들 중 무지개 송어와 메기가 물리적 충격을 이용한 실험법으로 산업적으로 이용 가능한 수준에 있다. 성분화를 포함한 약 15종의 고급 어종이 방사선 투사법에 의해 자성 발생 2배체를 생산 유도하였다. 형질전환 어류는 1985년 이래 약 40여종의 어류가 외래 유전자를 미세 조작이나 전기충격법에 의해 형질전환되고 있다. 최근에 역바이러스성 벡터들에 의한 외래 유전자를 이용한 형질전환 어류가 생산되었으며 이러한 형질전환 어류는 기초과학 육성은 물론 해양생물공학 연구의 발전이 기대되고 있다.

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성장호르몬 방출인자를 발현하는 형질전환 생쥐에서 소변분석 (Urine Analysis in Transgenic Mice Expressing the Growth Hormone-releasing Factor)

  • Cho, Byung-Nam;Jung, Hoi-Kyung;Yoon, Yong-Dal;Mayo, Kelly-E
    • 한국발생생물학회지:발생과생식
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    • 제6권1호
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    • pp.31-35
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    • 2002
  • 생쥐에서 페르몬으로 알려진 소수성의 분자와 결합하는 major urinary proteins(MUPs)는 부분적으로 성장 호르몬(GH)의 조절을 받는다. 본 연구에서는 MT-GRF로 형질전환되어 성장호르몬이 증가된 생쥐에서 MUP의 발현을 조사하였다. 이 MT-GRF로 형질전환된 생쥐의 소변에서 MUP이 대조군보다 심하게 저하되어 나타났고, 암컷보다 수컷에서 더 저하되어 나타났다. 또한 MT-GRF를 근육에 주사한 생쥐에서도 MUP는 저하되어 나타났다. 부가하여, MT-GRF로 형질전환시킨 생쥐의 소변에서 전기영동상에서 albumin과 동일하게 이동하는 고분자의 단백질이 다량으로 관찰되었는데 신장의 사구체 여과가 손상되었음을 암시하고 있다. 이 혈장 단백질의 손실도 암컷보다 수컷에서 심하게 나타났다. 결과적으로 GRF의 과다생성은 성별에 차별화된 영향을 미치면서 GH로 형질전환된 동물모델에서 관찰되는 MUP의 발현과 사구체 기능의 변화를 동일하게 유발하고 있었다.

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뇌와 척수에서 Cocaine-Amphetamine Regulated Transcript를 과발현하는 형질전환 생쥐 (Transgenic Mice Overexpressing Cocaine-Amphetamine Regulated Transcript in the Brain and Spinal Cord)

  • 최시호;이정웅;박흠대;장정원;정길생;이훈택
    • 한국가축번식학회지
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    • 제25권4호
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    • pp.389-397
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    • 2001
  • CART는 leptin에 의해 조절되는 포식인자이며 섭식과 운동 습성에 관계된 것으로 알려져 있다. 사람의 CART Leu34Phe 돌연변이는 비만의 표현형을 나타내었지만, 생쥐의 CART 돌연변이는 일반사료의 섭취 후 급격한 체중증가를 나타내지는 않았다 생체 내 신경세포에서 CART의 역할을 확인하기 위한 새로운 형질전환 모델을 확립하고자 분화하는 신경세포의 유전자 발현을 조절하는 NF-L promoter와 CART의 재조합 발현 벡터를 구축하였다. 형질전환 생쥐는 유전자 미세 주입법에 의하여 생산되었으며, PCR과 Southern blot의 방법으로 확인하였다. 이러한 형질전환 생쥐에서 CART의 과 발현을 수정 후 13.5일째 초기 배아와 생후 6주째 형질전환 생쥐의 뇌와 척수에서 확인하였다. 본 연구의 결과는 섭식 관련 유전자들이 상호 연관된 섭식행동에서 CART의 역할을 연구하는데 모델 동물로써 이용할 수 있을 것으로 사료된다.

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외래 유전자와 공배양한 정자를 이용해 난자내 직접 주입술한 후 EGFP의 발현 (Positive Expression of EGFP Gene in Bovine Embryos after ICSI using Spermatozoa Co-cultured with Exogenous DNA)

  • 윤효진;이훈택;정길생
    • 한국가축번식학회지
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    • 제26권3호
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    • pp.205-214
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    • 2002
  • 현재까지 외래 유전자를 도입하여 형질전환 동물을 생산하는 방법이 다방면으로 연구되어 왔다. 그 중에서 본 연구에서는 정자를 EGFP 유전자와 공배양한 후 이를 난모 세포내에 미세 주입한 다음, 수정란의 발달과 ECFP 유전자의 발현을 조사하였다. 즉, 동결후 융해나 Triton X-100 처리 등으로 세포막을 파괴하여, 이들 정자를 EGFP 유전자와 다분간 공배양함으로써 정자와 EGFP 유전자와의 결합을 유도하였다. 정자나 정자두부의 미세주입에 의해 수정된 난자는 0.3%의 BSA가 첨가된 CR1aa 배양액에서 배양하였으며, EGFP 유전자의 발현은 형광현미경 하에서 관찰하였다. 통결 후 융해로 처리된 정자와 Triton X-100 처리 한 정자를 미세주입한 결과 난할율은 85.7과 80.1%였고, 배반포 발생율은 32.4 과 35.0%로서 유의차가 없었다. 동결 후 융해와 Triton X-100 으로 처리된 정자를 각각 미세주입한 수정란의 EGFP 유전자 발현율은 각각 19.1과 13.9%로서 전자가 유의하게 높았다. 또 정자 배양액에 첨가된 EGFP유전자의 농도가 54 ng/${\mu}\ell$일 때 EGFP 발현율은 15.4% 로서, 27 ng/${\mu}\ell$일 때의 9.0%와 63.5 ng/${\mu}\ell$일 때의 5.1% 보다 유의하게 높았다. 발현율을 높히기 위한 방법중 하나로써 electric shock의 방법을 이용해 보았으나 기존의 공배양 방법으로 얻은 최고 발현율인 19.1%에 못 미치는 2%를 보였다. EGFP 유전자가 발현된 수정란의 배반포 발생율은 0%로서 비발현 수정란의 29.5%보다 유의하게 낮았으며, EGFP 유전자의 발현은 mosaicism 형태를 보였다. 본 연구에서는 비록 낮은 외래 유전자 도입율을 보이기는 하나 (19.0%), 정자를 매개로 한 형질전환 동물의 생산은 그 방법이 간단하고 비용이 적게 든다는 장점이 있다. 기존 보고들의 효율성을 재고하여 볼 때, 난자내 정자 직접 주입술에 의한 형질전환 동물 생산의 연구는 향후 밝은 전망을 시사하고 있다.