밀 단백질에 효소가수분해 할 때 생산되는 peptide의 항균활성과 천연항균제로서의 이용가능성을 검토하기 위하여 실험을 행하였다. 밀 단백질에 7종의 단백질가수분해효소를 작용시켜 생성된 가수분해물의 항균활성을 측정하고 한외여과, membrane filtration, HPLC를 이용하여 항균성 peptide를 분리 정제한 후 분자량과 아미노산 결합순서를 측정한 결과는 다음과 같다. 밀 단백질에 7종의 단백질 분해효소를 적용시켜 제조한 가수분해물중 Asp. saito protease를 적용시켜 얻어진 peptide 만이 항균활성을 나타내었다. Asp. saito protease는 $37^{\circ}C$, pH 6.0에서 작용시킨 경우에 항균활성이 가장 높았으며, $50^{\circ}C$ 이상에서는 활성을 나타내지 않았다. 밀단백 효소가수분해물은 membrane filtration에 의하여 분자량 1,000~3,000 에서 항균활성이 나타났다. Membrane filtration으로 얻어진 항균활성분획을 HPLC로 분리한 결과 retention time 31.1~31.8 min에서 항균활성을 나타내었다. 밀단백 효소가수분해물은 $121^{\circ}C$에서 15분간 가열하여도 효소활성이 유지되는 매우 안정한 화합물이었다. 항균활성분획을 MALDI-mass로 질량을 분석한 결과 1,633이었다. 항균성 peptide의 아미노산 결합순서는 cysteine, glycine, prolin, prolin, prolin, valine, valine, alanine, alanine, arginine 의 순서였다.
41종의 약용식물을 열수추출하여 위궤양 원인균으로 보고된 Helicobacter pylori에 대해 항균활성을 탐색하였다. 2-fold dilution 방법에 의해서는 백련초, 어성초, 방기, 황련은 100 ppm이하, 백두옹, 연교, 종대황, 소엽은 200 ppm 이하, 사간, 우방자, 결명자, 귤피, 희침, 소목은 300 ppm 이하와 농도에서 H. pylori에 대해 항균활성을 나타냈다. 이중 3가지 추출물만이 disc 방법을 통해 항균활성이 재확인되었으며, 소목, 황련, 소엽의 순으로 강한 항균활성을 나타냈다. 항균활성이 확인된 3가지 추출물을 chloroform, ethyl acetate, butanol로 순차 분획하여 H. pylori에 대한 항균활성을 확인하였다. 소목의 경우는 ethyl acetate 분획물에서, 소엽의 경우는 butanol 분획물에서, 황련의 경우는 butanol과 chloroform 분획물에서 가장 강한 항균활성을 나타내었다. 추출물의 분획에 따른 항균활성의 상승효과는 모든 추출물에서 확인할 수 있었다. H. pylori의 crude-urease를 분리하여 urea R broth에서 흡광도와 pH를 조사한 결과, 반응 2시간 후 pH가 8.15까지, 560 nm에서의 흡광도는 1.7까지 증가하는 것으로 나타났다. H. pylori의 urease 활성은 소목, 소엽, 황련에 의해 80%이상 억제되었으며, 이중 소목은 urease 활성을 95%이상 억제시켰다.
본 연구는 그람 양성균과 음성균인 S. aureus와 S. Typhimurium를 대상으로 시트랄의 농도와 pH에 따른 항균활성 특성 및 식품 적용 가능성을 조사하였다. 농도별 항균활성은 TSB에 시트랄을 0-1,000 ppm 농도로 처리하였으며, pH는 buffer를 이용하여 pH 4.0에서 pH 7.0로 조정하여 측정하였다. 시트랄 농도 별 항균활성 실험에서는 두 균주 모두 시트랄 농도가 높아질수록 항균활성이 증가하였다. S. Typhimurium는 250 ppm 처리구에서 대조구와 유의적 차이가 없었으나 S. aureus는 약 3 log 수준으로 감소되었다. pH에 따른 항균활성은 10분이 경과 후 S. aureus는 약 1-2 log의 감소효과를, S. Typhimurium는 약 2-5 log의 감소효과를 나타내었다. TSB와는 다르게 buffer 조건에서 그람 양성 균주인 S. aureus는 S. Typhimurium와 비교하여 pH 조건에 안정적인 경향을 나타내었다. 녹즙에 적용한 시트랄은 그람 음성균인 S. Typhimurium에 대한 항균활성은 미미하였으나 양성균인 S. aureus 에 대하여 농도가 증가할수록 효과적으로 항균활성이 증가하였다.
돼지의 만성 호흡기 질환인 위축성 비염을 방제할 수 있는 생물공학적 방법을 개발하고자 먼저 자연계에서 돼지 위축성 비염의 원인균에 대한 항균활성이 강한 세균을 분리하여 동정하고 몇 가지 항균특성을 조사하였다. 자연계에서 항균성 물질 생산 균주로 분리한 1080주의 세균 가운데 돼지 위축성 비염의 원인균인 Bordetella bronchiseptica 와 Pasteurella multocida에 대하여 강한 항균활성을 갖는 Y-5 균주를 최종 선정한 후 동정한 결과 Bacillus sp. Y-5로 추정되었다. Y-5 균주를 pH 6.0으로 조절된 육즙배지에서 $30^{\circ}C$, 21시간 배양하였을 때 Bordetella bronchiseptica에 대하여 가장 높은 항균활성을 보였고, Y-5 균주를 $30^{\circ}C$, pH 6.5에서 18시간 배양 하였을 때 Pasteurella multocida에 대하여 가장 강한 항균활성을 보였다.
115 종의 생약재 중에서 식품부패성 및 병원성 미생물을 대상으로 항균활성을 나타내는 생약자원을 검색한 결과 식품부패성 세균 Bacillus subtilis에 강한 항균활성을 보인 것은 단삼, 관중, 가자, 독활, 파고지, 오미자이었으며, 식중독균인 효모 Candida albicans IFO6258에 대해서는 지모와 관중 두 생약재가, 식품부패성 효모 Schizosaccharomyces sp.에 대해서는 지모, 관중, 원지가 각각 강한 항균 활성을 보였다. Streptococcus mutans에 대해서는 관중, 단삼, 소목, 방기, 오미자, 오배자, 고삼, 목향이 강한 항균 활성을 보였다. 피부 각층 및 모발에 침입하여 피부병을 야기하는 백선균 Trichonphyton mentagrophytes에 대해서는 지모, 강황, 목향, 호장근, 지유, 황금, 가자들이 항균활성을 나타내었다 . 항균spectrum이 넓으면서 비교적 항균활성이 강한 관중, 단삼, 가자, 황금에 항균활성이 강한 생약자원인 가자, 계피, 방기, 황금등의 생약재를 각각 1 : 1로 혼합한 추출물에 대한 항균활성을 조사한 결과 모든 혼합 추출물에서 단독 추출물 보다 강한 항균활성을 나타내었다.
인삼 saponin과 항생 물질의 사용에 따른 in vivo에서 출현 가능한 영향을 in vitro에서 미생물을 대상으로 검토하였다. aminoglycoside 항생 물질인 streptomycin·sulfate, kanamycin·sulfate, gentamycin·sulfate 등은 인삼 saponin과의 상호 작용으로 그 항균 활성이 대체로 상승되었으며 Erwinia aroideae에 대해서만 그 항균활성이 항상 상승되지는 않는 경향을 나타내었다. benzene 유도체항생 물질인 chloramphenicol은 인삼 saponin과의 상호 작용으로 그 항균활성이 Salmonella typhi. Aerobacter aerogenes, Serratia속 세균등에서는 상승하였으나 Bacillus suhtilis, Bacillu, megaterium, Escherichia coli균에서는 활성이 감소되었고 그 밖의 세균에서는 항균활성에 변화를 나타내지 못하였다.
참치 백자의 항균제호서의 사용 가능성 검토를 위하여 참치 백자의 특성 및 항균력 실험을 하였다. 아미노산 분석결과 arginine 함량은 약 46%로 연어 백자로부터 추출한 standard protamine (SP, Asama 화성, Japan)에 비해 약 10%가 낮았으며, proline및 glycine등 아미노산 조성에서도 큰 차이가 있었다. 주된 단백질의 평균 분자량은 SP가 11,300 Da과 2,600 Da이었으며, TP는 13,400 Da이었다. 그리고 SP와 TP의 항균활성 비교 실험에서 TP는 SP보다 약한 것으로 나타났다. 항균활성을 높이기 위해 $37^{\circ}C$에서 효소처리한 pepsine hydrolyzed protamine (PHP)과 trypsine hydrolyzed protamine (THP)의 주된 단백질의 평균 분자량은 PHP의 경우 11,300 Da과 3,900 Da으로 확인되었고, THP의 분자량은 2,500 Da 이하로 나타났다. PHP의 항균활성을 확인한 결과 TP보다 높은 항균력을 보였으며, 주된 단백질의 평균 분자량이 비슷한 SP와 유사하게 항균활성이 향상됨을 알 수 있었다. 그러나 gram (+)균인 Stap. aureus, L. helveticus, L. plantarum 등에서는 PHP가 SP보다 강한 항균활성을 보여 주었다. 그리고 분자량이 2,500 Da 이하인 THP의 경우 항균활성이 없는 것으로 밝혀졌다. 이와같이 PHP의 항균활성이 향상된 것은 protamine의 arginine의 함량이 증가하지 않더라도 주된 단백질의 평균 분자량이 변화되었기 때문으로 생각된다. 따라서 참치 백자로부터 추출한 TP를 pepsin처리했을 때 SP와 유사한 수준으로 항균활성 향상되는 것을 확인하였다.
장내유해세균에 대한 세균성 장내질환치료와 관련된 한약재의 항균활성 검색을 통해 우수한 효과가 인정된 가자를 선정하고 혐기적 broth system에서 각 용매별 분획물의 6종의 장내유해세균에 대한 항균활성을 측정하였으며 그 항균물질을 column chromatography 법에 의해 부분 정제하였다. 가자 메탄올 추출물은 100-2,000g/ml 농도에서 시험균 Eubacterium limosum ATCC 10825, Escherichia coli ATCC 25922, Bacteroides fragilis KCTC 5013, Clostridium perfringens ATCC 3627, Staphylococcus aureus KFCC 11764 및 Salmonella typhimurium ATCC 14028 모두에 대해 항균활성을 보였으며 특히 2,000g/ml 농도에서는 Escherichia coli ATCC 25922 및 Staphylococcus aureus KFCC 11764을 제외하고는 거의 생육하지 못하였다. 각 분획물(n-hexane, ethylether, ethylacetate 및 water)들간의 항균활성은 Clostridium perfringens ATCC 3627을 제외하고는 유의적인 차이가 없었다. 가자의 ethylacetate 분획은 Sephadex G-200 column chromatography에 의한 30개 분획 중 12에서 21번까지의 분획에서 강한 항균활성을 나타내었으며 silica gel column chromatography에 의한 40개 분획 중에서는 22에서 34까지의 분획에서 항균활성을 보였다.
전통민속주 제조에 널리 사용되어온 국화꽃잎에서 에탄올 추출하여 식품부패에 관련된 미생물을 대상으로 항균활성을 검색하고 에탄올 추출물의 농도별 항균활성과 최저 생육저해 농도를 조사하였다. 국화 에탄올 추출물의 항균활성은 산국이 B. subtilis에 대해 항균활성이 높게 나타난 반면, 소국은 E.coli에 대한 항균활성이 산국보다 다소 높게 나타났다. 8종의 부패균에 대한 에탄올 추출물의 항균활성은 산국이 소국에 비하여 높게 나타났으며, 산국 에탄올추출물의 최소저해농도는 60-70${\mu}\ell$/ml로 나타났다. 산국 에탄올추출물은 그람양성세균에서 보다 그람음성세균에 대한 항균활성이 다소 높았으나, 100${\mu}\ell$ 농도에서는 그람음성 및 양성 세균 모두 생육이 크게 저해되었다. 따라서 전통민속주의 보존효과 측면에서 산국 에탄올추출물이 우수한 것으로 나타났다.
B. subtilis cx1이 생산하는 박테리오신(BSCX1)을 부분 정제하고 특성을 규명하였다. BSCX1은 pH 안정성 실험에서 pH 2.5~9.5 구간에서도 안정되게 항균활성을 유지하였다. 각종 효소에 대한 안정성 실험에서는 protease, trypsin, proteinase K, 그리고 carboxypeptidase로 처리하였을 때는 완전히 항균활성이 사라졌고, $\alpha$-amylase, lipase, aminopeptidase는 항균활성에 영향을 미치지 못하였다. 이상의 결과로 본 항균물질이 단백질계열의 물질이며 당이나 지질 결합은 항균활성에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 추정되었다. 그러나 열에는 불안정하여 $60^{\circ}C$이상에서는 15분 안에 완전히 그 항균활성을 상실하였으며 $50^{\circ}C$ 에서는 15분만에 역가의 50%가 실활 되었다. 이에 반하여 저온에서는 무척 안정하여 $-20^{\circ}C$와 $-70^{\circ}C$에서 수개월간 보관하여도 여전히 항균활성을 그대로 유지하였다. Tricin-SDS-PAGE를 통하여 BSCX1의 분자량은 약 9,500 dalton으로 확인되었ekl. BSCX1은 pH2.5에서 9.5에 이르는 넓은 pH 영역에서 그 활성을 유지하므로, 기존에 개발된 nisin이나 유산균 유래의 항균물질이 pH 안정성이 떨어진다는 단점을 보완할 수 있는 생물학적 식품보존제로서의 개발 가능성을 높이 시사하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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