일반적으로 척추동물 및 무척추동물들은 세균 및 기생충 등과 같은 외부물질의 침입으로부터 자신을 방어하기 위해 항균성 펩타이드를 생산하는 비특이적 면역체계를 가지고 있다고 알려져 있다. 최근까지 비특이적 면역기능을 수행하는 많은 항균성 펩타이드들이 포유류, 양서류 곤충, 및 식물 로부터 분리 정제되었고 구조 활성간의 연구가 활발히 진행되고 있으며 이러한 구조와 활성간의 연구는 거의 육상생물로부터 유래한 항균성 펩타이드에 한정되었고 해양생물, 특히 어류를 이용한 연구는 매우 미흡한 실정이다. (중략)
지금까지 많은 항균성 펩타이드가 포유류 (1), 양서류 (2), 곤충 (3) 및 식물 (4)로 부터 단리ㆍ정제되었고, 구조-활성간의 연구가 활발히 진행되고 있지만, 이러한 연구는 육상생물에 제한적으로 수행되어 겼으며 해양생물을 대상으로 한 연구는 극히 제한되어 있는 상태이다. 해양생물로부터 정제된 항균성 펩타이드로서는 Flounder skin 분비물에서 pleurocidin (5), Moses sole fish에서 pardaxins (6), Horseshoe crab에서 Tachyplesin I(7), Tunicates hemocytes에서 Clavanins (8), Mollusc에서 Mytilins (9) 등이 보고되고 있지만 불가사리를 이용한 항균성물질의 연구는 희박한 실정이다. (중략)
인돌리시딘(indolicidin)은 소의 호중구(bovine neutrophils)로 부터 분리된 13개의 아미노산 잔기로 이루어 지고, 트립토판(tryptophan)을 많이 함유한 항균 펩타이드(antimicrobial peptide)이다. 인돌리시딘은 강력한 항균활성과 더불어 mammalian cells에 대해 독성을 나타낸다. 본 연구에서는 인돌리시딘 보다 서열이 짧으며, 보다 증가된 원핵세포 선택성(박테리아세포에 대해 독성을 나타내지만 mammalian cells에 대해서는 독성을 나타내지 않음을 의미함)을 지닌 새로운 짧은 항균 펩타아드를 개발하기 위해, 몇 종의 인돌리시딘 유사체 펩타이드를 설계하고 합성하였다. 결과적으로, 인돌리시딘 보다 서열이 짧으며(10개의 아미노산 잔기로 이루어짐), 증가된 원핵세포선택성을 지닌 4종의 새로운 펩타이드(SI, SI-PA, SI-WF 및 SI-WL)를 개발하였다. 본 연구를 통하여 가장 높은 원핵세포선택성을 나타내는 인돌리시딘 유사체 펩타이드 SI의 항균활성에는 중앙부위에 위치하는 소수성 및 방향족 아미노산이 중요하며, 2군데의 프로린(proline) 잔기는 중요하지 않다는 것을 알았다. 인돌리시딘과 유사체 펩타이드에 대한 원핵세포 선택성은 SI>SI-PA>SI-WF>SI-WL>ID>SI-WA의 순서 이였다. 따라서, 본 연구에서 설계되고 합성한 4종의 인돌리시딘 유사체 펩타이드(SI, SI-PA, SI-WF 및 SI-WL)는 박테리아 감염의 치료제로서 개발될 수 있을 것이다.
얇은 유리판 위에서 자동적으로 정렬되는 인지질 분자의 정렬도에 대한 수분 및 항균성 펩타이드의 효과를 고체 핵자기 공명 분광법을 이용하여 조사하였다. 순수한 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphotidylcholine (POPC) 인지질 만을 유리판 위에서 정렬시킬 때에는 직접적인 물의 투입 없이 95% 상대 습도에서 수일간 수화시키는 것만으로 충분했다. 하지만, protegrin-1 (PG-1)과 같은 항균성 펩타이드가 혼합되어 있는 인지질의 경우에는 95%의 상대 습도에서 수일간 수화시키는 것과 약간의 물을 시료에 직접 투입하여 수화시키는 것이 크게 달라진다는 것을 확인하였다. 충분한 양의 물이 투입되었을 때, 지질 이중막 위에서 인지질 분자들의 표면 움직임이 매우 활발하였다. 순수한 POPC 분자들이 얇은 유리판 위에서 정렬되는 시간에 비해 항균성 펩타이드가 혼합되어 있는 경우에는 POPC 분자들이 평형상을 이루어질 때까지는 상당한 시간이 필요함을 확인하였다.
1-Palmitoyl-$d_{31}$-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (POPC_$d_{31}$)로 이루어진 지질 이중막에 항균성 펩타이드 magainin 2와 aurein 3.3이 작용했을 때 일어나는 상변화를 중수소 고체 핵자기 공명 스펙트럼을 관측하여 탐구하였다. 측정된 중수소 고체 핵자기 공명 스펙트럼의 선모양을 이론적 모델 구조를 통하여 모사함으로써, 펩타이드-지질 혼합상태의 기하학적 구조상수 및 동력학적 표면 확산 계수 등을 구하였다. 펩타이드의 혼합 이후 5일 이내의 짧은 작용시간에는 지질 이중막의 정렬이 파괴되는 현상이 나타났으나, 100일 이후에는 magainin 2에 의해서는 타원형 원환체 기공 (elliptic toroidal pore)이, aurein 3.3에 의해서는 6각형 단면 막대구조 상(hexagonal phase)이 관측되었다. 지질 이중막 표면의 전하밀도가 항균성 펩타이드의 작용에 미치는 효과를 보기 위해 산성 지질인 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylglycerol (POPG)를 함유한 POPC_$d_{31}$/POPG 지질 이중막에 대해서도 동일한 실험을 수행하였다. 동일한 ${\alpha}$-나선형 구조를 가지는 두 펩타이드가 두 종류의 지질 이중막에 작용하는 과정의 차이를 확인할 수 있었다.
얇은 유리판 위에 정렬된 지질 이중막에 작용하는 항균성 펩타이드 magainin 2의 작용활성을 고체 핵자기 공명 분광법을 이용하여 조사하였다. 수화에 따른 지질 이중막의 파괴정도를 파악하기 위해 두 가지 수화 상태에서 실험이 이루어졌다. 95%의 상대 습도에서 수화된 지질 이중막에서는 약 15% 정도의 지질 이중막이 파괴되었으며, 완전히 수화된 지질 이중막에서는 약 20% 정도의 지질 이중막이 파괴되었다. 두 가지 시료 제조방법에 따른 지질 이중막 파괴 정도의 비교를 통해, 항균성 펩타이드의 지질 이중막 결합과정이 지질 이중막 파괴에 중요한 변수임을 알 수 있었다.
가축에서 항생제의 남용은 항생제 내성균의 발생을 유도하므로 가축과 사람의 건강을 위협할 수 있다. 이에 따라 항생제를 대체할 수 있는 물질 중 하나로 항균펩타이드(antimicrobial peptides)가 연구되고 있다. 항균펩타이드는 12-50개의 아미노산으로 구성된 펩타이드로 숙주에 감염된 다양한 박테리아를 사멸시키고 면역작용을 조절하는 등 선천성 면역에 중요한 물질이다. 본 연구에서는 닭과 돼지의 NK-2를 조합하여 cpNK라는 chimeric 펩타이드를 합성하였으며 이것의 항균효과를 검증하였다. 그 결과, cpNK는 그람음성균인 E. coli와 Salmonella spp. 그리고 그람 양성균인 L. monocytogenes과 S. aureus를 사멸시켰으며, cpNK는 그람음성균에서 더 강력한 살균효과를 보였다. 특히, cpNK는 메티실린 내성 황색포도상구균 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)에 대해서도 항균효과를 보여주었다. 또한, 27aa인 cpNK의 크기를 줄인 21aa의 cpNK-a1과 13aa의 cpNK-a2를 합성하여 마찬가지로 항균효과를 측정한 결과, cpNK보다는 약한 항균효과를 보였지만 여러 병원균의 생존율을 감소시켰다. 따라서 본 연구를 통해 우수한 항균효과를 갖는 cpNK와 cpNK로부터 유도된 펩타이드들을 항생제 대체제로 사용할 수 있는 가능성을 확인할 수 있었다.
얇은 유리판 위에 인지질과 항균성 펩타이드 protegrin-1을 혼합한 용액을 도포시키고, 95% 상대습도 하에서 방치함으로써 형성된 지질-펩타이드 혼합체의 변화를 31P 고체 핵자기 공명분광법을 이용하여 조사하였다. 수화에 의한 변화와 공기 중에서 건조한 상태에서의 변화 그리고 반복적인 수화와 건조 과정에 의한 시료의 변화를 관찰하였다. 각 과정에서의 지질 이중막의 파괴 정도를 이론적 모사 과정을 통해 정량적으로 확인하였다. 지질-펩타이드 혼합체는 수화와 건조를 통해 가역적인 변화를 일으켰고, 반복과정에 의해 가장 안정한 평형 상태로 접근하고 있음을 확인하였다.
세크로핀(cecropin)은 곤충의 체액성 면역에 있어서 효과적인 방어인자로 작용하는 항균 펩타이드로 잘 알려져 있다. 본 연구에서는 면역 유도된 천잠, Antheraea yamamai 유충 혈림프로부터 세크로핀 항균 펩타이드 분리 및 정제를 실시하였다. 먼저 항균 펩타이드를 분리하기 위해서, 면역 유도된 유충 및 정상 유충으로부터 추출된 혈림프 단백질 시료에 대한 단백질 전기영동(SDS-PAGE)를 통하여 비교분석하였다. 정상누에 혈림프 시료에 비해 면역 유도된 혈림프 추출물에서만 특이적으로 발현되는 분자량 4,223.01 Da의 펩타이드 밴드를 검출하였다. 선발된 면역유도 특이적 발현 펩타이드의 특성 분석을 위해서 이온교환 크로마토그래피 및 gel permeation 크래마토그래피을 수행하여 특이적으로 발현되는 펩타이드를 성공적으로 순수 정제하였다. 정제된 펩타이드는 Edman degradation법으로 N말단 아미노산 서열을 결정하였고 다른 나비목곤충의 세크로핀과 매우 높은 상동성을 나타내어 세크로핀으로 동정하였다. 또한 정제된 천잠 세크로핀 항균 펩타이드는 그람음성세균, 그람양성세균 및 곰팡이에 대해 폭 넓은 항균 스펙트럼을 나타냈었다.
졸복(Takifugu pardalis)의 아가미로부터 항균성 펩타이드를 정제하였다. 졸복 아가미의 산 추출물은 Sep-Pak C18에 의해 부분적으로 정제되었으며, 60% 메탄올 분획(RM60)은 Bacillus subtilis KCTC 1021에 대해 높은 항균활성을 나타내었다. 이 RM60을 사용하여 이온교환을 포함한 5단계의 연속적인 HPLC로 정제하였다. 정제된 펩타이드의 분자량과 아미노산 서열분석은 MALDI-TOF MS와 에드만 분해법으로 분석하였다. 이 펩타이드의 분자량은 약 1171.6 Da이었으며, 분석된 이 물질의 부분적인 일차구조서열은 다음과 같다; STKEKAPRKQ. 이 물질과 기존에 알려진 항균성 펩타이드들과 유사성을 조사한 결과, 정제된 물질은 histone H3 계열의 N-말단 부분과 유사하였다. 이러한 결과로부터 정제된 펩타이드는 졸복에서 반응하는 선천성 방어 시스템에서 중요한 역할을 하고 있다고 여겨진다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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