• 한국미생물·생명공학회지
• /
• 제49권4호
• /
• pp.534-542
• /
• 2021

CRISPR/Cas를 이용한 유전체 편집과 유전자 발현 조절을 위한 기술에서 sgRNA는 표적서열을 인식하는 역할을 한다. gal 프로모터를 표적서열로 하여 유전체 편집에 필요한 sgRNA의 표적인식서열의 길이와 유전자 발현 조절에 필요한 sgRNA의 표적인식서열의 길이를 Cas9-NG에서 체계적으로 비교하였다. 유전체 편집의 경우, sgRNA의 표적인식서열을 구성하는 20개의 뉴클레오티드에서 3개의 뉴클레오티드의 결손만을 허용하였다. 하지만, 유전자 발현 조절에는 표적인식서열에서 11개의 뉴클레오티드가 결손되어도 표적서열을 인식하고 결합할 수 있다는 것을 밝혔다. 따라서, sgRNA의 표적인식서열에서 4개 이상의 뉴클레오티드의 결손이 있는 경우에 sgRNA/Cas9-NG는 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합을 하지만, 엔도뉴클레아제의 활성을 갖지 못하기 때문에 유전체 편집을 할 수 없는 것으로 판단된다. 이 결과는 인공전사인자 개발과 합성생물학 분야의 다양한 CRISPR 기술 발전에 도움을 줄 것이다.

• 생태와환경
• /
• 제56권1호
• /
• pp.1-13
• /
• 2023

북한강 수역에서 가장 많이 검출되는 Microcystin (MC)을 대상으로 하여 MC 생합성 유전자(mcyA gene), 남조류 세포밀도, MC 농도 사이의 관계를 분석하여 RNA-MC 환산식을 도출하고 남조류 세포 내 존재하는 MC 농도를 예측하였다. 북한강 수역에서 mcyA 유전자는 묵현천 합류 이후 북한강 하류 지점에서 주로 발견되었으며 평균적으로 다른 지점보다 높은 copy number가 발견되었다. 북한강 상류 의암호 수역의 경우, 공지천 지점에서 mcyA 유전자 copy number가 증가하였으며 9월 이후 북한강 수역 전체에서 mcyA 유전자 copy number는 감소하였다. mcyA gene expression은 상류와 하류 수역의 시·공간적 차이가 존재하였으며 여름철 짧은 시기에 집중적으로 발현하였다. mcyA gene expression 양은 MC 농도와 상관성이 매우 높을 뿐만 아니라 MC을 생합성하는 것으로 알려진 Microcystis aeruginosa와 Dolichospermum circinale의 세포밀도와도 통계적으로 유의한 상관성이 존재하였다. RNA-MC 관계를 기반으로 도출된 6개의 환산식은 통계적 유의성을 보이며(p<0.05) 0.9 이상의 높은 상관계수(r)를 나타냈다. eRNA에 존재하는 MC 생합성 유전자 발현량은 수중의 남조독소 물질 합성을 판단하고 유전자의 활성 정도를 빠르게 정량하여 MC 발생 조기경보에 충분히 활용할 수 있을 것으로 판단된다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
• /
• 제2권2호
• /
• pp.179-187
• /
• 1998

부화 및 착상에서 prostaglandins의 역할에 대한 연구는 많으나 배아단계에 따라 포배의 팽창과 부화에 미치는 영향에 대한 연구는 미미하다. 따라서 본 실험에서는 다양한 농도의 prostaglandins를 발생단계에 따라 처리하거나, indomethacin과 prostaglandins의 양 변화를 통해 팽창과 부화에 미치는 영향을 알아보고, 배아 단계별 PG $E_2$와 PG $F_2$$_{\alpha}$의 생합성양 변화양상을 알아보았다. 100$\mu$M이 상 농도의 PG $E_2$처리시 거의 모든 상실배가 퇴화하는 유해성을 보이나 PG $F_2$$_{\alpha}$에 있어서는 관찰되지 않았다. PG $E_2$나 PG $F_2$$_{\alpha}$ 모두에서 배아의 부화를 억제하지만 팽창포배로의 발생은 대조군과 유사하였다. hCG 주사 후 84시간과 96시간 단계 배아에 처리한 경우 부화율이 전반적으로 감소하는 경향을 보였으나 팽창포배로의 발생은 대조군과 유사하였고 PG $E_2$에 의한 세포독성은 발생단계가 높을수록 감소되었다. 한편 배아 단계와 관련없이 PG $F_2$$_{\alpha}$의 농도가 높아짐에 따라 부화가 억제되었다. Indomethacin과 PG $E_2$나 PG $F_2$$_{\alpha}$를 함유한 배양액에서 각 단계의 배아를 배양할 경우 prostaglandins를 단독으로 처리한 경우보다 부화율이 증가하였다. 한편 PG $E_2$의 경우 낮은 농도에서 부화율이 대조군 수준으로 증가하였다. 한편 PG $E_2$ 합성은 발생단계에 따라 급격히 증가한 반면 PG $F_2$$_{\alpha}$는 점진적인 증가를 보였다. 이상의 결과에서 PG $E_2$에 의한 세포독성은 배아 단계가 높아질수록 감소하고, 고농도의 PG $F_2$$_{\alpha}$는 배아의 부화를 억제하였으며, 발생 단계에 따라 prostaglandins의 요구 양이 다름을 알 수 있다. 또한 상실기 이후 배아에서 합성되며, 발생시기에 따라 그 영향이 다르고 팽창과 부화에 관여하는 것으로 사료된다.생 단계에 따라 prostaglandins의 요구 양이 다름을 알 수 있다. 또한 상실기 이후 배아에서 합성되며, 발생시기에 따라 그 영향이 다르고 팽창과 부화에 관여하는 것으로 사료된다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
• /
• 제7권1호
• /
• pp.49-56
• /
• 2003

높은 농도로 투여된 성선자극호르몬 분비호르몬 이성체(GnRH-Ag)는 성선자극호르몬의 분비를 억제시키고 난소의 기능을 억제하는 하는 것으로 보고되고 있다. 그러나 체외수정 및 배아이식 시술과정에서 과배란 유도를 위해 다량의 GnRH-Ag를 사용하고 있으며, 이는 progesterone을 보충해 주어야 하는 황체기 결함을 유발시킨다. 본 실험의 목적은 이러한 황체기 결함을 유발시키는 원인을 알아보고자 사람 과배란 유도 과정과 비슷하게 생쥐에 GnRH-Ag와 PMSG를 투여하고 난소내 세 포자연사와 호르몬 합성 의 변화를 조사하고자 하였다. GnRH-Ag과 생리 식염수를 PMSG 투여 전 48시간부터 투여 후 48시간까지 12시간 간격으로 10$\mu$g씩 주사한 후 난소와 혈액을 채취하였다. 결과로서 난소의 무게는 GnRH-Ag만을 투여한 군에서 다른 두 실험군(PMSG 투여군, PMSC + CnRH-Ag 투여군)에 비해 유의하게 감소하였다. GnRH-Ag 투여군에서 난소내 강소형성전 난포의 비율은 증가한 반면, PMSC + GnRH-Ag투여군에서는 강소형성 난포의 비율은 감소하였고 황체의 비율은 증가하였다. 한편 난소내 세포자연사를 보이는 난포의 비율은 GnRH-Ag 투여군에서 PMSG 투여군에 비해 두배 이상 증가한 것을 알 수 있었고, 이러한 증가는 PMSC를 함께 투여함으로서 감소하는 것을 알 수 있었다. 혈청내 estradiol과 progesterone의 농도는 GnRH-Ag 투여군에서 다른 두군에 비해 유의하게 감소하였다. 그러나 GnRH-Ag와 함께 PMSG를 투여 한 경우 estradiol 농도는 PMSG 투여군 수준까지 완전히 회복되었으나, progesterone농도는 완전히 회복되지 않았다. 결론적으로 체외수정 및 배아이식 과정에서 사용되는 GnRH-Ag는 난소내 세포자연사를 유발하고 호르몬 합성을 억제시켜 황체기 결함을 유발시킬 수 있으며, 이를 막기 위해 적절한 progesterone 보충이 필요한 것으로 사료된다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
• /
• 제6권2호
• /
• pp.105-110
• /
• 2002

포유동물의 생식을 조절하는 다수의 호르몬 가운데 가장 중요한 것들로 난소로부터의 estrogen과 progesterone을 들 수 있다. 반면 다양한 스트레스 인자들은 암컷의 성 반응 행동과 번식을 억제함이 잘 알려졌다. 이러한 스트레스가 가해지는 동안 부신에서는 카테콜아민(catecholamine)이 다량 분비되어 위기 상황에 대처하며 이 과정에서 생식 현상의 억제가 일어나는 것으로 추정된다. 본 연구에서는 생식호르몬 분비와 성 행동 양식에 광범위한 영향을 미침이 알려진 카테콜아민 중 특히 부신의 norepinephrine(NE)과 epinephrine(E) 합성ㆍ분비 양상과 발정주기 간의 상관관계를 조사하였다. 이를 위해 HPLC-ECD를 사용하여 주기 중인 흰쥐 부신 수질내 NE와 E함량과 체외 배양한 부신으로부터의 분비를 조사하였다. NE 함량은 proestrus에서 증가하기 시작하여 diestrus I에서 최고에 도달하였고, diestrus II에 최소치로 감소하였다. 부신 내 E 함량의 최고치는 proestrus, 그리고 최저치는 diestrus II에서 관찰되었다. 흰쥐 부신 내 NE : E ratio는 diestrus I에서 1 : 4.81로 가장 낮았고 기타 시기에는 1 : 6.13～7.02였다. 체외 배양한 흰쥐 부신으로부터의 NE 분비는 diestrus II에서 가장 낮았으며 estrus에서 최고에 도달하였고, proestrus에서의 분비 역시 diestrus II 때보다 유의성있게 높았다. E분비의 최고치는 estrus에서, 그리고 최저치는 diestrus 떼서 II 관찰되었다. 한편 배양액 중 Ne : E ratio는 estrus에서 1 : 3.32로 가장 높았고 기타 시기에는 1 : 2.34～2.65였다. 본 연구 결과는 (1) 흰쥐 부신에서 카테콜아민 생성과 분비 양상이 발정주기 중 역동적으로 변화하며, (2) NE로부터 E로의 전환이 발정주기 중 stage-specific하게 일어남을 나타내는 것으로서, 이는 카테콜아민 합성율을 결정하는 rate limiting enzyme인 tyrosine hydroxylase(TH)와 NE에서 E로의 전환 과정을 매개하는 phenylethanolamine-N-methyltransferase(PNMT)의 발현과 활성이 중추신경계에서와 유사하게 생식호르몬, 특히 estrogen and/or progesterone의 영향을 받음을 시사한다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
• /
• 제1권2호
• /
• pp.141-156
• /
• 1997

1992년 1월부터 12월까지 1년간에 걸쳐 전북 군산, 선연리 조하애에서 채집된 개량조개, Mactra chinensis Philippi를 대상으로 생식세포 발달과 생식소 발달양상을 조사하기 위해 토과형 전자현미경으로 미세구조 변활르 관찰하였고, 정확한 산란기를 규명하기 위해 조직학적으로 생식주기를 조사하였다. 개량조개는 장웅이체이다. 난황형성과정은 난모세포의 발달정도에 따라 다르게 나타나고 있다. 전난황형성기 난모세포질 내에서는 핵주변 구여게 골지장치와 수많은 공포들 및 미토콘드리아들이 출현하고 있는데 이들은 차후, 지방적 형성에 관여한다. 난황형성전기 난모세포에서는 지방적 및 지질과립들이 핵막 근처에서 출현하여 피질층쪽으로 분산되는 반면, 같은 발달단계의 난모세포질의 피질구역에서는 피질과립들 (단백질성 난황과립)이 처음으로 생성되어 난황막 근처의 피질층에서 핵주변 구역쪽으로 분산 분포된다. 난황형성후기 난모세포에서는 세포질 내의 골지장치, 공포, 미토콘드리아, 그리고 조면소포체들이 자율합성에 의해 난황과립 형성에 관영하고 있다. 반면, 외인성 물질들인 지질형태의 과립들, 단백질성 물질 및 다량의 글리코겐 입자들이 생식상피 낸에서 출현하고 있는데, 이들 물질이 생식상피에서 난황막 구조물인 미세융모를 통해 난황형성 후기 난모세포의 난질 내로 통과해 들어가는 현상이 관찰되었다. 이와 같은 현상은 난황성성이 일어날 때에 hterosynthesis가 일어나고 있음을 시사한다. 완숙난모세포의 난경은 약 50-60 \mu m이고, 완숙정자 두부의 길이는 대략 3 \mu m이며, 미부의 길이는 약 30 \mu m정도이다. 정자 미부편모의 axoneme은 중앙의 2개의 미세소관(microtubule)과 주변에 위치한 9개의 2중 미세소관 (microtubule)으로 구성되어 있다. 본 종의 산란기는 5월에서 9월 중순에 걸쳐 일어나는데, 주산란시기는 해수수온이 22 \circ C 이상으로 상승하는 6, 7월이다. 따라서 1년에 산란 (번식)시기가 한번 일어나고 있음을 알 수 있다. 생식 주기는 초기활성기 (1-2월), 후기활성기 (2-4월), 완숙기 (4-9월), 산란기 (5-9월) 그리고 퇴화 및 비솰성기 (6-12월)의 연속적인 5단계로 구분할 수 있었다. 재생산에 가담할 수 있는 암, 수개체들의 군성숙도(%)를 조직학적으로 조사한 결과, 각장 3.5-3.9cm 범위의 개체는 55.5%이었고, 5cm 이사인 개체들은 재생산에 100% 참여하였다. 본 종의 암, 수개체들은 만 1년부터 재생산에 가담하는 것으로 추정된다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
• /
• 제2권2호
• /
• pp.189-196
• /
• 1998

Growth Hormone Releasing Hormone (GHRH)은 척추동물의 시상하부로부터 합성, 분비되어 시상하부-뇌하수체간의 문맥계를 통해 뇌하수체 전엽에 작용하여 Growth Hormone (GH)의 분비를 촉진한다. 시상하부에서 발현되는 일부 Releasing Hormone 들이 여러 시상하부외 조직에서도 검출되고 조직특이적인 기능을 수행한다는 사실이 여러 연구자들에 의해 밝혀졌다. 이러한 사실들을 배경으로 본 연구자는 GHRH가 흰쥐의 뇌하수체 전엽과 뇌하수체로부터 유래된 종양세포주들에서 발현될 가능성을 조사하였다. GHRH 펩타이드와 mRNA의 존재와 구조를 규명하기 위하여 뇌하수체와 배양 세포를 사용하여 GHRH immunocytochemistry, 방사면역측정법, GHRH PCR과 RNase protection assay를 시행하였다. Immunocytochemistry의 결과 gonadotrope (대형)와 somat-olactotrope (중간형)로 추정되는 세포들에서 GHRH 염색이 나타났고, Somatolactotrope성 종양세포인 GH3 cell 추출물에서 immunoreactive GHRH가 방사면역측정법으로 검출되었다. 3'rapid amplification of cDNA end (3'-RACE)를 시행한 결과, 흰쥐 뇌하수체에 GHRH transcript가 존재하고, 그 3'end 부분이 다른 조직내의 GHRH와 동일함을 확인하였다. GHRH RT-PCR에서도 뇌하수체와 종양세포주들인 $\alpha$T3 cell (gonadotrope성)과 GH3 cell에서 예상 산물들이 증폭되었다. RNase protection assay를 시행한 결과 난소절제에 의해 뇌하수체내 GHRH 유전자 발현이 증가됨을 확인하였다. 이상의 결과는 GHRH가 뇌하수체 전엽의 gonadotrope와 somatotrope에서 발현되고, paracrine 또는 autocrine조절물질로 작용하여 GH 분비 외에도 뇌하수체 전엽 세포들의 분화와 분열등에 관여함을 시사한다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
• /
• 제4권1호
• /
• pp.87-93
• /
• 2000

eCG는LH, FSH및 TSH와 같이 당단백질 호르몬에 속하고, 당쇄가 많이 첨가된 $\alpha$와 $\beta$-subunits의 비공유결합으로 구성되어 있고, 말에서 보다 다른 동물에서 FSH와 LH의 이중 생리활성을 나타내는 아주 특이한 성선 자극 호르몬이다. eCG는 임신 40~130일 사이에 말의 자궁내막배의 영양막세포에서 합성ㆍ분비된다. 따라서 본 연구에서는 eCG, eLH 및 eFSH의 각각 subunits mRNA발현을 태반과 뇌하수체에서 분석하였다. mRNA의 추출은 임신 70일의 태반과 27개월된 숫컷말의 뇌하수체에서 분리하였다. 말 태반을 이용한eCG mRNA발현의 Northern blotting분석결과 $\beta$ subunit가 $\alpha$ subunit보다 아주 많이 발현되었으며, 또한 뇌하수체에서 $\alpha$-, LH $\beta$-, FSH $\beta$-subunit의 분석결과 $\alpha$ subunit는 약 0.8 kb, FSH $\beta$ subunit는 1.8 kb의 크기로 발현되었는데, 이러한 FSH $\beta$ subunit는 cloning되어진 cDNA의 크기와 일치한다. 뇌하수체 전엽에서는 $\alpha$ subunit가 LH $\beta$ subunit와 FSH $\beta$ subunit보다 현저히 많이 발현된다는 사실이 밝혀졌다. 따라서, 태반과 뇌하수체에서 발현되는 각각 subunit의 mRNA는 독립적으로 조절되어 결과적으로 발현량에 차이가 나타난다고 시사되어진다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
• /
• 제4권1호
• /
• pp.125-131
• /
• 2000

Differential display-PCR 방법을 이용하여, hCG 처리에 의한 참돔, Pagrus major의 난성숙 능력의 획득 경과시간에 따라 새롭게 발현하는 cDNA를 해석하였다. Differential display-PCR과 5'RACE 방법을 이용하여, 2,662 염기와 434개의 아미노산을 코드하고 있는 cDNA의 전염기배열을 결정하였다. DNA의 데 이터베이스인 GenBank 및 EMBL을 이용하여 상동성을 검색한 결과, 본 cDNA와 높은 상동성을 나타낸 유전자는 검색되지 않았다. 따라서 본 cDNA는 참돔의 난성숙 능력 유도와 함께 그 발현량이 증가하는 난성숙 관련 유전자로 판단되었다. 또한 본 cDNA에서는 protein kinase C 인산화 및 casein kinaseII 인산화 consensus 배열의 존재가 확인되었다. 본 연구에서 cloning된 난성숙 관련 유전자는 난여포에 hCG 처리 9～24시간 후에 그 발현량이 증가하였으며, GH-II (300 ng/ml)로 배양한 난여포에서 특이적으로 증가하였다. 또한 in vivo 실험에서 난성숙 관련 유전자는 난성숙 능력 획득 이전의 난소에서는 거의 발현하지 않았으나, 난성숙 능력을 획득한 난소에서 강하게 발현된 점으로 보아, hCG에 의한 난성숙 능력 유도에 성숙기간 중 새롭게 합성되는 난성숙 관련 유전자가 관여할 가능성이 높다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
• /
• 제4권2호
• /
• pp.231-236
• /
• 2000

Gonadotropin-releasing hormone (GnRH)과 그 수용체가 흰쥐의 난소, 정소, 자궁, 태 반 그리고 유선 등의 생식기관에서 발현됨이 알려져 있다. 더욱이, 뇌하수체 전엽에 작용하는 GnRH의 표적 산물로 알려진 luteinizing hormone (LH)이 흰쥐 생식소에서도 발현됨이 알려졌는데, 이는 생식소 내에 GnRH-LH로 이루어진 국부 회로 (local circuit)가 존재함을 시사하는 것이다 본 연구는 LH와 그 수용체 유전자가 흰쥐 유선에서도 발현되는가를 규명한 것이다. 이를 위해 reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)과 LH 방사면역측정법 (radioimmunoassay, RIA)을 사용하였다. RT-PCR을 시행한 결과 생식 주기중인 임신하지 않은 흰쥐 유선에서 뇌하수체 유형의 LH${\beta}$ 전사체 (exon 1-3)가 증폭되었으나 정소특이적 LH${\beta}$ exon 부분은 검출되지 않았다. 뇌하수체 glycoprotein hormone에서 공통적으로 존재하는 ${\alpha}$-subunit과 LH 수용체에 대한 전사체 역시 흰쥐 유선에 존재함이 확인되었다. 또한 기존의 보고에서 수유중인 흰쥐 유선에서만 발현된다고 알려진 GnRH가 임신하지 않은 흰쥐 유선에서도 발현됨을 확인하였다. LH 방사면역측정법을 시행한 결과 흰쥐 유선조직 추출물에서 immunoreactive LH분자들이 검출되었으며, LH standard curve와 parallelism을 보이므로 흰쥐 유선의 LH가 뇌하수체 형과 동일할 가능성을 확인하였다. 본 연구는 흰쥐 유선에서 LH subunit들과 수용체 유전자가 발현됨을 최초로 보고한 것으로서, 흰쥐 유선이 LH의 생성처이면서 동시에 작용처이며 유선에서 합성된 GnRH의 조절하에 국부적인 인자로 작용할 가능성을 시사한다.