비브리오패혈증균은 세계에서 치사율이 50%에 달하는 가장 치명적인 수인성식품매개 병원균으로 해수에서 흔히 있으며, 특히 따뜻한 계절에 발생한다. 본 연구는 제주도의 해수, 유통 수산물, 수족관물에서 분리한 비브리오패혈증균에 대해서 RT-PCR을 이용한 독소 유전자, Vitek을 이용한 항생제 내성, PFGE를 이용한 유전적 특성을 조사하였다. 총 487개의 시료를 조사한 결과 비브리오패혈증균 46주(중복 균주 포함)가 해수에서 44주, 유통수산물에서 1주, 수족관물에서 1주 분리되었다. rtxA, viu와 같은 독소 유전자는 각각 8주(17.4%), 9주(19.6%) 검출되었고, vvhA와 같은 독소 유전자는 모든 균주에서 검출되었다. 항생제 내성 실험결과 cefoxitin 항상제에 대해서 100% 내성이 나타났다. 비브리오패혈증균 46주에 대한 PFGE 분석 결과 총 6유형이 100% 상동성을 보였고, 유사도는 81.3-98.0%로 나타났다. 수산물과 수족관물에서 분리된 비브리오패혈증균은 해수와의 상동성 결과 유사도는 불일치로 나타났고 지역과 시료 사이에는 유사성이 없었다. 독소 유전자를 가진 비브리오패혈증균에 의한 식중독 환자가 제주도에서 발생한 점을 고려해볼 때, 해수, 유통 수산물, 수족관물에서 분리한 비브리오패혈증균에 대한 모니터링이 지속되어야 할 것으로 보인다.
비브리오균은 현재까지 약 30여종이 알려져 있는 그람음성의 종속영양세균으로, 이 중 12종이 사람에게 질병을 일으킨다고 보고되고 있으며, 우리 나라에서 문제가 종종 발생하는 비브리오균은 패혈증 비브리오, 장염 비브리오 그리고 V.cholerae non-O1을 들 수가 있다. V. cholerae O1과 형태학적, 생화학적, 생물학적 성상은 일치하지만, 콜레라균의 항혈청에는 응집하지 않는 일군의 세균을 V. cholerae non-O1이라고 부른다. (중략)
본 연구에서는 패혈증비브리오균에 대한 PEM, RCM, RRM과 CTM 메탄올 추출물의 항균 활성을 평가하였다. 96-well microplates를 사용한 액체 배양법 실험 결과 4가지 천연물은 200 ㎍/mL 농도에서 80%이상의 항균 효과를 나타내었다. 또한 페이퍼디스크 확산법을 사용하여 항균 활성을 평가한 결과 4가지 천연물은 20, 40 mg/disc의 농도에서 농도 의존적으로 패혈증비브리오균의 성장을 억제하였다. 다음으로 4가지 천연물의 안전성을 평가하기 위해 MTS assay를 통해 HeLa 세포에 대한 독성을 확인한 결과 100, 200 ㎍/mL의 농도에서 세포 독성을 나타내지 않았다. 또한 LDH assay를 사용하여 패혈증비브리오균의 HeLa 세포에 대한 세포막 손상 억제 효과를 평가한 결과 PEM, RCM, RRM과 CTM 메탄올 추출물은 200 ㎍/mL 농도에서 세포막 손상억제 효과를 나타내었다. 다음으로 바닷물과 조개를 사용한 수족관 모델에서 4가지 천연물의 메탄올 추출물 혼합액 200 ㎍/mL 농도는 colony 생성을 현저하게 감소시켜 패혈증비브리오균의 증식을 억제 하는 결과를 나타내었다. 이와 같은 결과를 통해 4가지 천연물의 메탄올 추출물은 바닷물과 해산물에 존재하는 패혈증비브리오균에 대해 뛰어난 항균효과를 나타내면서 인체에는 무해한 천연소독제로 응용할 수 있을 것으로 판단된다.
비브리오 불니피쿠스는 우리의 식생활과 밀접한 관계가 있는 어패류와 바닷물에 의해 간경화 같은 만성 간질환 환자에 주로 감염되어 높은 치사율을 보이는 비브리오. 패혈증을 일으킨다. 그러나 현재까지도 항생제 같은 대증적 요법 외 효과적인 치료 및 예방 방법이 없는 실정이다. 최근 혈중 LDL같은 지단백질 이 감염 과 염증반응에 중요한 방어작용을 가지고 있음이 알려졌다. 따라서 LDL이 비브리오 패혈증에 영향을 미치는지 평가해 보았다. 비브리오 패혈증을 일으키는 비브리오 불니피쿠스 균을 배양하고, 대표적인 병태 인자인 비브리오 불니피쿠스 cytolysin를 추출하여 cytolysin의 용혈 활성에 혈청, 콜레스테롤 및 LDL의 영향을 조사하였다. 그리고 마우스에 직접 LDL를 복강 내 주입하여 혈중농도를 변화시킨 후 비브리오 불니피쿠스 균의 마우스 사망률을 조사하였다. 또한 전북 지역 대학 병원에서 비브리오 패혈증 환자에서 생존한 환자와 사망한 환자의 콜레스테롤과 LDL를 조사하였다. 비브리오 불니피쿠스 cytolysin의 용혈 활성은 혈청, cholesterol 및 LDL에 의해 억제되었다. 비브리오 불니피쿠스 균의 마우스 사망률은 LDL을 주입한 경우 40%나 사망률이 낮게 나타났다. 전북 지역 대학 병원에 비브리오 패혈증으로 입원 중인 환자 (15명)의 혈액 분석에서 정상 수준의 콜레스테롤 $(190.8{\pm}16.3)$과 혈청 지단백질 LDL $(53.3{\pm}40.7)$을 가진 환자는 모두 생존하였다 (4명). 그러나 정상보다 낮은 수치 ($35.6{\pm}13.9,\;LDL;\;59.2{\pm}15.1$, 콜레스테롤)를 보이는 환자는 사망하였다 (11명). 콜레스테롤과 LDL은 비브리오 불니피쿠스 cytolysin의 독작용의 억제 요소로서, 비브리오 패혈증의 예후에 중요한 요소임이 밝혀졌다. 또한 이는 콜레스테롤과 LDL이 비브리오 패혈증의 예방과 치료에 중요한 지표가 될 수 있음을 시사한다.
vibrio vulnificus의 균체내독소의 특성을 파악하여 비브리오 패혈증의 발병원인 구명을 위한 자료를 제공하고자 생균과 균체파쇄액의 치사독성과 내열성 및 혈관투과성항진작용을 실험한 결과는 다음과 같다. 1. 환자분리균(V.vulnificus CDC B3547)과 환경분리균(V.vulnificus B57)의 독력은 차이가 없었다. 2. V.vulnificus의 균수가 $10^{7}$/ml 이상일 때 강한 치사독력이 나타났다. 3. 균체파쇄액이 독성은 80$^{\circ}$C 20분에 완전히 불활성화 되었다. 4. 균체파쇄액은 용혈성은 없었으나 세포독성은 인정되었다. 5. V.vulnificus의 새앙주에 대한 주 치사독소는 균체 내에 존해했으나 LPS와 LPprotein complex는 기존의 방법으로 분리할 수 없었다.
V. vulnificus에 대한 매실 추출액의 항균활성을 측정함으로서 다소비 식품인 수산물의 미생물학적 안전성 확보에 기여하고자 하였다. 실험에서 사용한 균주는 수산물, 수족관수, 해수, 갯벌에서 분리된 V. vulnificus 28주를 대상으로 하였다. V. vulnificus 28주 모두에서 vvhA 유전자가 검출되고 good identification 이상의 생화학 동정 결과를 나타내어 V. vulnificus임이 확인되었다. 실험에 사용된 V. vulnificus는 tetracycline과 chloramphenicol 항생제에 감수성을 나타내어 환자 발생 시 이 두 종류의 항생제가 치료에 용이할 것으로 판단되었다. V. cholerae NCCP 13589와 V. parahemolyticus NCCP 11143 표준균주 모두 매실 추출물 2.5%와 5%에서 생육 저지환을 나타내었다. 또한 V. vulnificus 분리균주와 V. vulnificus NCCP 11135 표준균주 모두 매실 추출물 1.25%, 2.5%, 5%에서 생육 저지환을 나타내어 V. cholerae와 V. parahemolyticus에 비해 V. vulnificus에 대한 매실 추출물의 항균활성이 높게 나타났다. V. vulnificus에 대한 매실 추출액 최소살균농도가 1.6%로 나타나 수산물 중 V. vulnificus 생육억제에 매실 추출물이 매우 유용할 것으로 판단되었다. 수산물과 관련된 비브리오균 중 패혈증을 일으키는 V. vulnificus균은 국내에서 매년 지속적으로 환자와 사망자를 발생시키고 있다. 수산물 생식 시 발생할 수 있는 식중독을 예방하기 위한 매실 추출물 활용연구가 필요한 것으로 판단된다.
우리나라 남해연안 어패류에서 V. vulnificus, V. cholerae non O1 균을 분리하여 이들 균이 생산한 용혈독소의 활성을 검토하고 특히 치사율이 높은 패혈증 원인균인 V. vulnificus균이 생산한 균체외 단백독소인 hemolysin을 분리정제하고 얻어진 독소를 이용하여 항혈청을 만들었다. 1. V. vulnificus hemolysin(VVH)은 HI broth에서 $37^{\circ}C,\;15{\sim}24hr$ 진탕배양으로 잘 생산되었으며 V. cholerae non O1 균의 경우는 배양 15시간까지는 hemolysin 생산이 증가되었으나 15시간 경과 후에는 균종에 따라 증가되는 것도 있었고 경과 시간에 따라 오히려 감소하는 균주도 있었다. 2. V. vulnificus가 생산한 hemolysin은 면양적혈구에 대한 용혈활성이 강하고 토끼적혈구에 대하여는 약하였으나 V. cholerae non O1 균주는 토끼적혈구에 대한 용혈활성이 면양이나 말 적혈구에 대한 활성보다 2배정도 강하였다. 3. VVH는 hydrophobic Phenyl-Sepharose HP column을 이용하여 washing buffer와 elution buffer의 성분과 pH를 조정하면서 $1\%$ CHAPS를 이용하여 2차에 걸쳐 column chromatography한 결과 정제도와 수율이 매우 좋아졌다. 본 방법으로 다섯 차례에 걸쳐 정제한 결과 정제된 VVH의 specific activity는 $16900{\sim}52300$배로 평균 27,000배 이상 증가하였으며 수율도 $18.2{\sim}33.0\%$로 평균 $23.4\%$나 되었다. 실제로, V. vulnificus 배양액 2400ml로 부터 정제된 hemolysin을 $250{\mu}g$정도 만들 수 있어서 패혈증 비브리오균 연구에 크게 이바지 할수 있을 것으로 사료된다. 4. 정제된 VVH를 SDS-PAGE한 결과 분자량은 50KDa이었으며 토끼를 이용해서 만든 항혈청의 항체가는 $2000{\sim}8500$이었다.
Vibrio septicemia,, resulting in high mortality, has been caused by Vibrio vulnificus. Ingestion of marine products or contact with sea water contaminated with Vibrio vulnificus can cause septicemia. Vibrio vulnificus has been detected world wide and west sea area of Korea, Kum river estuary in particular, showed high detection rate. Higher detection rate of Vibrio vulnificus were reported in the bottom deposit with low depth of water, low salinity, and high COD. Man with the liver disease can easily come down with Vibrio septicemia and the main source is the sliced raw fish dish. The preventive measure for this disease is to wash raw fish material thoroughly with tap water and handle in sanitary conditions. Washing with sea water is strictly prohibited . It may be necessary to forbid the small-scale businessmen from selling the sliced ray fish dish in the vicinity of seashore. Man with the liver disease of diabetes should not swim or consume the raw fish dish in the contaminated area during summer.
In the case of being contaminated with pathogenic Vibrio, shellfish pose a serious threat for public health. This study was conducted to investigate the presence of Vibrio parahaemolyticus and V. vulnificus in the seawater, bottom deposit and shellfish samples collected from the Gomso Bay, west coast of Korea. V. parahaemolyticus (30-80 CFU/g) was detected from seawater Jul. to Oct. and highest at Sep. V. parahaemolyticus was detected less than 10 CFU/g from seawater at Nov. with $14.6^{\circ}C$ of seawater temperature. V. parahaemolyticus (180-1,850 CFU/g) was detected more than 100 CFU/g from 3 kinds of shellfish, Short-necked clam Ruditapes philippinarum, Corb shell Cyclina sinensis, and Surf clam Mactra veneriformis, Jul. to Oct. and was highest in Surf clam at Oct. V. parahaemolyticus was detected less than 20 CFU/g from all tested shellfish at Nov. V. vulnificus (1.8-2.7 MPN/100 mL) was detected from seawater Jul. to Oct. and was not detected at Nov. V. vulnificus (18-236.7 MPN/100 g) was also detected from 3 kinds of shellfish Jul. to Oct. and was highest in Corb shell at Jul. V. vulnificus was not detected from all tested shellfish at Nov.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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