한국미생물생명공학회 2000년도 Proceedings of 2000 KSAM International Symposium and Spring Meeting
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pp.193-198
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2000
PCBs를 분해하는 bphABC유전자를 plasmid vactor pMFB2에 유전자조작한 Pseudomonas putida AC30(pMFB2)를 PCBs에 오염된 연안해역의 해수와 저니로 만든 microcosm에 도입한 결과, 각각 도입 4일과 7일만에 사멸하였다. 그러나, 도입한 P. putida AC30(pMFB2)는 사멸하였지만, 연안해수와 저니 microcosm에서 plasmid pMFB2가 전이한 토착미생물이 검출되었다. 도입한 P. putida AC30(pMFB2)의 생잔실패의 원인을 분석한 결과 공경 0.2$\mu\textrm{m}$의 filter를 통과하는 물질과 생물이 가장 크게 영향을 미치는 것으로 나타났다. 유전자조작 P. putida AC30(pMFB2)의 도입과 bphABC유전자의 토착미생물로의 전이에 따른 토착미생물군집에 미치는 영향을 개체수 변동으로 조사한 결과, 토착미생물 군집에 미치는 영향은 보이지 않았다. P. putida AC30(pMFB2)의 도입에 의한 PCBs의 생분해성을 분석하였다. 그러나, 도입한 유전자조작 균주가 생잔에 실패함으로써 잔류하고 있는 PCBs의 농도변화는 보이지 않았다.
마늘병원균에 대한 토착길항미생물 선발을 위하여 경북 영천시 신덕리 및 구계리 일대 16개소의 토양 시료로부터 160균주의 세균들을 분리하였다. 이들 분리된 세균 중 마늘 잎집썩음병의 원인균인 P. marginalis와 마른썩음병의 원인균인 F. oxysporum에 대하여 길항능이 매우 뛰어난 3종의 토착길항세균을 선발하였다. 선발 균주들을 16s rDNA sequencing과 Bergey's manual을 이용한 방법에 의해 동정한 결과 B. subtilis YC82, B. vallismortis YC84, B. amyloliquefaciens YC240 균주들로 동정할 수 있었다. 선발된 3종의 토착길항세균들은 항세균 및 항진균 길항기작인 siderophore, ${\beta}$-glucanse, chitinase, 항생물질 생산능을 가진 균주들이었으며, 식물의 생장촉진에 도움이 되는 인산가용 화능과 식물생장촉진호르몬인 옥신 및 지베렐린을 생산하는 균주들로 확인되었다. 또한, 3종의 토착길항세균들은 in vivo 포트실험을 통해 잎집썩음병원균인 P. marginalis 에 대한 방제율이 70% 이상이고 동시에 생장촉진능도 있다는 것을 검증하였다. 그리고 마른썩음병원균인 F. oxysporum에 대한 방제율도 B. subtilis YC82와 B. amyloliquefaciens Y240의 경우 60%, B. vallismortis YC84는 80% 이상으로 나타났다. 또한, 발아촉진능에서는 선발된 토착길항세균의 처리구가 무처리구에 비하여 20% 이상 향상된 우수한 발아촉진능을 나타내었으며, 생장촉진능 역시 초장 길이의 차이에서 B. subtilis YC82는 평균 $49{\pm}1.53\;mm$, B. vallismortis YC84 는 평균 $47{\pm}1.15\;mm$, B. amyloliquefaciens YC240에서는 평균 $80{\pm}1.21\;mm$로 무처리구의 평균 $39{\pm}1.51\;mm$ 보다 매우 우수하였다. 이와 같은 결과는 선발된 마늘잎집썩음병 및 마른썩음병 방제용 토착길항세균은 마늘병원균 방제능과 동시에 생장촉진능을 가지는 다기능 토착길항세균으로 향후 추가적인 현장적용시험을 통하여 병방제능 및 생장촉진능 검증이 이루어 진다면 마늘병해방제 및 생장촉진용 미생물제제 개발이 가능할 것이라 생각된다.
영남지역(嶺南地域) 3개(個) 토양(土壤)에서 근류균(根瘤菌) Bradyrhizobiurn japonicurn 30균류(菌類)를 분리(分離)하여, 우리나라 장백(長白)콩과 미국(美國)의 Clark 대두품종(大豆品種)에 대한 이들의 접종효과와 각 토양별(土壤別) 혈청학적(血淸學的) 분포특성(分布特性)을 조사(調査)한 결과(結果)는 다음과 같았다. 1. 토착근류균(土着根瘤根)의 대두(大豆) 품종별(品種別) 근류무게의 경우 장백(長白)콩에서, 식물체(植物體) 건물중(乾物重) 질소함량(窒素含量) Clarck에서 각각(各各) 높았는데, 토양별(土壤別)로는 1번(밀양군(密陽君) 상남면(上南面))>2번(창원군(昌原郡) 동면(東面))>3번 토양(土壤) (창원군(昌原郡) 진북면(鎭北面)) 균주(菌株) 순(順)이었다. 2. 토착근류균(土着根瘤根) 중 식물체(植物體) 질소함량(窒素含量)에 있어서 가장 좋은 접종효과를 보인 균주(菌株) 2번 토양(土壤)에서 분리(分離)한 YCK 141 이었다. 3. 토착근류균(土着根瘤根)의 혈청학적(血淸學的) 집단(集團)은 6종(種)으로써 혈청형(血消型) YCK 117(12균주(菌株))이 가장 많았고, 다음으로 USDA 110 (5균주(菌株)), USDA 123(5균주(菌株))>YCK 150(4균주(菌株))>YCK 141 (3균주(菌株))>YCK 226(1균주(菌株)) 순(順)이었으며, 토양별(土壤別)로는 1번 토양(土壤)(1종(種))을 제외(徐外)한 2번 (5종(種))과 3번 토양(土壤)(5종(種))에 분산(分散) 분포(分布)되어 있었다. 4. 공시토양(供試土壞)중 미경작지(未耕作地)인 1번 토양(土壤)에서 분리(分離)한 균주(菌株)들은 대두(大豆) 접종효과에 있어서 서로간에 균질성(均質性)을 보였을 뿐만 아니라, 혈청학적(血淸學的) 특성(特性)에 있어서도 모두가 YCK 117 혈청집단(血淸集團)에 속하는 동질성(同質性)을 보였다.
우리 지역 토양환경에 도착해 살고 있는 토착 길항미생물을 분리, 선발, 육종하여 다시 지역모양으로 돌렸을 때 우점 능력이 크고 적응력이 큰 토착 생물방제균을 선발하고자 경북 경주지역에서 자연농법을 수행하고 있는 저병해경작지로부터 토착 길항미생물을 분리하였다. 이들 중 고추역병균 Phytophthora capsici의 생육을 강력히 길항하는 항생물질과 siderophore를 동시에 생산하는 복수 길항기작의 토착 길항세균 Pseudomonas fluorescens 2112를 선발하였고, 이 균주로부터 우선 항진균성 항생물질을 생산, 정제한 후 그 특성을 조사하였다. 이 항생물질은 산성 pH 조건에서는 매우 안정하였으나 알칼리성 용액에서는 불안정한 물질로 판단되었고, 또한 열에 비교적 안정하여 $80^{\circ}C$까지 30분동안 열처리하여도 항균활성을 50% 정도 유지하였다. P. fluorescens 2112로부터 이 균주의 중요 생물방제 기작인 항진균 항생물질을 단일물질 수준으로 분리하여 그 구조를 분석해 본 결과 선발된 균주가 생산하는 항생물질은 다른 Pseudomonas sp. 에서도 생산되는 것으로 알려진 2,4-diacetylphloroglucinol로 동정이 되었다. 고추역병균 P. capsici의 생육을 억제하는 토착 길항세균 P.fluorescens 2112가 생산하는 항진균 항생물질의 항균범위를 조사해 본 결과 다양한 식물병원성 진균에 방제력을 가지는 광범위 항생물질임을 확인 할 수 있었지만, Fusarium 속에 대해서는 큰 활성을 볼 수 있었다. 이 항진균 항생물질을 이용해 저해기작을 고추역병균 P. capsici의 포자를 대상으로 radioisotope labelling precursor [$^{3}$ H] Leucine, [$^{14}$ H] Glucose, [$^{3}$ H] Adenine 등으로 조사한 결과, 그 길항기작이 RNA 합성 저해로 추정되었다.
본(本) 시험(試驗)은 우리나라 토착대두근류균(土着大豆根瘤菌)의 균주(菌株) 인식(認識)과 분류(分類)를 위하여 서울농대(農大) 시험포장(試驗圃場)의 13개(個) 대두품종근류(大豆品種根瘤)에서 순수분리(純粹分離)한 대두근류균(大豆根瘤菌) 27개(個)와 본(本) 실험실보유(實驗室保有) 대두근류균(大豆根瘤菌) 6개(個)에 대하여 혈청면역적(血淸免疫學的) 시험(試驗)을 행(行)하였으며 그 결과(結果)는 다음과 같이 요약(要約)된다. 1. 항원조성(抗原組成)이 상이(相異)한 4개(個)의 대두근류균(大豆根瘤菌)에 대하여 얻어진 4가지 항혈청(抗血淸)과 위 33개(個) 대두근류균(大豆根瘤菌)을 tube 응집반응(凝集反應), 응집소(凝集素) 흡착반응(吸着反應) 및 gel 면역확산반응(免疫擴散反應)을 실시(實施)한 결과(結果), 33개(個) 대두근류균중(大豆根瘤菌中) 25개(個)를 4가지 serogroup과 그에 속(屬)한 각(各) serotype으로 구분(區分)할 수 있었다. 2. 33개(個) 대두근류균중(大豆根瘤菌中) Hill, 밀양품종(密陽品種)에서 분리(分離)한 2가지 분리균(分離菌) 및 방사(放射), 장백품종(長白品種)에서 분리(分離)한 2가지 분리균(分離菌), 그리고 팔달(八達), 새알, 장백품종(長白品種)에서 분리(分離)한 4가지 분리균(分離菌)이 혈청면역학적(血淸免疫擧的) 검정(檢定)에 의하여 각각(各各) 동일균주(同一菌株)로 밝혀졌다. 3. 본(本) 실험결과(實驗結果), 혈청면역학적(血淸免疫學的) 방법(方法)에 의하여 우리나라 토착대두근류균(土着大豆根瘤菌)의 균주(菌株) 인식(認識) 및 체계적(體系的)인 분류(分類)와 아울러 균주(菌株)와 대두품종간(大豆品種間)의 친화성(親和性)을 밝히는 것이 가능(可能)하리라 생각된다.
우리나라 캠벨얼리 포도주의 발효 중 효모 천이단계에서 분리된 당 내성 토착형 효모 균주 S. cerevisiae S13과 D8 균주로 MBA 포도주를 발효하여 그 특성을 산업용 포도주 효모 W-3 균주와 비교하였다. 토착형 효모 두 균주의 경우 발효초기 가용성 고형분의 감소 및 알코올 생성이 다소 지연되었으나 발효 종료 후 D8 포도주는 12.4%, S13 포도주는 11.8%로서 대조균주 W-3 포도주의 12.0%와 알코올 함량이 유사하거나 다소 높았다. Malic acid의 함량의 경우 D8 포도주는 W-3 포도주와 유사한 수준을 나타내었으나 S13 포도주는 W-3 포도주의 약 71.9% 수준으로 매우 낮았다. 아세트알데히드, 메탄올, 프로판올, 이소프로판올, 이소아밀알코올 등의 함량 역시 D8 포도주와 S13 포도주 모두가 W-3 포도주보다 매우 낮게 나타났다. 특히 메탄올의 함량은 S13 포도주가 98.6 mg/L, D8 포도주가 112.0 mg/L로서 W-3 포도주의 192.8 mg/L에 비하여 각각 51.1%, 58.1%의 낮은 수준을 나타내었다. 또한 색도를 나타내는 L, a, b 값은 S13, D8 포도주 모두에서 W-3포도주보다 낮게 나타났으며 관능평가 결과 색에 있어서 S13 포도주가 W-3 포도주보다 다소 높은 점수를 얻었으나 통계적으로 유의적인 차이는 보이지 않았다.
우리나라 캠벨얼리 포도주의 발효 중 효모 천이단계에서 분리된 아황산 및 당 내성 토착형 효모 균주 S. cerevisiae S13과 D8 균주를 이용하여 캠벨얼리 포도주를 발효하여 그 특성을 산업용 포도주 효모 W-3 균주와 비교하였다. 토착형 효모 두 균주는 초기 발효 중 알코올 생성이 다소 지연되었으나 발효 4~5일 후부터 알코올의 생성량이 대조균주의 경우보다 높아졌다. 발효 종료 후 S13 포도주는 12.6%, D8 포도주는 13.2%로서 대조균주 W-3 포도주의 12.0%보다 높은 알코올 함량을 나타내었다. 발효 후 제성한 적포도주의 잔존 가용성 고형분의 함량, pH 등에는 큰 차이가 없었지만 S13 포도주와 D8 포도주는 총산 및 malic acid, lactic acid 함량이 높게 나타났다. 특히 lactic acid 함량에 있어서 W-3 포도주에 비하여 S13 포도주는 8.9배, D8 포도주는 약 6.0배의 높은 수준을 나타내었다. 토착형 효모 포도주는 W-3 포도주보다 아세트알데히드 함량이 다소 높았으나 매우 낮은 메탄올 함량을 나타내어 W-3 포도주의 72%, 식품공전상 기준치의 약 11% 수준을 나타내었다. n-Propanol과 iso-amyl alcohol의 함량에는 W-3 포도주와 큰 차이가 없었으나iso-butanol의 함량이 W-3 포도주보다 다소 낮게 나타났다. 관능검사 결과 토착형 효모 포도주는 색, 향, 맛, 전반적 기호도에서 모두 W-3 포도주에 비하여 높은 점수를 얻었으며 특히 색에 있어서는 D8 포도주가 3.66점, 향에 있어서는 S13 포도주가 3.42점으로서 W-3 포도주의 색 3.08, 향 2.92보다 매우 높은 점수를 얻었다.
인삼 유묘 뿌리 주변에서 자라고 있는 단세포 녹색 조류, 클로렐라 불가리스 KNUA027을 순수분리한 후 본 분리균주의 생물공학적 활용 가능성에대해조사를 실시하였다. 가스크로마토그래프/질량분석기를 이용한 분석 결과, 본 균주에는 영양학적으로 중요한 알파 리놀렌산(C18:3 ω3, 45.8%, 50.8 mg/g) 및 헥사데카트리엔산(C16:3 ω3, 11.8%, 13.1 mg/g)과 같은 다가불포화지방산이 풍부한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 국내 토착 미세조류는 잠재적인 오메가-3 다가불포화지방산 원료가 될 수 있다고 사료된다. 또한, 바이오디젤 생산에 적합한 것으로 알려져 있는 팔미트산(C16:0, 37.1%, 41.2 mg/g) 역시 본 균주에 의해 주요 지방산 성분으로 생합성 되는 것으로 확인되었다. 근사분석 결과 KNUA027 균주의 휘발성물질 함량은 88.5%였으며, 원소분석 결과 고위발열량은 19.8 MJ/kg으로 나타났다. 본 KNUA027 균주를 이용한 연구결과는 미세조류 기반 바이오연료와 바이오매스 생산을 위한 기초자료 역할을 할 수 있을 것으로 기대된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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