• Reproductive and Developmental Biology
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• 제31권1호
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• pp.29-33
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• 2007

본 연구는 소 체외수정란과 체세포 복제란의 초자화 동결 및 응해 후 생존능을 검토하였다. 배반포로 발육된 체외수정란 및 체세포 복제란을 초자화 동결법에 의해 동결하였다가 융해하여 생존율 및 배양 후 부화율을 검사하였다. 체외수정란 배반포를 초자화 동결 응해한 결과, 확장배반포가 배반포기 난자에 비하여 생존율(82.1%, 96/117)과 부화율(64.1%, 75/117)에서 모두 유의적으로 높았다(p<0.05). 핵이식 배반포 복제란을 초자화 동결 응해한 경우도 체외수정란과 비슷한 경향을 보여 확장 및 부화배의 생존율과 부화율이 각각 81.1%(30/37)와 78.3%(29/37)로, 배반포(각각 71.8 및 53.8%)에 비하여 다소 높게 나타났다. 본 연구의 결과는 초자화 동결 방법에 의해서 소 체외수정란과 체세포 복제란을 성공적으로 동결할 수 있으며, 특히 후기 배반포기 단계에서 초자화 동결 시 높은 생존율과 부화배 형성율을 얻을 수 있음을 보여준다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제26권3호
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• pp.363-368
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• 1999

연구목적: 본 연구는 동해방지제인 EFS40을 이용한 초자화동결이 생쥐 미성숙란의 cytoskeleton과 염색체의 성상에 미치는 영향을 indirect immunocytochemistry방법과 염색체 분석법으로 알아보고자 실시하였다. 연구재료 및 방법: 본 실험은 생쥐 미성숙란을 EFS40 (40% ethylene glycol, 18% ficou과 0.5 M sucrose가 들어있는 M2배양액)으로 초자화 동결하여 융해한 후 16시간동안 체외 성숙을 유도하여, 제 1극체가 나타난 성숙된 난자를 기준으로 동해제노출군 또는 대조군과 비교 조사하였다. 결과: 초자화동결된 미성숙란의 응해 후 생존율과 체외성숙율은 90.3%과 64.7%로써, 동해제노출군 (86.7%, 69.2%)과 대조군 (100%, 58.3%)에 유사하였다. 초자화동결이 미성숙란의 microtubule과 microfilament에 미치는 영향을 조사하였던 바, 동결군의 microtubule과 micro-filament의 정상적인 형성율 (93.9%, 100.0%)은 동해 제노출군 (94.4%, 100.0%)과 대조군 (100.0%, 100.0%)의 성적과 유사하게 나타났다. 또한, 초자화동결군에서 정상적인 염색체수를 가진 난자의 비율도 65.8%로써, 대조군(79.6%)과 노출군 (69.0%)의 결과와 유의한 차이가 없었다. 결론: 생쥐 미성숙란을 EFS40에 노출하고 동결하는 것이 미성숙란의 cytoskeleton과 염색체성상에 영향을 미치지 않으며, 본 연구에서 사용된 EFS40을 이용한 초자화동결법은 생쥐 미성숙란 동결에 적합하다는 것을 알 수 있었다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제23권3호
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• pp.379-384
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• 1996

본 연구는 생쥐 1-세포기 수정란의 초자화 동결과 동결액 노출에 따른 수정란의 배발달율과 SCE 빈도를 조사하고자 실시하였다. 체외수정된 생쥐 1-세포기 수정란의 동결은 EFS40 (40% ethylene glycol, 30% Ficoll, 0.3 M sucrose)의 초자화동결법을 이용하였으며, $25^{\circ}C$에서 30 초동안 EFS40에 노출시킨 다음, 곧바로 액체질소에 침투시키거나, 동결액의 독성 검사를 위해 동결없이 배양하여 다음과 같은 결과를 보였다. 융해후, 2-세포기 까지 생존율은 EFS40에 노출 혹은 초자화동결시 각각 95.2, 98.5% 로서 대조군의 100%와 비교했을때 큰 차이가 없었다. 그러나 배반포와 탈출배반포까지의 배발달율에 있어서 초자화 동결된 군 66.7, 50.0%는 동결액에 노출만된 군 94.0 78.8%와 대조군 93.9, 81.8%에 비해 낮았다 (p<0.05). 동결액에 노출 혹은 초자화동결된 생쥐 1-세포기의 체외 발달에 따른 SCE 빈도를 조사한 결과, 동결액 노출 ($20.2{\pm}2.1$) 혹은 초자화동결시 ($21.4{\pm}3.2$) SCE 빈도가 대조군 ($16.8{\pm}1.5$)에 비해 증가하였다. 이러한 결과를 종합하여 고찰할 때, 초자화동결된 1-세포기 수정란의 배반포 또는 탈출 배반포까지의 낮은 배발달율은 동결액의 영향을 받지 않았으나, SCE 빈도는 동결액에 노출 혹은 초자화 동결시 증가 된다는 것을 알수 있다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제25권3호
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• pp.287-292
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• 1998

본 연구는 동해방지제인 EFS35를 이용한 생쥐 미수정란의 초자화동결이 cytoskeleton과 염색체에 미치는 영향을 indirect immunocytochemistry와 염색체 분석으로 확인하고자 실시하였다. 생쥐 미수정란은 M2 배양액에 35% ethylene glycol, 18% ficoll, 0.3 M sucrose와 10% FBS가 함유된 EFS35를 이용하여 초자화동결되었다. 본 연구에서 얻어진 결과는 다음과 같다 초자화동결된 미수정란의 융해후 생존율은 89.3%로써 노출군 (97.7%)과 차이가 없었다. 초자화동결이 미수정란의 microtubule과 microfilament에 미치는 영향을 조사하였던 바, 동결군 (95.5, 100%)의 microtubule과 microfilament의 정상적인 형성율은 대조군 (97.5, 100%) 또는 노출군 (92.3, 100%)의 결과와 비교하였을때 차이가 나타나지 않았다. 또한, 체외수정 후 동결 군에서 정상적인 염색체수를 가진 난자의 비율도 73.5%로써, 대조군 (79.5%)과 노출군 (78.7%)의 결과와 차이가 없었던 바, 생쥐 미수정란을 EFS35에 노출하고 동결하는 것이 미수정란의 cytoskeleton과 염색체 성상변화에 영향을 미치지 않는다는 것을 알 수 있었다. 따라서, 본 연구에서 사용된 동해방지제인 EFS35를 이응한 초자화동결법은 생쥐 미수정란의 동결에 적합하다는 것을 시사한다고 하겠다.

• 한국가축번식학회지
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• 제20권1호
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• pp.35-42
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• 1996

본 실험은 체외수정에 의해 생산된 생쥐 배반포기배를 초자화 동결하였을 때 straw 제작방법 및 융해조건이 배반포기배의 생존성에 미치는 효과를 검토하고자 실시하였다. 융해시 각 straw내 동결보존액이 초자화 상태로 유지되는지를 확인하기 위하여 동결보존액 충전과 봉인방법이 다른 세 종류의 straw I, II, III가 제작되었는데, 이러한 모든 straw는 실온에 1~10초까지 노출된 후 $25^{\circ}C$ 수조에 침지되었다. 수정란은 20% ethylene glycol에 5분, EFS 40 용액에 1분간 노출된 후, straw내로 옮긴 다음 straw I과 II의 경우는 straw powder로, straw III는 straw powder와 열처리로 봉인하여 액체질소에 침지하여 다음과 같은 결과를 얻었다; 1) Straw I embryo column은 융해시 3~6초의 실온 노출을 제외한 대부분의 노출시간에서 불투명한 반초자화 상태로 변화되었다. 그러나 Straw II embryo column을 사용하였을 때 다소 개선되었으나 완전히 초자화 상태를 유지하지는 못하였다. 반면, Straw III embryo column의 경우는 융해시 완전한 초자화 상태를 유지할 수 있었다. 2) Straw III loading 방법을 사용하여 초자화 동결, 융해된 난자의 생존율은 Straw I loading 방법을 사용하였을 때에 비해 유의하게 높았으며(P<0.05), 표준오차 범위는 낮게 나타났다. 3) 초자화 동결보존된 난자를 실온에 3, 5, 10초간 노출한 후 $25^{\circ}C$ 수조내에 침지하여 융해하였을 때, 배양 24시간째 생존율은 72.7~87.1%이었고, 배양 48시간째 탈출배반포기배까지의 발달율은 34.0~48.4%이었으며, 융해시 각 처리간 유의차는 인정되지 않았다. 본 연구 결과, 초자화 동결 융해 후 높은 생존율 및 낮은 오차범위는 Straw III loading 방법과 double 봉인방법 및 적절한 2단계 융해법을 사용함으로서 얻을 수 있었다.

• 한국가축번식학회지
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• 제20권2호
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• pp.119-126
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• 1996

본 연구는 30% Ficoll과 0.3M sucrose가 함유된 mDPBS 용액에 40%의 ethylene glycol을 첨가함으로서 제조된 EFS40을 이용하여 1-세포기의 생쥐수정란을 효율적으로 동결할 수 있는 적정 조건을 확립하기 위하여 실시하였다. 체외수정에 의해 생산된 생쥐수정란은 1단계 동결법 혹은 2단계 동결법, 두 가지 동결 방법에 의해 각각 초자화 동결되었으며, 동결 후, 융해된 수정란의 생존율은 2-세포기로 분할율과 배양 5일째 탈출배반포기로의 발달율로 각각 검증하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1단계 동결법에서, 수정란을 직접 초자동결액에 1분 동안 노출시켰을 때, 수정란의 생존율은 85.5%, 발달율은 31.9%였다. 수정란을 먼저 20% ethylene glycol에 1, 3, 5분간 노출시킨 후, 1분동안 EFS40 용액으로 옮겨 동결하는 2단게 동결법에서는 1단게 동결법보다 낮은 생존율을 보였다(65.4, 53.6 및 29.6%). 가장 높은 생존율(95.9%)은 EFS40에서 30초동안 노출이 1단계 동결법에서 얻을 수 있었다. 이 조건하에서 2-세포기로 분할된 수정란의 63.8%가 탈출배반포기로 발달하였다. 또한, Differential labelling 기법을 이용하여 Total과 ICM(inner cell mass)의 세포수를 조사한 결과, 초자 동결 후 발달된 배반포의 Total과 ICM 세포수(63.2$\pm$16.9, 13.5$\pm$4.0)와 대조군 세포수(54.0$\pm$15.2, 12.3$\pm$4.6)간에는 각각 유의차가 인정되지 않았다. 이러한 결과는 동결로 인한 수정란의 발달율은 다소 낮았지만, 동결후 융해된 수정란은 정상적으로 배반포까지 발달함을 보여준다. 이러한 결과로 미루어 보아, 본 실험에 사용된 초자화 동결 방법은 1-세포기 생쥐 수정란을 성공적으로 동결시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제23권1호
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• pp.41-49
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• 1996

본 연구는 체외수정에 의해 생산된 생쥐 배반포기배를 vitrification 방법으로 동결보존하였을때 높은 생존율을 얻기 위한 적정조건을 검토하고자 실시하였다. 배반포기배를 생산하기 위하여, B6CBA F1 (C57BL/6, (표현불가)${\times}CBA/N$, (표현불가)) 계통의 생쥐 미수정란에 $1{\times}10^6$ spermatozoa/ml 농도의 정자로서 수정을 유도하였으며, 이후 $37^{\circ}C$, 5% $CO_2$배양기내에서 96시간동안 체외배양하였다. 배양 4일째의 배반포기배는 발달상태에 따라 early, middle 그리고 hatching blastocysts로 구분하였다. 본 실험에 사용된 동결보존액은 30% Ficoll과 0.5mol의 sucrose가 첨가된 mDPBS 용액에 40%의 ethylene glycol를 첨가한 EFS 40 (Zhu et al., 1993) 이었고, 수정란은 $25^{\circ}C$의 상온에서 먼저 20% ethylene glycol에 노출된 후 EFS 40 용액으로 옮겨 액체질소에 침지하는 2단계 동결법에 의해 동결보존되었으며, 급속융해하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 체외수정율과 배양 4일째 배반포기까지의 배발달율은 각각 89.4%와 86.1%였다. 2. 20% ethylene glycol에서 5분간 평형된 후 EFS 40 용액에 냉동보존된 후 융해된 난자의 생존율은 20% ethylene glycol에 0, 1, 3분간 평형된 난자의 생존율에 비해 유의하게 높았다. 3. 배반포기배를 20% ethylene glycol에서 5분간, EFS 40 용액에 1분간 차례로 노출한 다음 체와배양하였던 바, 배양 24시간째 생존율은 $82.9%{\sim}88.4%$ 였다. 본 연구 결과, 체외수정, 배양된 생쥐 배반포기배는 20% ethylene glycol과 EFS40에 대한 노출만으로는 난자의 생존성에 나쁜 영향을 미치지 않는 것으로 미루어 보아 배반포기배의 초자화 동결이 가능함을 시사하였다. 따라서 동결 융해 후 높은 생존율은 상온에서 난자를 2단계 즉, 20% ethylene glycol에 5분간 평형시킨 후 EFS 40 용액에 노출하여 1분내에 LN2에 직접 침지하는 간편한 동결방법으로 얻을 수 있었다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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• pp.78-78
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• 2001

본 연구는 초자화동결법(vitrification)을 이용하여 미성숙 소 난포란의 동결기술을 개발하기 위하여 시도하였으며 난포의 크기와 동결보호제의 농도 및 난황의 첨가가 동결-융해 후 미성숙 소 난포란의 생존성에 미치는 영향을 조사하였다. 미성숙 난자는 3mm 미만과 3mm 이상으로 구분된 난포로부터 채란하였으며 동결처리 전 동결보호제로서 30%EG과 40%EG, 그리고 각각에 10%의 egg yolk을 첨가하여 동결-융해 후 미성숙 난자의 생존성과 체외성숙율 및 체외수정율을 비교하였다. 생존율과 성숙율에 있어서 3m 미만과 3mm 이상의 2 처리구 모두 40%EG에 10%의 egg yolk을 첨가할 경우 유의적으로 높은 결과를 보였으나 3mm이하에서는 EG수준과 egg yolk 첨가 유무간에 생존율과 성숙율에 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 동결-융해 후 체외수정율은 3mm 미만에서는 처리구간에 유의적인 차이를 보이지 않았으나 3mm이상의 경우에서는 40%EG에 10%의 egg yolk 첨가구가 다른 처리구에 비해 유의적으로 높았다. 난포의 크기에 따른 동결-융해 후 생존율은 3mm미만의 난포란이 3mm이상 보다 높았으나 성숙율과 수정율에 있어서는 3mm이상이 3mm미만의 난포란에서 보다 다소 높았다. 생존율, 성숙율 및 수정율 모두 난포크기간에 유의차는 인정되지 않았다.

• 한국산학기술학회논문지
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• 제21권6호
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• pp.527-535
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• 2020

본 연구의 목적은 가축의 조직에서 유래한 동물세포를 재생산하기 위하여 세포를 동결하는 방법으로 초자화 동결법을 간단하게 이용하는 조건을 확립하고자 하였다. 소난관상피세포를 초자화 동결법에 적용하기 위하여 소 난관상피세포를 0.25ml 스트로에 밀봉하여 액체질소에 직접 노출하였다. 발정 3.5일자의 난관에서 추출된 소 난관상피세포는 polyampholyte가 주성분인 StemCell Keep^TM을 구매하여 초자화 동결을 유도하였고 5, 10, 25, 50, 75 및 100% 농도에서 생존율을 조사하였다. 세포의 생존성은 트립판 블루염색기법과 SYTO-13/PI 핵 염색시약을 이용하여 차별적 생사염색기법을 이용하여 분석하였다. Trypan blue 염색법에서는 각각 5.6±11.8, 12.5±7.2, 53.0±2.7, 85.1±6.9, 79.8±0.6 및 60.7±6.7%의 생존율이 관찰되었고, SYTO-13/PI 염색시약에서는 각각 4.6±2.5, 30.8±12.1, 58.4±2.5, 85.5±1.2, 79.8±0.6 및 71.2±1.2%의 생존율이 관찰되었다. 이러한 결과는 소 난관상피세포는 50% StemCell Keep^TM 농도의 동결배양액을 이용하여 동결 보존하는 것이 가장 우수한 생존율을 얻을 수 있었고 세포 유전자원 은행을 위한 영구보존에 적절할 것으로 판단된다.

• 한국가금학회지
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• 제40권3호
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• pp.207-216
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• 2013

동결 닭 원시생식세포의 생식계열 키메라를 이용한 생체에의 복원을 실용화하기 위해서는, 닭 원시생식세포의 동결보존기술의 향상에 의해 동결 및 융해 후의 많은 생존세포를 확보하는 것과, 생식계열 키메라의 제작효율을 높이는 것이 반드시 필요하다. 닭 원시생식세포는 배양 5.5~6 일령의 닭 원시생식선으로부터 채취하고, MACS 방법에 의해서 순수 닭 원시생식세포를 분리했다. 15% 각각의 EG와 DMSO를 동결보호제로 사용한 처리군이 각 군의 농도에 상관없이 유의적(p<0.05)으로 glycerol 처리군보다 동결 및 융해 후의 세포의 생존율이 높음을 확인하였다. 특히 10% EG + FBS 조합의 처리군에서 상업용 닭(C : $89.4{\pm}0.2%$)과 이사브라운 (A : $87.4{\pm}0.4%$)의 두 품종이 오계(B : $77.6{\pm}1.1%$) 및 화이트레그혼(D : $76.2{\pm}0.9%$의 두 품종보다 동결 및 융해 후의 원시생식세포의 생존율이 유의적(p<0.05)으로 높음을 확인하였다. 이상의 결과들로부터10% EG + FBS와10% DMSO + FBS 조합의 두 처리구 간에 동결 및 융해 후의 세포생존율의 유의적인 차이는 보이지 않았지만, 동결 배지의 농도별 효율이 높음을 확인했다. 또한 네 품종 간의 동결 및 융해 후의 닭 원시생식세포 생존효율의 비교에서는 상업용 닭, 이사브라운, 오계 그리고 화이트레그혼 품종 순으로 생존율이 높음을 확인하였다. 초자화 동결에 있어서 가장 높은 생존율을 보인 10% EG이 10% DMSO와 함께 최적의 동결보호제로서 사용 가능성을 확인하였다.