• 한국자원식물학회지
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• 제36권5호
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• pp.496-507
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• 2023

화본과 식물 홍띠(Imperata cylindrica 'Rubra')의 기관분화 관련 유전자의 동태와 기내재생체의 유전적 안정성을 조사하고자 기관분화 단계별 재분화체를 작성하여 기관분화 관련 유전자 발현과 ISSR 마커 기반 변이성을 조사하였다. 5종류 총 15개체의 기관분화 단계별 재분화체에서 캘러스 발생 유전자인 FIE는 모식물체 1번을 제외한 14개의 식물체에서 모두 발현되었으며, 뿌리 발생 유전자인 WOX11도 15개의 모든 단계별 재분화체에서 발현하였다. 체세포 발생 유전자인 LEC1B는 15개 식물체에서 모두 발현하였으나 비교적 약하게 발현하였다. 7종류 총 21개체의 기관분화 단계별 재분화체 및 재분화식물체에 대하여 ISSR 분석한 결과, 유전적 다형성은 기관분화 단계별 재분화체 및 순화 재분화체(실내포트 재배식물체 4.1%, 노지 재배식물체 4.3%, 기내배양 홍띠(적색)식물체 4.2%, 녹색신초 발생 캘러스 5.6%, 캘러스 1.4%)에서 대조구인 모식물체(1.4%)와 같거나 높게 나타났다. 또한, 유전적 유사도 지수는 0.747~1.0 사이에 분포하며, 평균 0.868로 나타났다. 군집분석 결과 유전적 유사도 지수 0.809에서 기외 식물체(모식물체, 실내재배 및 노지재배 재분화 녹색 식물체)와 기내식물체 및 재분화 과정상의 분화체(기내배양 중인 홍띠 식물체, 녹색 신초, 적색신초 발생 캘러스, 캘러스)는 독립적인 2개 그룹으로 유집되었다. 이상의 결과는 화본과 식물의 기내배양 시 재분화 과정에서 일어나는 일련의 유전학적 기초자료를 제공해 준다.

• 한국유기농업학회지
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• 제27권3호
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• pp.365-380
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• 2019

본 연구는 봄에 출생한 송아지 10두(3.90±0.26개월령)와 가을에 출생한 송아지 10두(4.10±0.30개월령)를 약 24개월간 조사료와 농후사료를 분리 급여하거나 또는 TMR을 급여하여 분만 후의 유생산과 비유지속성을 조사하였다. 처리구는 사료 급여 형태와 분만계절의 2가지 요인으로 육성기에 조사료와 농후사료를 분리하여 급여하고 봄에 분만한 CS구, 육성기에 조농분리 급여한 후 가을 분만한 CF구, 육성기에 TMR을 급여한 후 봄에 분만한 TS구 그리고 육성기에 TMR을 급여하고 가을에 분만한 TF구의 4가지로 구분하였다. 육성기의 건물섭취량은 분만계절의 영향을 받아 가을에 분만한 구가 봄에 분만한 구보다 높게 나타났으나(P<0.01), 사료급여 방법에 의해서는 유의한 차이를 나타내지 않았다. CP 섭취량과 TDN 섭취량은 분만계절(P<0.05)과 사료급여(P<0.01)에 의해 유의한 영향을 받았으며 가을에 분만한 구가 봄에 분만한 구에 비해 약 1.2% 높게 나타났고 TMR 급여구가 조농분리 급여구보다 약 4.7%정도 높은 결과를 보였다. 평균 산유량과 9, 10개월차의 산유량은 사료급여 방법에 의해 유의한 영향을 받아 TMR 급여구(TS구, TF구)가 조농분리 급여구(CS구, CF구) 보다 높은 결과를 나타내었다(평균 P<0.05; 9개월차와 10개월차 P<0.01). 평균 비유지속성은 분만계절(P<0.05)과 사료급여 방법(P<0.01)에 의해 유의한 영향을 받아 가을에 분만한 구가 봄에 분만한 구에 비해 높은 결과를 보였으며 TMR 급여구가 조농분리 급여구 보다 높은 결과를 나타냈다. 산유량의 결과와 유사하게 비유후기인 9, 10개월차에 사료급여에 의해 통계적 유의차를 보여(P<0.01) TMR 급여구가 약 8% 높았으며, 7개월차(P=0.12)와 8개월차(P=0.09)에도 높은 경향을 나타내었다. 따라서 육성기에 TMR을 급여하고 가을에 분만할 경우 초산우의 산유량과 비유지속성 증진에 효과적일 것으로 사료된다. 평균 유지율은 사료급여의 영향을 받아 TMR 급여구가 조농분리 급여구 보다 7.8% 높았는데(P<0.01) 육성기 TMR 급여가 분만 후 섭취행동에 영향을 주어 반추위의 안정화로 인해 유지율이 증가한 것으로 사료된다. 분만 후 3개월차에는 봄에 분만한 구가 가을에 분만한 구보다 유지방 함량이 낮았으며(P<0.05) 이는 계절적 차이에 의한 것으로 사료된다. MUN은 평균과 4, 5 및 6개월차에 조농분리 급여구에서 유의하게 높았다(4개월차 P<0.01; 5, 6개월차 P<0.05). 체세포수는 평균과 분만 후 3, 4개월차에 TMR 급여구가 조농분리 급여구 보다 높은 결과를 보였다(P<0.01). 결과를 종합해보면, 육성기에 TMR 급여방법을 적용하고 가을에 분만하는 경우 봄에 분만하는 경우에 비해 여름철 고온의 영향을 비교적 덜 받아 산유량과 비유지속성 뿐만 아니라 유지율 등이 개선되어 경제성이 향상되는 효과를 보았다. 그러나 본 실험은 봄과 가을의 분만계절이 미치는 영향만을 보았기 때문에 여름과 겨울의 분만계절의 영향에 대한 추가 실험이 필요할 것으로 사료된다.

• 자연과학논문집
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• 제4권
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• pp.103-142
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• 1991

표식 유전자를 이용하여 체세포 잡종체를 선발하기 위한 연구의 일환으로 감자조직에는 T-DNA를 도입하여 식물호르몬 무첨가 배지에서도 생장가능한 형질전환체을 획득하고, 담배조직에는 NPT H gene을 도입하여 kanamycin에 대해서 저항성을 나타내는 형질전환체를 획득하여 각각의 특성구명과 원형질체를 유리하여 도입된 유전자 marker를 이용해서 융합을 시도한 바 그 결과는 다음과 같다. 1. 감자 괴경에서 Agrobacterium tumefaciens Ach5와 A. rhizogenes ATCC15834를 접종하여 crown gall tumor 및 hairy root를 유기하였으며 이러한 tumor조직은 식물 호르몬 무첨가 배지에서 생장이 가능하였다. 2. 감자에서 유기된 hairy root로부터 callus 형성은 2.4-D 2mg/1 첨가된 MS 배지에서 가장 양호하였으며 casein hydrolysate 1g/1가 첨가하면 유연 한 callus의 증식이 더욱 왕성하였다. 3. Activated charcoal이 0.5~2.0g/1 첨가된 배지에서는 crown gall tumor callus의 절단면이 갈변되는 것을 방지 할 수 있어 생존률을 높일 수 있었으나 hairy root에서는 갈변되어 고사되었다. 4. 2, 4-D 2mg/1와 casein hydrolysate 1g/1를 첨가한 배지에 hairy root callus를 현탁배의한 결과 양호한 많은 callus 덩어리들을 단시간에 얻을 수 있었다. 5. $Tri^-$parental mating으로 NPTII gene이 coding되어있는 binary vector인 pGA643을 wild type 및 disarmid된 Agrobacterium 내에 도입하여 Agrobacterium tumefaciens Ach5/pGA643, A.tumefaciens $A_4T$/pGA643, A. tumefaciens LBA4404/pGA643를 획득하였다. 이 세 개의 conjugant를 사용하여 0.7% agarose gel 상에서 pGA643을 확인하였다. 6. pGA643이 도입왼 Agrobacterium tumefaciens LBA4404와 담배 조직과 동시배양하여 kanamycin $100\mug$/ml 첨가된 배지에 생존하는 callus를 선발하였으며 동일배지에서 callus의 증식이 가능하였다. 7.형질전환된 담배 callus로부터 식물체 형성은 BA 2mg/1를 첨가한 배지에서 가능하였다. 8. 재분화된 담배의 엽조직은 kanamycin.이 $1000\mug$/ml 첨가된 MS 배지에서도 왕성히 callus가 유기되어, 이는 재분화체에서도 NPTII gene이 그대로 유지되고 있음을 확인할 수 있었다. 9. 담배의 정상 shoot와 형질전환된 shoot를 kanamycin이 $100\mug$/ml이 함유된 MS배지에 기내삽목한 결과, 정상 shoot는 발근이 되지 않고 황화 되었으나 형질전환된 shoot는 발근이되었으며 정상적으로 생장을 하였다. 10. 감자의 T-DNA가 도입된 현탁배양 callus는 cellulase 2%, macerozyme 2%, dricelase 1%에서 양호하게 유리되었다. 11. Osmoticum으로서 mannitol 농도 0.8M에서 담배와 감자의 두 조직 모두 원형질체유리가 가장 효과적이었다. 생존력은 T-DNA가 도입된 감자의 hairy root를 callus로 탈분화 시킨 후 현탁배양한 callus가 mannitol 0.5M에서 97%를 나타냈고, 그리고 NPTII gene이 도입된 담배의 엽조직은 mannitol 0.7M에서 94%로 최고를 타나냈다. 12. 원형질체 융합은 PEG solution 처리 15분 후부터 관찰되기 시작하여 20분에 완전히 융합되었고, 융합된 원형질체는 선발 marker인 호르몬 무첨가 및 kanamycin 첨가배지에서 배양 5일 후에 세포벽이 재생되었으며 4주일 후부터 colony들이 관찰되었다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제28권1호
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• pp.21-27
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• 2004

본 연구는 이종간 핵이식란의 생산성 향상에 기여하기 위한 기초연구로서 핵이식 수정란의 융합과 활성화 과정에 있어서 수핵난자 및 전기적 융합조건이 핵이식 수정란의 융합 및 체외 발달에 미치는 요인들을 조사하기 위하여 실시하였다. 도축되어지는 소 및 돼지의 난소에서 난포란을 채취하여 TCM-199 및 NCSU-23에 혈청 및 호르몬을 첨가하여 39$^{\circ}C$, 5% CO$_2$ 배양기내에서 24 및 48시간 체외성숙을 실시하여 수핵난자를 준비하고, 공여세포의 준비는 산양의 귀세포를 채취하여 0.25% Trypsin-EDTA의 처리로 세포를 분리, 배양하여 사용하였으며, 계대배양과 함께 세포는 TCM-199 ＋ 10% FBS ＋ 10% DMSO로 동결을 실시하였다. 핵이식은 성숙된 난자의 극체 및 전핵을 laser system으로 투명대를 drilling 하여 제거하고 준비된 공여세포를 핵이 제거된 난자에 주입하여 전기적 자극으로 융합을 실시하여 융합된 난자는 전기적 자극으로 활성화를 유도하였다. 활성화가 이루어진 복제 수정란은 수핵란이 소난자의 경우 monolayer가 형성된 10% FBS가 첨가된 TCM199 배양액에서 7∼9일 동안 체외배양하였으며, 수핵란이 돼지의 경우 10% FBS가 첨가된 NCSU-3 배양액으로 6∼8일 동안 체외배양을 실시하여 배반포기로 유도하였다. 본 연구에서 얻은 결과를 요약하면 다음과 같다. 전기자극의 세기를 1.95 kv/cm와 2.10 kv/cm로 주었을 때 수핵란이 소 난자의 경우 융합율은 47.7및 44.6%였으며, 분할율도 41.9 및 54.5%로써 차이가 없었다. 수핵란이 돼지 난자인 경우는 융합율은 51.3 및 46.1%로써 차이가 없었으며, 분할율도 75.0및 84.9%로써 차이가 없었다. 전기자극 시간을 30 또는 60${\mu}$sec, 횟수는 1 또는 2회 주었을 때 수핵란이 소 난자의 경우 융합율은 30 ${\mu}$sec 1회(50.8%) 와 2회(31.0%) 간에 차이가 없었으나, 60${\mu}$sec 1회(19.3%)가 가장 낮았다(P＜0.05). 융합란의 분할율은 30${\mu}$sec 1회(53.3%)와 2회(50.0%) 간에 차이가 없었으나, 60${\mu}$sec 1회(18.2%)보다 유의적(P＜0.05)으로 높게 나타났다. 돼지 난자의 경우 융합율은 30${\mu}$sec 1회(48.1%), 2회(45.2%)및 60${\mu}$sec 1회(48.6%)간에 차이가 없었으며, 분할율은 30${\mu}$sec 1회(78.4%)와 60${\mu}$sec 1회 (79.4%)간에 차이가 없었으나, 30${\mu}$sec 2회(53.6%)보다 유의적(P＜0.05)으로 높게 나타났다. 이종간 핵이식란의 체외발달에 있어서 수핵란이 소 난자의 경우 상실배와 배반포기로의 발달율이 22.6%로써 단위발생란 30.6%와 차이가 없었으며, 돼지 난자의 경우는 이종간 핵이식란이 5.1%로써 단위발생란 37.4%보다 유의적(P＜0.05)으로 낮게 나타났다. 이상의 실험결과로 보아 산양의 체세포를 이용한 이종간 핵이식 복제수정란의 생산을 위하여 수핵란으로 소와 돼지를 사용하여 복제수정란의 발달을 확인할 수 있었으며, 이종간 핵이식에 있어서 수핵란, 공여세포, 융합, 활성화 및 배양조건 등 아직 초보 수준에 있으며, 앞으로 보다 많은 연구를 통하여 이러한 문제들이 해결되면 멸종위기 상태에 있는 동물들의 종 보존에도 활용이 가능할 것으로 생각된다.