최근 생쥐에서 정원세포를 이용한 생식선 카이메라의 생산이 보고되었다. 정원세포의 경우 성축으로부터 세포를 다량으로 얻기가 쉬우며, 수용체 정소 내로 이식될 경우 생식선 카이메라의 생산능력이 있어서 이전의 배아줄기 세포를 이용할 때의 문제점을 효율적으로 해결할 수 있다. 또한 유전자가 도입된 정원세포의 이식에 의한 수용체 정소 내에서의 정자형성의 보고는 정원세포를 이용한 형질전환 동물의 생산 시스템으로의 개발 가능성을 보여준다. 본 실험에서는 닭에서 기존에 이용되어 왔던 형질전환 동물 생산 시스템의 문제점을 극복하고자 주령별 정원세포의 분리 및 이식을 통하여 조류에서 정원세포의 이식방법을 확립하고 생식선 카이메라 생산효율을 증진시키기 위하여 불임제인 부설판 등을 이용한 불임화 기술을 확립하여, 결국 조류에서의 형질전환 조류 생산 시스템으로서의 개발가능성을 제시하고자 한다.
Lee, Bo Ram;Lee, Young Mok;Park, Tae Sub;Jung, Jin Geyoung;Hong, Yeong Ho;Lim, Jeong Mook
한국가금학회:학술대회논문집
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한국가금학회 2003년도 제20차 정기총회 및 학술발표회
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pp.69-70
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2003
정원세포는 수컷의 정소에 존재하며, 감수분열을 통하여 정자를 형성하고 지속적으로 자신의 복제가 가능한 세포이다. 이러한 정원세포는 마우스를 중심으로 현재 수컷불임 치료의 연구, 멸종위기 종의 보존을 위한 연구 그리고 형질전환 동물 생산 등 다양한 분야에 응용되고 있다. 그러나 조류에서는 정원세포 연구에 있어서 그 세포의 형태적·면역학적 특성이 아직 구명되지 못하여 연구진행에 어려움이 많다. 따라서 본 연구에서는 전자주사현미경을 이용하여 세포내 구조와 형태의 분석을 진행하였고, 조직염색법을 통하여 특이적 마커를 분석하였다. 이후 본 연구결과를 토대로, 포유류에서 이루어진 정원세포이식기술의 개발 및 새로운 형질전환 기술의 개발을 조류응용이 가능할 것이다.
본 연구는 황소개구리의 정소내 생식세포분화 단계와 정자변태과정중의 정자의 형태적 특징을 알아보기 위하여 조사한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다. 황소개구리의 정자형성과정 중 생식세포는 제1정원세포, 제2정원세포, 제1정모세포, 제2정모세포 및 정자세포로 구성되어져 있으며, 이들 생식세포의 분화단계는 세포의 형태적 특정을 기초로 하여 총 8단계로 구분되어졌다. 제1정원세포를 제외한 정모세포발생 단계에서부터 이탈 전까지의 정자세포는 정낭내에 존재하고 있었다. 정자변태과정은 3단계로 구분되어졌다. 성숙기의 정자의 첨체는 낭상이고, 두부의 모양은 양끝이 가는 원통형이었으며, 꼬리는 단지 축사로만 구성되어져 있었다.
본 연구는 흰넓적다리 붉은쥐(Apodemus speciosus peninsulae)의 세정관 상피주기와 정자세포의 발달 단계를 광학 현미경을 사용하여 조사하였다. 세정관 상피주기는 정모세포의 분화단계와 정자세포의 발달단계를 기초로 하여 9 stages로 나누었다. Ad형 정원세포의 경우 모든 단계에서 관찰되었다. Ap형의 정원세포는 I 단계, In형의 정원세포는 II와 III 단계, B형의 정원세포는 IV 단계에서 관찰되었다. 제 1 감수분열의 전기에 있어서, 세사기는 V와 VI 단계, 접합기는 I 단계에서 부터 IX 단계까지, 후사기는 III와 VII 단계, 복사기는 VIII 단계에서 각각 관찰되었으며, 제 2정모세포의 경우는 IX 단계에서 나타났다. 정자세포의 발달단계는 정자세포의 머리 형태, 핵과 첨체의 발달, 세포질의 형태 변화를 기초로 하여 12 steps로 구분되어졌다. 본 연구의 결과, 흰넓적다리 붉은쥐(A. s. peninsulae)는 정원세포 및 정모세포 출현시기와 정자 발달 단계를 비교해 볼 때 근연종인 등줄쥐(A. agrarius coreae)와 매우 유사한 결과를 나타내었다. 본 연구에서 같은 유형의 세포가 출현하는 시기와 정자 형성에 따른 세대수는 종의 특성에 의한 것이라 생각되며, 이것은 종을 분류하는데 유용한 형질이라 여겨진다.
생체 조직 내에서 표지인자의 발견은 해당 세포의 특성과 기능을 이해하는 데 매우 중요하다. 기존에 밝혀진 돼지 정원세포의 표지인자로는 PGP9.5, PLZF, NANOG, SSEA1 등의 단백질이 알려져 있다. 본 연구에서는 최근 새로이 발굴된 돼지 정원세포 표지인자인 IGFBPs 의 기능을 분석하기 위해 IGFBPs 의 발현과 이를 조절하는 단백질인 PAPP-A 단백질의 발현을 5일령 돼지 정소에서 확인하였다. IGFBP 2, 3, 4, 6 의 발현이 돼지 정원세포 특이적으로 높게 나타났으며 PAPP-A의 발현은 세르톨리세포 특이적으로 나타났다. PAPP-A 의 발현을 PGP9.5, GATA4 등의 표지 인자와 함께 확인해 본 결과 PGP9.5를 발현하는 정원세포에서는 발현하지 않았으며, 세정관 내의 세르톨리세포 특이적으로 발현하였다. 이러한 사실로 미루어 볼 때 세르톨리세포에서 발현하는 PAPP-A 단백질은 정원세포에서 발현하는 IGFBPs 의 조절을 통하여 알려진 바와 같이 IGF axis 를 통해 정소내 세포들의 발달 및 분화를 조절할 것으로 판단된다.
제주땃쥐(Crocidura dsinezumi)의 세정관 상피 주기와 정자세포의 형태적인 특징을 알아보기 위하여 조사하였다. 제주땃쥐의 세정관 상피 주기는 12 stages로 구분되어졌다. Ad형 정원세포는 모든 단계에서 관찰되어졌으며, In형 정원세포는 IV단계에서, B형 정원세포는 V단계와 VI단계에서 관찰되었다. 정자세포의 첨체 발달과 핵의 형태적 변화는 14 steps로 구분되어졌다. 골지, 두모, 첨체, 성숙 및 이탈단계는 각각 $1{\sim}2,\;3{\sim}6,\;7{\sim}10,\;11{\sim}14$ 및 14 step으로 구분되어 나타났다. 이러한 우리의 결과들은 제주땃쥐의 정자 변태 과정에 대한 금후의 연구에 대한 기초를 제공해준다.
소의 위에 기생하는 쌍구흠충(Paromphistomum cewi)에서의 정자형성과정을 광학현미경과 투과전자현미경을 이용하여 관찰하였다 발생중인 모든 세포들은 중앙에 있는 세포질로부터 각 세포들로 이어지는 세포간교에 의하여 서로 연결되어 있어 분열과 분화의 동시성을 위한 영양계를 이루고 있었다 정원세포들은 4세포기까지이며 모두 기정막에 붙어 있었다. 일차정모세포는 8세포, 이차정모세포는 16세포가 영양계를 이루었고, 정세포는 32세포가 영양계를 이루었으며 이 상태에서 변태를 진행하였다 성숙한 정자의 머리는 나사모양이고 첨체는 형성되지 않았으며 2개의 축사를 가지고 있었다 축사의 단면에서 미소관의 배열상태는 9치 유형이었다.
단분화성 정원줄기세포의 장기간 체외배양 중에 확립되는 다분화능 정원줄기세포는 배아줄기세포와 유사한 특성을 가져 3배엽성 세포로 체외분화가 가능하며 기형종을 형성할 수 있다. 본 연구에서는 선행 연구를 통해 outbred 생쥐(ICR strain)로부터 확립된 다분화능 정원줄기세포의 형질전환 가능성을 확인하며, 배아 내로 주입하여 유전적 키메라를 형성하는 효율을 배아줄기세포와의 비교를 통하여 검증하고자 하였다. 다분화능 정원줄기세포를 넣은 배아로부터 태어난 산자는 총 47마리(4.8%)가 태어나, 67마리(11.7%)가 태어난 배아줄기세포군에 비해 그 효율이 낮았다(P<0.05). 그러나 산자들 중의 키메라 생쥐의 비율은 다분화능 정원줄기세포 군으로 부터 3마리(6.4%)가 태어나 배아줄기세포 군으로부터 태어난 5마리(7.5%)와 유사하였다(P>0.05). 태어난 유전자변형 생쥐의 장기를 확인한 결과, 췌장, 심장, 뇌, 근육, 위, 피부, 정소에 GFP가 발현되는 것을 확인하였다. 또한 배아의 근육, 위, 뼈 등에서 anti-GFP 항체의 발현을 확인하였다. 이상의 결과를 종합하면 outbred 생쥐로부터 확립된 다분화능 정원줄기세포가 inbred 생쥐로부터 확립된 배아줄기세포와 마찬가지로 키메라 생쥐를 생산할 수 있는 전분화능을 가짐을 확인하였고, 새로운 유전자변형 동물의 생산을 위한 매개체로서의 가능성을 가진 것으로 여겨진다.
큰발웃수염박쥐 (Myotis macrodactylus)의 세정관 정상피의 분화과정과 미세구조적 특징들은 알아보기 위하여 광학 및 전자현미경을 이용하여 조사하였다. 정자형성 과정은 4월부터 9월까지로 나타났다. 정자형성세포의 미세 구조적 특징에 있어서, A형 (Ad, Ap)의 정원세포는 기저막 위에 위치하며, Sertoli cell에 의해 둘러싸여져 있고, 대부분의 세포는 타원형이다. Ad형은 Ap형 보다 핵과 세포질의 전자밀도가 높은 것이 특징적인 반면에, B형의 정원세포는 구형의 세포로서 A형 정원세포 보다 세포가 크며, Ap형과 마찬가지로 세포질이 밝고, 거의 핵소체가 핵막에 인접되어 있다. 정모세포는 크고 구형이지만, 제 1 정모세포가 제 2 정모세포보다 다소 크다. 정자변태는 골지, 두모, 첨체, 성숙 및 이탈기로 구분하였고, 세포구조물의 특징들에 의해 각각 전 후기로 다시 세분하여 전과정을 9 (기)로 나누었다. 핵질의 변화는 골지후기부터 서서히 응축하기 시작하여, 이탈기에서 완전한 핵을 형성하였다. 정자꼬리의 형성시기는 골지전기에서 형성하기 시작하여 이탈기에서 완성되었다. 동면직전 10월부터 동면기 (11월, 12월, 이듬해 1, 2, 3월)까지는 정자형성 세포의 퇴화과정이 일어났다. 즉 미분화 정자형성 세포들은 세르톨리 세포의 식작용에 의해 포식되어졌는데 이는 동면을 위한 에너지 효율적 이용과 번식조절을 위한 적응 메카니즘이라 여겨진다.
본 연구는 일본산 메추리(Japanese quail)에 대해 다배체의 유기를 목적으로 성숙된 수컷에 일정량의 분열 억제제를 투여하여, 정자 형성과정 중 이에 미치는 영향과 배수성 정자 세포들의 유기 양상을 분석하고자 하였다. 시험은 25∼30주령된 메추리 수컷 50수를 공시하고 체중 100 g당 37 g의 colcemid를 3일간 연속복강 주사한 후 5일째, 10일째, I5일째 및 20일째 정소세포들의 감수분열 양상을 살펴보고자 각 정원세포들의 中期像, 제 1정모세포들의 중기상 및 제 2정모세포들의 중기상의 양상들을 분석하였다. 분석 결과 colcemid 처리에 따른 전체 정소 세포 중 9.4%%가 배수성 세포로 유기된 반면, colcemid를 투여하지 않은 대조구에서는 2.3%만이 배수성 정소 세포를 나타내어 colcemid 처리에 따른 배수성 정자의 유기 가능성을 시사하고 있다. Colcemid 처리 후 10일째 11.7%의 다배수성 정자세포 유기율을 나타내어 처리 중 가장 높은 유기율을 보인 반면, 정원세포로 성숙되기 5일 이전의 대부분 원시 정세포들은 colcemid의 처리 영향을 거의 받지 않는 것으로 나타났다. 따라서 가금류에 있어 분열 억제제 투여에 의한 정자 세포의 배수성 유기는 정자 형성과정 개시 최소 10∼15일 이전의 원시 정세포에 주로 이의 영향이 미치는 것으로 나타나고, 제1, 2감수 분열 중의 방추사의 억제로 인한 배수성의 유기보다는 정원세포들의 유사분열 중 방추사 형성의 억제에 보다 민감하게 작용하여 배수성 정모세포를 형성하는 것으로 생각된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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