• 한국수정란이식학회지
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• 제13권2호
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• pp.117-125
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• 1998

본 연구는 Percoll,Swim-up 그리고 Glass-wool 여과법의 세가지 정자분리 방법에 대한 정자 회수율, 생존율과 첨체반응율, 그리고 체외수정 후 배양시간에 따른 전핵형성율,수정란의 발달율과 세포할구수에 대한 효과를 조사하고자 실시하였다. 도축된 암소로 부터 채취한 난자를 22시간 체외배양 후 성숙된 난자를 체회수정시켰다. 수정 후 배양시간에 따라 존핵율을 조사하였으며 48시간에 분할율,192시간에 배반포기 발달율 및 세포할구수를 각각 비교 조사하였다. 정자의 첨체반응과 생존율은 처리군간에 차이가 없으나 회수율에 있어서 percoll 처리군이 다른 두 처리군보다 유의적으로 높았다(p<0.001).수정 후 배양시간별 전핵형성에 있어서도 percoll 처리군이 다른 두 처리군보다 빨리 진행됨을 볼 수 있다. 분할율에 있어서는 처리군간에 유의적 차이가 없으나.배반포기 발달율과 세포할구수에 있어서는 pecoll 처리군이 다른 두 처리군보다 유의적으로 높았다(P<0.05). 이상의 결과로 보아 percoll 처리에 대한 정자분리 방법은 정자 회수율이 높고 수정시 전핵형성 시간이 단축되어, 그 결과로 배반포기 발달율과 수정란의 세포할구수에 효과적임을 알 수 있었다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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• pp.85-85
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• 2001

본 연구는 돼지 난자의 체외 수정시 sucrose 첨가가 돼지 난자의 다정자 침입율에 미치는 영향을 조사하기 위하여 실시하였다. 돼지 난포란은 0.1% PVA, 3.05 mM D-glucose, 0.91 mM sodium pyruvate, 0.57 mM cysteine, 0.5 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$ FSH, 0.5 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$ LH, 및 10 ng/$m\ell$ EGF가 첨가된 TCM199 배양액에서 42-44 시간 동안 배양하여 체외 성숙을 유도하였으며, 2 mM caffeine과 0.1% BSA가 첨가된 체외수정용 mTBM 배양액에 3% sucorse를 첨가하여 6시간동안 수정을 유도하였다. 수정된 난자의 다정자 침입율을 조사하기 위해 체외수정 후 12, 13 및 14 시간대에 각각 1% orcein으로 염색하여 전핵 형성율을 조사하였다. 돼지 난자의 체외수정시 3% sucorse를 첨가하였을 때, 전핵 형성율을 조사한 결과 대조구에서 미수정, 1, 2, 및 3 PN 이상의 전핵 형성율은 각각 57.6 7.6, 9.7, 및 25%로, 처리구 74.2, 7.6, 13.6, 및 4.5% 에 비교하여 다정자 침입율이 유의하게 높았다(p<0.05). 그리고 3% sucorse를 첨가한 체외수정용 배양액에서 수정을 유도한 후 12, 13, 및 14 시간대별로 나누어 전핵 형성율을 조사한 결과, 수정 후 시간이 경과되면서 다정자 침입율이 증가되는 것을 볼 수 있었다 그러나 대조구 60.7%에 비해서는 각각 32.5, 36.0, 및 33.3%로 현저히 낮은 것을 볼 수 있었다.(Table Omitted). 또한, 3% sucorse가 첨가된 배양액에서 수정된 수정란의 발달율을 조사한 결과, 배반포 생산율은 처리구 21.8%로 대조구 6.9%에 비해 유의하게 높은 것을 확인 하였다. 따라서, 돼지 난자의 체외수정시 3% sucorse첨가는 체외수정란 생산에서 문제가 되고 있는 다정자 침입율을 저하시키고 배발달율을 향상시킴으로서 수정란의 체외 대량생산 효율성은 물론 수정란 이식시 수태율을 증가시킬 수 있을 것으로 사료된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제16권2호
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• pp.139-144
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• 2001

본 연구는 숫소 개체별, 정자의 형태, 정자의 전처리 및 난자의 투명대부착과 미부착별로 현미조작에 의해 난자의 세포질내 단일정자를 주입했을 때 웅성전핵 형성율과 체외발생율을 조사하였다. 1. 숫소 개체별 정자를 이용하여 ICSI를 하였을 때 웅성전핵 형성율은 각각 73.9∼87.0%였고 체외발생율은 33.3∼60.9%를 나타냈다. 2. 신선 및 동결정자와 미부절단 정자와 두부, 미부손상 정자를 이용하여 ICSI를 하였을 때 웅성전핵 형성율은 각각 82.0%, 78.0% 42.2%, 51.1%였고, 체외발생율은 56.0%, 42.0%, 17.8%, 22.2%로서 신선정자를 이용했을 때가 다른 처리군에 비해 높은 전핵형성율과 체외발생율을 나타냈다. 3. 정자를 heparin, BFF, His, Ca Ionophore, I + caffeine 액으로 처리후 ICSI를 하였을 때 전핵 형성율은 66.7∼82.2%였고, 체외발생율은 33.3∼60.6%로서 I + caffeine 처리법이 다른 처리군에 비해 높게 나타났다. 4. 투명대 부착 난자 및 미부착 난자로 ICSI를 하였을 때 전핵형성율은 각각 80.0%, 72.0%였고, 체외발생율은 46.0%, 36.0%로서, 토명대부착 난자가 투명대 미부착 난자에 비해 높은 웅성전핵 형성율과 체외발생율을 나타냈다.

• 한국가축번식학회지
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• 제20권4호
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• pp.413-421
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• 1997

체외에서 포유동물의 난자와 정자의 배양에 관한 연구는 난자의 성숙과정과 수정현상에 대한 많은 새로운 정보를 제공하였다. 동시에 체외수정의 연구로부터 얻은 결과는 또다른 의문을 제기하였다. 특히 동결융해정액을 이용한 돼지체외수정의 경우 낮은 정자의 침입율과 전핵형성율 및 높은 다정자침입(polyspermy)율은 아직도 해결해야할 문제점으로 남아있다. 돼지난자의 성숙에 관한 연구의 성과는 수정후 낮은 전핵형성율을 개선시켰으나 타동물종에 비하면 아직도 매우 낮게 나타나고 있다. 한편 동결정액의 처리를 위하여 caffeine이나 Ca2+와 같은 물질을 수정용 배지내에 첨가하는 등 수정능력획득의 유기를 위하여 여러 가지 방법이 연구되고 있지만 정자의 침입율은 아직도 낮고, polyspermy의 발생율은 높게 나타내고 있다. 따라서 정자의 침입율을 향상시키고 polyspermy를 억제하기 위하여 난관세포와의 공동배양, 난포액을 첨가한 배양액 내에서 정자의 전배양 및 정자농도의 조절은 매우 효과적인 방법으로 이용되어왔다. 그러나 수정란의 체외생산성 향상과 이와 관련된 연구를 보다 효과적으로 수행하기 위해서는 위에서 지적한 문제에 영향을 미치는 요인에 대한 보다 근본적인 이해가 요구된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제21권3호
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• pp.239-246
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• 1997

본 연구는 돼지 난포란의 체외수정시 정소상체 미부정자의 형태학적 정상정자 비율에 따른 수정능의 차이를 조사하기 위하여 실시하였다. 그 결과는 다음과 같다. 1. 정소상체 미부로부터 회수된 전체의 정자중 형태학적 정상정자의 비율에 따른 ( 10%, 10~30%, 50%) 정자침입율과 다정자침입, 전핵형성율 그리고 난자에 침입한 평균 정자수를 조사하였던바, 50%의 정자침입율과 다정자침입은 82.4%와 87.4%로 10% (29.7%, 22.6%)와 10~30% (20.3%, 37.0%)보다 유의하게 높게 나타났다 (p<0.01). 또한, 공시된 난자의 전핵형성율도 50%이상의 형태학적 정상정자를 가진 실험군에서 유의하게 높게 나타났다(p<0.01). 2. 50% 이상의 정상정자를 가진 정소상체 미부정자를 100% (5$\times$105 cells/ml)로 조정하여 수정시킨 후 그 결과를 동결 융해된 사출정자와 비교하였던 바, 다정자침입과 전핵형성율은 정소상체 미부정자 (86.7%, 35.1%)와 동결 융해된 사출정자 (86.0%, 39.4%)간에 차이를 나타내지 않았으나, 정자침입율은 정소상체 미부정자가 79.7%로 동결 융해된 사출정자의 95.5%에 비해 유의하게 낮게 나타났다(p<0.01) 3. 또한, 정소상체 미부정자군에서 난자와 정자의 비율 (1:6000, 1:6650, 1:7700, 1:10000)에 따라 정자침입율과 다정자침입 그리고 전핵형성의 차이를 조사하였던 바, 수정시 난자당 정자의 수가 증가할수록 정자침입율, 다정자침입 그리고 난자에 침입한 평균 정자 수는 함께 증가하는 것으로 나타났다. 그러나, 전핵형성율은 난자당 정자의 수가 1:6000과 1:6650에서 높게 나타났다. 이상의 결과는, 돼지 난포란의 체외수정시 정소상체 미부정자를 사용했을 때, 50% 이상의 형태학적 정상정자를 가진 정자를 사용하면 동결 융해된 정자와 유사한 수정율을 얻을 수 있었으며, 정자의 형태학적 평가는 좀더 효율적인 수정능획득을 위해 선행되어져야 한다는 것을 시사한다고 하겠다.

• 한국가축번식학회지
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• 제27권2호
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• pp.103-113
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• 2003

활성화를 통한 수핵란의 대량확보를 위해 44시간동안 체외 성숙된 돼지 난자를 ethanol, $Ca^{2+}$-ionophore, 6-DMAP 및 cycloheximide의 화학물질들을 사용하여 단위발생을 유기한 후 그들의 가장적합한 처리농도 및 노출 시간을 규명하였다. 1. Ethanol은 10%, 10분 처리가 전핵형성율, 난할율 및 배발달율에 있어 각각 약 53.4%, 51.6%, 그리고 39.9%로 가장 적합한 조건으로 판명되었다. 2. $Ca^{2+}$-ionophore 가장 적합한 난활성화 조건은 25$\mu$M에서 2분간 처리한 것이며, 전핵형성율, 난할율 및 배발달율은 각각 약 59.7%, 62.2%, 그리고 43.9%를 보였다. 3. 6-DMAP를 처리하여 돼지 난자의 활성화를 유기하였을 경우 2mM의 농도에서 각각 약 57.3%, 58.4% 및 29.0%의 전핵형성율, 난할율, 그리고 배발달율을 보여 가장 적합한 조건을 보였으며 2시간~4.5시간 사이의 노출에는 영향을 받지 않았다. 4. Cycloheximide는 5$\mu\textrm{g}$/ml의 농도가 전핵형성율 2.1%, 난할율 47.7%, 배발달율 31.8%로 가장 은 효율을 보였고, 노출시간에서는 4시간~6시간 동안 처리하였을 때 60.5~65.8%, 63.6~66.7% 및 39.0~39.5%로 가장 적합한 조건으로 판명되었다. 이상의 결과들은 돼지 체외 성숙 난자의 활성화에 있어 각 화학물질들의 적합한 조건을 바탕으로한 중복처리 및 병용처리 조건 확립 및 효율적인 수핵란의 확보에 기여할 수 있을 것이다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제3권1호
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• pp.39-44
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• 1999

성선자극호르몬으로 자극된 난소로부터 회수된 사람의 성숙난자의 전핵형성과 초기발생에 정자의 운동성과 성숙도가 미치는 영향을 조사하였다. 세포질내정자주입 (ICSI)은 HEPES-buffer mTCM-199 배양액에서 실시하였다. 체내에서 성숙된 난구세포부착난자를 ICS에 의하여 사정된 운동성 정자 또는 비운동성 정자로 수정하였을 때 운동성 정자로 수정된 난자가 비운동성 정자로 수정된 난자보다 전핵형성율이 높았다 (79.8% vs 51.7% ; p<0.002)). 그러나 체내에서 성숙된 난구세포부착난자를 ICS에 의해 정소 내 운동성 정자 또는 비운동성 정자로 수정하였을 때 운동성 정자와 비운동성 정자 사이의 전핵형성율은 차이가 없었다. 10.0 mM lactate, 0.5 mM pyruvate, 0.2 mM taurine, 1.0 mM glutamine, 2.22 mM MEM amino acids, vitamin 그리고 10% 사람 난포액이 포함된 수정 Tyrode 배지에서 전핵이 형성된 수정란의 초기 발생은 정자의 채취원과 운동성에 관계없이 9∼16세포기로 발생하였다.

• 한국가축번식학회지
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• 제22권4호
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• pp.395-403
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• 1998

본 연구에서는 돼지난자내 원형정자 주입후 수정율과 체외 배 발달을 조사하였다. 원형정자 주입 2시간 전에 인위적 전기자극을 주고 원형정자를 주입했을 때 난자들의 수정율이 주입 직후에 전기자극을 준 것들과 전기 자극을 주지 않은 것들보다 수정율이 높았다. 원형정자와 원형 정자핵을 각각 주입 한 후 전핵 형성율과 전핵 이동율을 조사하였으나 유의차를 발견할 수 없었다. 전핵의 형성과 이동중 미세소관의 움직임을 간접형광면역법 및 공춧점 현미경을 사용하여 조사해본 결과, 난활성 직후 난자의 표층에서 미세소관이 발생해서 이것에 의해 웅성 및 자성전핵이 난자 중심부로 이전됨을 볼 수 있었다. 원형정자와 원형정자핵 주입후 배양 6일째에 각각 25% 와 27%의 배반포로 형성되었고, 8 일째 형성된 배반포를 염색하여 관찰한 철과 세포수가 각각 평균 87에서 99개가 형성되었음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 체외 성숙된 돼지 난자 내에 원형정자 혹은 원형정자 핵을 미세 주입하는 방법에 의해 정상척인 배발달을 하는 돼지 수정란 생산이 가능한 것을 보여주는 것이다.

• 한국가축번식학회지
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• 제17권4호
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• pp.331-337
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• 1994

처녀발생은 난자의 세포질성숙을 투명대경화나 체외수정에 있어 난자 외적요소의 문제점을 배제하고 측정할 수 있는 지표이다. 본 실험에서는 체외성숙시간에 따른 소 난자의 처녀발생활성을 조사하였다. 도살장 난소로부터 회수한 미성숙난포란을 15% 소 태아혈청이 첨가된 TCM 199에서 6시간 간격으로 24~48시간까지 성숙시킨 후 7% ethanol로 7분간 활성화시켰다. 핵성숙과 세포질성숙은 rapid staining에 의해 핵형태와 전핵의 형성 유무로 판정하였다 핵성숙율은 24~48시간 사이 각각 81, 89, 72, 60 및 60%로 체외성숙 36시간에 성숙율이 최고였으나, 반면 감수분열 중기 II 염색체이상은 36시간부터 증가(0~30%)하였다. 에탄올처리에 의한 전핵형성율은 체외성숙 24~48시간에 각각 67, 68, 73, 84 및 87%였고, 그 중 이배체율은 각각 4, 5, 10, 16 및 20%로 성숙시간이 증가함에 따라 증가하였다. 위 실험의 결과 난자의 체외성숙 연장에 따라 전핵형성과 이배체수가 증가되는 것으로 나타났으며, 정상적인 핵성숙에 비해 세포질성숙은 더 많은 성숙시간이 필요한 것으로 나타났다. 이러한 결과들은 소 초기배 체외생산시와 핵치환용 핵수용란 생산시 적정 성숙시간 결정에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

• 한국가축번식학회지
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• 제19권3호
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• pp.205-216
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• 1995

Microtubules와 micrfilaments는 포유동물 난자이 주요한 세포 구조물들로, 이들은 난자의 성숙, 수정 및 배발달시 핵질의 이동과 세포질 분열에 직접 관여하는 것으로 알려져 왔다. 난자내 세포구조물의 정확한 움직임은 정상적인 배 발달을 위해 필수적이다. Microtubules는 $\alpha$, $\beta$- bubulin이 서로 연결되어 이루어져 있으며, 수정시 웅성.자성전핵 움직임과 세포분열시, 유사 및 감수분열시 그 역할을 한다. 생쥐를 제외한 대부분의 동물에서 microbubules의 역할은 수정시 정자가 centrosome을 난자내로 이전하여 sperm aster를 형성함으로써 시작된다고 보고되고 있다. 따라서 정자의 도움없이 배발달이 일어나는 단위발생시 microbubules의 형성은 연구들 사이에 흥미로운 연구대상이 되고 있다. 한편 microfilaments는 세포분열시 세포질을 분할하는 기계적인 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 최근 생쥐 난자에서는 정자의 난자내 융합과 웅성 및 자성 전핵의 이동에 관여한다고 보고되고 있다. 포유동물 난자의 체외성숙, 체외수정을 유도할 때 여러 가지 비정상적인 핵움직임과 세포분열이 관찰되어지고, 낮은 배발달율이 보고되고 있는데, 최근 연구자들은 세포구조물, 즉 microtubules와 microfilaments의 비정상적인 역할에서 기인한다고 보고 있다. 따라서 포유동물 난자의 성숙.수정 및 단위발생시 세포구조물의 움직임과 역할 및 상호관계에 대한 정확한 이해는 체외수정율 및 배발달 향상에 중요한 기초자료로 이용되리라고 본다.