• 미생물과산업
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• 제35권2호
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• pp.2-6
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• 2009

• 한국응용약물학회:학술대회논문집
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• 한국응용약물학회 1993년도 제2회 신약개발 연구발표회 초록집
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• pp.81-81
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• 1993

Reverse transcriptase가 유도되는 것을 SDS-PAGE 및 효소활성 분석으로 확인할 수 있었으며 효소의 정제를 위한 예비실험으로 ammonium sulfate 및 DEAE cellulose ion exchange chromatorgraphy를 시행하였을 때 specific activity의 증가를 보여주므로서 reverse transcriptase의 분자클로닝 후 발현된 효소가 활성을 갖고 있음을 알 수 있었다. pMAL; cRI 재조합 유전자에 있는 protease의 유전자 발현을 유도했을 때 E. coli세포의 성장에 toxic하게 작용함을 관찰할 수 있었다. 이는 발현된 protease가 E. coil의 번식에 영향을 주는 것으로 믿어지며 Protease의 유전자 발현을 위한 host의 선택, inducer의 첨가시간 등 실험조건의 확립이 필요할 것으로 사료된다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제41권1호
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• pp.17-25
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• 2013

메탄올 자화효모 Hansenula polymorpha에서 분비 발현이 잘 된다고 보고된 인체 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 융합단편으로 사용하여 외래 재조합 단백질을 효과적으로 분비 발현할 수 있는 발현시스템을 개발하고자 하였다. 이때 조작의 용이성 및 발현 효율 제고를 위하여 전장의 HSA 뿐만 아니라 세 종류의 각기 다른 크기의 HSA 단편을 설계하여 융합단편으로 사용하였다. 즉 HSA의 N-말단으로 부터 각기 137, 172, 320, 608개 아미노산을 갖는 융합단편 HSAft (1-4)를 제작하였다. 아울러 발현되는 HSA 단편의 검출 및 분리정제를 위한 His8-tag, HSA 융합단편과 외래 단백질간의 유연성을 부여하기 위한 2조의 $Gly_4Ser_1$ linker, 융합 발현된 타겟 단백질을 HSA 단편으로부터 용이하게 분리하기 위한 담배식각바이러스 단백질분해효소(tobacco etch virus protease, Tev) 인지 서열, 타겟 단백질 유전자를 클로닝하기 위한 멀티 클로닝 사이트(multiple cloning site, MCS)서열, 그리고 타겟 재조합 단백질의 발현 검출 및 정제를 위한 Strep-tag을 포함하는 작용기 도메인을 발현카세트 기본 골격에 포함시켰다. 이렇게 구축된 4종의 HSA 융합단편 분비발현 벡터를 H. polymorpha에 형질전환한 후 각 융합단편의 발현을 조사한 결과 HSAft 단편 3, 4의 발현을 확인할 수 있었다. 녹색형광단백질 유전자 ($GFP_{uv}$)를 상기 벡터에 클로닝한 후 H. polymorpha에 도입한 결과 형질 전환체 모두에서 녹색형광단백질의 발현을 관찰 할 수 있었다. 해당 세포로부터 분비되거나 세포내에 발현되는 HSA 단편 융합 형광단백질의 발현양을 비교한 결과 HSAft 단편 4에 융합된 경우를 제외하고 나머지 경우 모두에서 세포 파쇄액과 세포 배양액 양쪽에서 해당 HSA 단편 융합 형광단백질의 발현을 확인 할 수 있었다. 한편 HSA 융합단편의 크기에 따라 자체 혹은 타겟 단백질과 융합된 형태의 단백질 분비 발현 정도가 달라지는 것은 해당 단백질의 접힘이나 단백질 분해효소에 대한 민감성 등 여러 변수에 의한 것으로 사료되며 따라서 본 연구에서 개발한 H. polymorpha용 HSA 융합단편 분비발현 시스템은 특정 외래 재조합 단백질의 효율적인 분비발현 융합단편의 선별 및 과발현 시스템 구축에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

• 한국어류학회지
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• 제19권2호
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• pp.83-87
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• 2007

어류 에드워드감염증에 대한 예방 재조합 ghost 백신을 개발하기 위한 연구의 일환으로 어류 병원성 세균인 Edwardsiella trada를 대상으로 플라스미드 형질전환을 실시하고 형질전환 안정성을 평가하였으며, 형질 도입된 재조합 ghost 세균의 E-lysis 유전자 발현을 분석하였다. E. tarda를 대상으로 한 ghost 유도는 대장균에 비해 상대적으로 장시간의 반응 시간이 요구되며 lysis의 개시가 지연된 점을 고려 시 발현된 E protein의 용해 능력 또는 E-gene의 전사발현 양이 E. tarda에서 다소 약화되는 것으로 나타났다. 그러나 대장균에 비해 ghost 유도 속도가 다소 낮음에도 불구하고 반응이 완성되었을 시점에서의 E. tarda의 ghost 효율은 대장균과 전혀 차이가 없이 99.99% 이상의 유도효율을 나타내었다.

• 한국생물공학회:학술대회논문집
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• 한국생물공학회 2000년도 추계학술발표대회 및 bio-venture fair
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• pp.651-654
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• 2000

본 연구에서는 재조합 E. coli 시스템에 의한 재조합 cystein proteinase의 대량 생산을 위하여 4L 회분 배양 및 최적 지수 생장기에서의 IPTG- induction을 연속적으로 실시하였다. 발현된 rPwCP1 양은 진탕 배양 시스템에서의 결과와 비교해 볼때 현저하게 향상되었음을 알 수 있었으며, 더불어 metal affinity chromatography 방법으로 처리하여 전기영동을 수행한 결과, 목적 재조합 단백질만을 정제 및 농축시킬 수 있음이 확인되었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제20권3호
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• pp.348-354
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• 1992

SUC2 유전자를 가진 재조합 Saccharomyces cerevisiae의 invertase 생산성을 향상시키기 위하여 균체 생육과 유전자 발현에 미치는 아미노산과 용존산소 농도의 영향을 연구하였다. 균체 생육과 invertase 발현에 적합한 leucine과 histidine의 최적 첨가량은 탄소원인 포도당에 대한 비율로서 나타내어 0.03g/g glucose와 0.04g/g glucose였다. 회분배양에서는 통기량이 적을수록 invertase 비활성이 증가하였다. 희석율 0.09h에서 용존산소농도를 조절한 연속배양에서는 요존산소농도가 감소함에 따라 유전자 발현이 잘되어 5 포화 이하일때 invertase 비활성이 급격히 증가하여 통기를 하지 않은 조건에서 125.54KU/g cell의 최고 비활성을 얻었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제40권4호
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• pp.348-355
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• 2012

본 연구에서는 S. cerevisiae와 P. pastoris에서 bovine pancreatic (bp-) DNase I의 과발현과 재조합 DNase I의 특성을 조사하였다. bp-DNase I 유전자는 GAL10 promoter, $MF{\alpha}$, GAL7 terminator 사이에 삽입하여 재조합 plasmid인 pGAL-$MF{\alpha}$-DNaseI (6.4 kb)를 구축하였다. 그리고 bp-DNase I 유전자를 AOX1 promoter, $MF{\alpha}$, AOX1 terminator 에 삽입하여 재조합 plasmid인 pPEXI (8.8 kb)를 구축하였다. 재조합 plasmid인 pGAL-$MF{\alpha}$-DNaseI과 pPEXI를 각각 S. cerevisiae와 P. pastoris 숙주세포에 형질전환시켰다. 형질전환된 효모세포들을 galactose와 methanol 배지에서 $30^{\circ}C$, 48시간 배양하면 bp-DNase I은 대부분이 배양 상등액으로 과발현되었다. P. pastoris 형질전환체는 배양 상등액에서 45.5 unit/mL의 DNase I 활성을 보였으며, 반면에 S. cerevisiae 형질전환체는 37.7 unit/mL의 DNase I 활성을 보였다. 또한 DNA 분해 특성을 조사한 결과, P. pastoris 재조합 DNase I으로 기질 DNA(calf thymus)를 처리하였을 때 1분 이내 DNA가 분해되는 것을 확인할 수 있었으며 이는 상업용 bp-DNase I과 S. cerevisiae 재조합 DNase I으로 처리했을 때보다 빠른 분해 패턴을 보였다.

• 한국생물공학회:학술대회논문집
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• 한국생물공학회 2001년도 추계학술발표대회
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• pp.99-102
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• 2001

본 연구에서는 히루딘을 생산할 수 있는 재조합 S. cerevisiae 에서 ‘히루딘 유전자의 copy number 와 히루딘 발현양과의 관계를 규명하였으며 , ${\delta}$ 서열을 이중으로 사용한 히루딘 발현벡터를 제조하여 히루딘 유전자의 효모염색체로의 도입효율을 증가시켰다. 숙주세포인 효모의 GALl 유전자를 파쇄하여 균체에 의한 갈락토스 소모를 방지하여 보다 경제적으로 히루딘을 생산할 수 있는 시스템을 개발하였으며, 재조합 H. polymorpha을 이용한 발효공정에서 히루딘 생산을 위한 최적의 메탄올 농도를 결정하였다.

• 한국정보통신학회:학술대회논문집
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• 한국정보통신학회 2016년도 춘계학술대회
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• pp.711-714
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• 2016

재조합 베큘로바이러스는 cytomegalovirus (CMV) promoter, polyhedron promoter, vesicular stomatitis virus G (VSVG), enhanced green fluorescent protein (EGFP), protein transduction domain (PTD) 유전자로 구성된다. 본 재조합 베큘로바이러스 벡터는 세포주와 조직에 감염시켰고 그 결과 다른 벡터 시스템에 비교하여 재조합된 유전자의 전이와 유전자 발현에 있어서 새로운 가능성이 발견되었다. 본 재조합 베큘로바이러스 시스템의 유전자의 전이와 발현의 효율은 타 벡터시스템 보다 우수하였다.

• KSBB Journal
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• 제23권3호
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• pp.205-212
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• 2008

본 연구의 목적은 위치특이적 펩타이드 및 단백질을 사용하여 재조합 대장균에서 활성형 인간 상피세포성장인자(hEGF)를 고효율로 발현할 수 있는 방법을 찾아내는 데 있다. 재조합 대장균내 cytoplasm 및 periplasm 영역에서 hEGF의 발현을 위해 각각 세개의 응합 펩타이드 및 단백질을 선정하여 상호 비교하였다. 재조합 대장균에서 hEGF의 발현유도시 대부분 불용성 단백질로 생산되는 현상을 극복하기 위해 cytoplasm영역에서는 ATS, thioredoxin, 리파제를 융합파트너로 사용하였으며 periplasm 영역에서는 foldase인 DsbA와 DsbC, 용융성 고발현 단백질인 maltose binding protein을 선택하여 사용하였다. Periplasm영역에서 발현유도를 시키는 융합단백질의 경우 cytoplasm영역에서의 발현양도 용융성 형태로 고발현 되는 것을 알 수 있었으며 전체적으로 약 2배가량의 용융성 형태로 발현되었다. hECF의 발현율을 가장 높일 수 있는 융합단백 질은 maltose binding protein이었으나 발현된 융합단백질의 24%가 불용성 단백질로 형성되어 활성형 형태로 얻는 데 한계가 있었으며, 활성형 형태로 hEGF의 발현을 위해서는 DsbA를 응합단백질로 사용한 경우에 18.1 mg/L로 가장 높은 발현농도를 보였다. Cytoplasm 영역에서 발현유도를 한 경우에는 ATS와 thioredoxin을 응합파트너로 hEGF를 발현한 경우 용융성 형태로 높은 발현율을 보였다. 특히 ATS와 같은 펩타이드를 N-말단에 융합시킨 경우 불용성을 방지하는 효과를 보여 이황화결합의 불완전성이나 소수성으로 인해 불용성 단백질로 발현되는 기존의 단백질을 활성형 형태로 발현하는데 될 수 있음을 확인할 수 있었다.