현재 시판되고 있는 정장용 생균 제제에 함유되어있는 정장 균주의 하나인 Bifidobacterium bifidum은 항결핵제 중 rifampicin에 감수성으로 rifampicin과 병용 투여시 본래의 정장 효과를 기대할 수없다. 따라서, rifampicin에 내성인 돌연변이 균주를 얻기 위해 B. bifidum을 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG)로 처리하여 rifampicin에 내성인 30 종의 균주를 선별하였고, rifampicin에 대한 Minimal Inhibitory Concentration (MIC)를 측정해 본 결과 내성이 1,000 배 이상 상승하였다. 균주 동정을 위하여 fructose-6-phosphate phosphoketolase test를 실시해 본 결과 Bifidobacterium임이 확인되었다. 이들 내성 균주들의 유기산 생산량을 측정하여 그 생산량이 모균주와 가장 유사한 3 종의 균주를 선발하였다. 이들에 대하여 Escherichia coli 생육 억제능을 시험해 본 결과 E. coil 생육 억제능이 모균주와 유사하였다. 또, rifampicin을 함유한 배지에서 돌연변이 균주를 배양시킨 경우 rifampicin이 안정한 상태로 잔존한 것을 알 수 있었다. 이것으로 보아 돌연변이 균주들은 rifampicin을 분해 또는 변형시키는 효소를 생산하지 않는다고 볼 수 있다. 이상의 결과로 본 연구에서 개발한 돌연변이 균주들, 즉 B. bifidum RFRll, RFR21 그리고 RFR61은 rifampicin에 내성이면서 모균주와 동일한 생화학적 특성을 갖는 정장 균주로 여겨진다.
현재 시판되고 있는 정장용 생균 제제에 함유되어있는 정장균주의 하나인 Bifidohacterium bifidum은 항결핵제 중 rifampicin에 감수성으로 rifimpicin과 병용 투여시 본래의 정장 효과를 기대할 수 없다. 따라서, rifampicin에 내성인 돌연변이 균주를 얻기 위해 B. bifidum을 N-methyl-N'-nitro-N-nitroso- -guanidine(MNNG)로 처리하여 rifampicin에 내성인 30종의 균주를 선별 하였고, rifampicin에 대한 Minimal Inhibitory Concentration(MIC)를 측정해 본 결과 내성이 1,000배 이상 상승하였다. 또한 rifampicin에 내성인 균주 RFR61을 자연 돌연변이시켜 ofloxacin에도 내성인 돌연변이 균주 20종을 선별 하였고, MIC를 측정한 결과 내성이 4배 이상 증가하였다. 또, fructose-6-phosphate phosphoketolase test를 실시해 본 결과, 모두 Bifidobacterium임이 확인되었다. 유기산 생성량을 측정하여 모균주의 유기산 생성량과 가장 유사한 3균주, B. bifidum RFRll, RFR21, RFR61 그리고 OFR9을 선별하였다. 이 네 균주의 E. coli 생육 억제능을 측정한 결과 모두 모균주와 유사한 E. coli 생육 억제능을 가지고 있었다. Rifampicin 내성균주들에 대하여 내성 유지 시험을 한 결과 복귀 돌연변이에 의해 내성이 소실될 가능성은 없는 것으로 여겨진다. 마지막으로, 내성 균주에 의한 rifampicin 불활성화 여부를 알아 본 결과 rifampicin이 불활성 화되지 않음을 알 수 있었다. 이상의 결과를 통해 본 연구실에서 개발한 B. bifidum RFR11, RFR21 그리고 RFR61 균주들은 rifampicin에 내성이며, B.bifidum OFR9은 rifampicin과 ofloxacin에 이중 내성을 갖는 균주로서 모균주와 유사한 생화학적 특성을 갖는 우수한 정장 세균으로 여겨진다.
벼의 적색 종피 표현형질은 Rc 혹은 Rd 그리고 RdRc 두 개의 복수유전자에 의하여 결정된다. 본 연구에서는 종피에 색소가 있는 돌연변이 벼 7계통을 벼 표현형 돌연변이 군들로부터 분리하였다. 이들 종피색의 돌연변이 형질을 조사한 결과 두 개의 변이체가 갈색의 종피형질을 가졌으며 네 개의 변이체가 적색의 종피형질을 가졌다. 그리고 한 개의 변이체는 종피에 색깔이 없었다. 수확 후 종자의 종피색 표현형질에 관한 정밀조사를 실시한 결과 두개의 갈색종피 돌변이체는 Rc 유전자형 이었으며 네개의 적색종피 돌변이체는 RdRc 유전자형이었다. 또한 종피에 색깔이 없는 한 개의 돌변이체가 Rd 유전자형이었다. 이들 중 동일한 종피색깔을 나타내는 돌연변이 개체들이 단일 돌연변이 개체의 후손인지 여부를 판명하기 위하여 돌변이체들의 초형과 농업형질을 조사한 결과 동일 종피색 돌변이체들의 형질이 서로 상이하므로 각각 서로 다른 돌연변이 계통들로 확인되었다. 그리고 이들 종피색깔 돌연변이들은 초형, 분얼 특징, 임성과 수량성 등을 포함한 농업형질들이 정상 벼의 농업형질들보다 대체로 빈약하고 또한 높은 탈립성을 보였다. 이러한 종피색과 관련된 돌연변이 벼 유전자원은 안토시아닌과 폴리페놀이 풍부하므로 병충해 저항성 품종과 환경스트레스 내성 품종의 육종에 필요할 뿐만 아니라 종피의 색깔을 결정하는 유전자들의 기능을 밝히는 데 중요한 자료로 사용될 것이다.
In vitro SOS chromotest 실험계에서 콩된장 메탄올 추출물의 경우 100 ${\mu}$g/assay 첨가시 97%의 돌연변이 억제효과를 70% 콩된장 메탄올 추출물은 87%의 억제효과를 가졌고, 청국장, 미소, 원재료인 콩과 콩/밀가루 메탄올 추출물보다 높은 저해 효과를 보였다. 된장의 메탄올 추출물을 더욱 분획하여 얻어진 분획물들, 즉 헥산, 메탄올, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획물을 100 ${\mu}$g/assay 첨가했을 때 MNNG에 대한 돌연변이 억제효과는 각각 73%, 73%, 91%, 95%, 82%, 73%로 전반적으로 매우 높은 저해효과를 나타내었으며, 특히 디클로로메탄과 에틸아세테이트 분획물의 항돌연변이 효과가 가장 높았음을 관찰할 수가 있었다. 초파리의 wing hairs spots 시스템의 small mwh spots의 경우, $AFB_1$ 단독 처리군을 체세포 돌연변이 유발 100%로 기준해서 된장 메탄올 추출물 2.5%, 5% 첨가농도의 경우, 각각 22%, 30%의 낮은 항돌연변이 효과를 나타내었다. 분획물들 중 가장 활성이 높았던 된장의 에틸아세테이트 분획물 5%, 10% 첨가농도의 경우, 각각 97%의 높은 항돌연변이 효과를 가짐으로 낮은 농도에서부터 강하게 체세포 돌연변이를 억제함을 알 수 있었고, large mwh spots의 경우는 된장의 에틸 아세테이트 분획물 5%의 낮은 농도에서 체세포 염색체 재조환이나 mwh+ 좌위에 유전자 돌연변이를 현저하게 억제하는 것으로 나타났다. 이상의 결과로부터 된장 메탄올 추출물은 다른 콩 관련 발효식품과 콩의 메탄올 추출물에 비해 in vitro SOS chromotest에서 높은 돌연변이 유발 억제 작용을 나타냈고 분획물들 중 에틸아세테이트 분획물은 in vitro와 in vivo 돌연변이 유발실험에서 가장 높은 저해효과를 나타내어 된장의 항돌연변이 활성을 가지고 있는 분획물로 추정되어진다.
본 연구에서는 해조류의 항돌연변이 및 항암 생리활성물질을 검색하여 발암물질 생성 방지 및 생체 방어 물질로서의 이용 가능성을 검토하고자 Ames test를 이용하여 직접돌연변이원인 MNNG와 간접돌연변이원인 $AFB_1$에 대한 항돌연변이 효과 및 암세포 증식 억제 효과를 알아보고자 하였다. $AFB_1$에 대해서 괭생이모자반(S. horneri)이 실험에 사용된 다른 해조류들 중에서 가장 높은 돌연변이 억제 효과를 보였다. 첨가농도 1.25mg/plate일 때, 괭생이모자반의 acetone+methylene chloride 추출물과 methanol 추출물은 각각 96%, 91%로 실험에 사용된 다른 해조류들의 추출물들 중에서 가장 높았으며 양성 대조군인 다시마의 용매 추출물보다도 높은 돌연변이 억제 효과를 보였다. $AFB_1$과 같은 농도인 0.6mg/plate의 농도의 MNNG를 사용하여 S. typhimurium TA100 균주에 대한 해조류의 항돌연변이성 실험을 한 결과, 간접 돌연변이원인 $AFB_1$에 비해 직접 돌연변이원인 MNNG에 대해서는 다소 항돌연변이 효과가 떨어지지만, 여기서도 실험에 사용된 해조류들의 돌연변이 억제 효과를 살펴볼 수 있었으며 acetone+methylene chloride 추출물의 경우가 methanol 추출물보다 다소 높은 활성을 나타내었다. 항돌연변이 실험에서 효과가 뛰어난 괭생이모자반과 짝잎모자반을 중심으로 인체 암세포(위암세포, AGS 및 결장암 세포, HT-29) 증식억제효과를 살펴본 결과, 용매 추출물을 0.5%, 1% 및 2%의 농도별로 암세포에 처리했을 때 acetone+methylene chloride 추출물과 methanol 추출물은 둘 다 가장 낮은 농도인 0.5%에서부터 농도 의존적으로 암세포 증식 억제 효과가 증가하였다. 이상의 7종의 갈조류 추출물들은 Ames test에서 높은 항돌연변이 효과를 나타냈을 뿐만 아니라 괭생이모자반 및 짝잎모자반은 인체 암세포에 대해서도 높은 증식 억제 효과를 나타냄을 살펴 볼 수가 있었다.
1) 급성독성시험: 랫드와 마우스 공히 투여후 5~6일에 농도의존적의 강한 독성이 발현 되었으며 표적장기로는 소화기계, 임파계, 조혈기계 등으로 나타났다. 랫드에서의 반수 치사량은 암수 각각 771.9(505.6~1178.4)mg/kg과 479.8(302.7~760.4)mg/kg이었으며 마우스에서는 암수 각각 527.4(393.7~701.1)mg/kg과 463.0(308.8~694.2)mg/kg 이었다. 2) 유전독성: S. typhimurium을 이용한 복귀돌연변이시험, CHL세포를 이용한 염색체이상 시험, 마우스에서의 소핵시험결과 DA-125는 돌연변이 유발능을 갖는 것으로 나타났다. 3) 국소자극성: 혈관주위주사에 의한 피부자극성 시험결과 DA-125는 adriamycin의 3배 용량에서 궤양, 괴사등 유사한 병변이 유발되었으나, 병변회복은 adriamycin에 비해 빠른 것으로 나타났다. 또한 토끼에서의 안점막자극시험 결과에서 DA-125는 실제적으로 자극이 없는 것으로 나타났다.
본 연구에서는 식물 종자들 중에서 특히 $\alpha$-linolenic acid의 급원으로 대표적인 아마씨와 들깨를 중심으로 Ames 실험을 이용한 돌연변이 유발 및 인체 암세포 증식 억제 효과에 대해 비교 검토하였다. 간접돌연변이 $AFB_1$ (0.7 mg/plate)에 대해 들깨 메탄올 추출물은 농도의 증가와 더불어 돌연변이 억제효과가 증가하였다. 첨가농도 2.5 및 5 mg/plate일 때 각각 86% 및 94%의 돌연변이 억제 효과를 나타내었다. 아마씨 메탄올 추출물의 경우도 첨가농도 2.5 및 5 mg/plate일 때 각각 74% 및 75%의 항돌연변이 효과를 보였다. 직접 돌연변이인 MNNG (0.6 mg/plate)에 대한 들깨 및 아마씨 메탄올 추출물의 항돌연변이성 실험을 한 결과, 첨가농도 1.25 mg/plate일 때부터 활성이 나타나 5 mg/plate 일 때는 각각 78, 63%의 돌연변이 억제 효과를 나타내었다. S. typhimurium TA100 균주에 대한 $AFB_1$과 MNNG의 돌연변이 유발실험에서 두 가지 종자인 들깨와 아마씨는 직접돌연변이원에 대해서보다는 간접돌연변이원에 의해 유발된 돌연변이 저해에 더 효과적이었으며 들깨에 의한 항돌연변이 효과가 더 우수하였음을 관찰할 수가 있었다. 한편, 아마씨 메탄올 추출물을 0.5, 1, 2 mg/ml의 농도별로 인체 위암세포(AGS)에 처리했을 때 농도 의존적으로 암세포 증식 억제 효과가 증가하여 1 mg/ml 첨가농도에서 64%의 암세포 성장 억제 효과를 보였고, 2 mg/ml 농도에서 79%의 높은 암세포 증식 억제 효과를 나타내었다. 들깨 메탄올 추출물의 경우도 아마씨 메탄올 추출물과 유사하게 농도의존적으로 암세포의 증식을 억제시켰으며 첨가농도 2 mg/ml일 때 68%의 증식 억제효과를 살펴 볼 수가 있었다. 인체 결장암세포(HT-29)의 경우, AGS 세포에 처리했을 때처럼 아마씨 메탄올 추출물은 첨가농도 0.5 mg/ml에서부터 활성을 타나내어 첨가농도 2 mg/ml에서는 72%의 암세포 증식 억제효과를 나타내었다. 들깨 메탄올 추출물의 경우 첨가농도 0.5 mg/ml에서는 43%의 억제효과를 나타내었으나 첨가농도 2 mg/ml에서는 64%로 결장암세포의 증식을 억제시켰다. 인체 간암세포(Hep 3B)에 의한 증식 억제효과는 이상의 암세포에 대한 효과보다 다소 낮았으나 아마씨 및 들깨 메탄올 추출물은 첨가농도 2 mg/ml에서 각각 65% 및 59%의 저해효과를 나타내었다.
대장균 트립토판 중합효소(tryptophan synthase) $\alpha$ 소단 위체의 96번, 139번 과 258번 자리를 돌연변이 시킨 이중 돌연변이체 P96L/F139W, P6L/F258W와 삼중 돌연변이체 P96L/F139W/F258W의 효소 활성도와 형광 분광계를 이용한 분광학적 성질을 조사하였다. 이중 돌연변이체의 효소 활성도는 야생형과 유사하나 삼중 돌연변이체는 40% 감소된 활성도를 가진다. P96L/F139W 와 P96L/F258W의 형광세기는 야생형에 비해 감소하였으나 P96L/F139W/F258W는 야생형에 비해 증가하였다. 효소 활성도와 형광 결과는 96번의 치환이 8번 알파구조와 4번 베타 구조와 4번 알파구조 사이의 loop의 안정성에 영향을 준 것을 나타낸다. 이 결과로부터 P96L/F139W/F258W는 야생형과 다른 3차 구조를 가지나 139번과 258면 주위는 더 조밀한 구조를 가지고 있다는 것을 보여준다.
대두의 돌연변이육종을 함에 있어서 돌연변이기의 효율적인 선발법을 확립하기 위하여 M_1세대의 초장 및 주당종자수와 M_2세대의 돌연변이 출현과의 관계 그리고 M_1 식물체의 키메라에 대해 조사한 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 30kR의 감마선을 종자에 처리하였을 때 M_1초장의 분포는 무처리에 비해 45-68% 감소되는 개체가 전체의 63.7%를 차지하였으며 이 범위에 속하는 집단내에서 엽녹소변이는 71.4%, 가시적 형태변이가 62.3%를 차지하였다. 2. M_1주당종자수는 6-15개인 개체가 전체의 58.9%를 차지하였고 이때 엽녹소변이는 55.3%, 가시적 형태변이는 63.4%를 차지하였다. 3. M_1 집단에서 초장과 주당종자수는 통계적으로 유의한 정의 상관이 있었다. 4. M_1의 초장의 장해가 심하고 주당종자수가 적을 수록 M_2에서 가시적 형태변이의 출현율이 높았으며 반대로 엽녹소변이는 초장장해가 적고 주당종자수가 많을수록 변이출현율이 높은 경향이었다. 5. 변이가 일어난 M_2 family의 변이의 sector 크기는 M_1주당종자수 적을수록 크게 나타났다. 6. 엽녹소변이를 대상으로 M_1식물체의 꼬투리별로 돌연변이의 출리양상을 보면 식물체의 부위별로 일정한 경향이 없이 임의로 발생하였다. 7. 대두의 돌연변이육종을 효율적으로 수행하기 위해서는 종자에 고선량의 방사선을 처리할 것과 M_1의 주당종자수가 적은 개체를 수확하여 M_2에서 집단으로 양성할 것을 추천한다.
본 연구에서는 비교적 양질의 영양소를 가진 현미 및 율무 메탄올 추출물의 항돌연변이 및 인체 암세포 증식억제 효과에 대하여 알아보고자 하였다. Ames test를 이용한 돌연변이 억제 실험에서 $AFB_1$ (0.6 mg/plate)에 대해 현미 메탄올 추출물은 농도의 증가와 더불어 돌연변이 억제 효과가 증가하여 첨가농도 2.5 및 5 mg/plate일 때 각각 70% 및 76%의 억제 효과를 나타내었다. 율무 메탄올 추출물의 경우도 첨가농도 2.5 및 5 mg/plate일 때 각각 60% 및 76%의 항돌연변이 효과를 관찰 할 수가 있었다. 직접돌연변이원인 MNNG에 대해서도 현미 및 율무 메탄올 추출물들은 첨가농도 5 mg/plate에서 각각 79% 및 69%의 항돌연변이 효과를 나타내었다. 인체 위암세포(AGS)에 현미 메탄올 추출물을 5, 10, 20 mg/ml의 농도별로 처리했을 때 농도 의존적으로 암세포 증식 억제 효과가 증가하였다. 율무 메탄올 추출물의 경우도 현미 메탄올 추출물과 유사하게 농도 의존적으로 암세포의 증식을 억제시켰으며 첨가농도 20 mg/ml일 때 77%의 증식 억제효과를 살펴 볼 수가 있었다. 인체 결장암세포(HT-29)의 경우에서도 이들 현미 및 율무추출물은 낮은 농도에서부터 그 억제효과가 나타나 농도 의존적으로 암세포의 증식을 억제시켰다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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