포항근해의 정점을 대상으로 1995년 4월부터 1996년 1월까지 3개월 간격으로 종속영양세균과 원유분해세균의 분포를 조사하였다. 또한, 분리된 원유분해세균의 단일 및 혼합배양을 통하여 원유분해능도 조사하였다. 종속영양세균의 분포는 4.1 $\times$$10^4$ - 1.2 $\times$$10^5$ CFU/$m\ell$ 이었으며 종속영양세균에 대한 원유분해세균의 분포비는 0.05 -0.54%로서 지금까지 보필된 타지역보다 낮은 수치였다. 이 결과에서 포항근해의 원유분해세균의 분포는 육지로부터 유입되는 석유계 탄화수소에 의하여 크게 영향을 받는것으로 사료된다. 원유분해능이 우수한 26 균주를 분리.동정한 결과 Acinetobacter spp., Bacillus spp., Citrobacter spp., Micrococcus spp., Moraxella spp., Rhodococcus spp., 그리고 Berratia spp. 등의 7개 속이 나타났고, 장내세균의 출현은 해수내 오수의 유입을 반영하고 있었다. 또한 Bacillus 속 균주가 포항근해의 원유분해세균의 우점종으로 밝혀졌다. 원유분해세균을 이용한 플라스크 배양에서 원유분해는 혼합배양에 의해 증가하였다.
남해안에 위치한 원유저장기지내의 각 정점으로 부터 원유분해세균을 분리하여 동정한 결과 Pseudomonas fluorescens, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas maltophila, Pseudomonas aeruginosa 등으로 동정되었다. 원유를 탄소원으로 첨가한 최소배지상에서 원유분해능을 나타내었으며, 0.5%에서 6%까지의 NaCl 농도변화에 대한 원유분해능을 비교한 결과 5종의 원유분해균이 NaCl의 농도가 증가하였을 경우에는 원유분해능이 상실됨을 확인하였다. 또한 원유는 복잡한 유기화합물로 구성이 되어 있어 분리된 원유분해균이 n-decane, n-hexane, n-octane, n-dodecane 등의 간단한 탄화수소를 자화하는지를 확인하였다. 분리된 원유분해균이 plasmid를 가지는 지를 확인한 결과 Pseudomonas fluorescens 및 Pseudomonas aeruginosa 등에서 분자량이 매우 큰 plasmid가 존재함을 확인하고 ampicillin, tetracycline 및 chloramphenicol등의 항생제에 대한 내성을 조사한 결과 내성을 나타내어 원유분해에 관련된 유전자와 항생제내성을 나타내는 유전자가 plasmid상에 존재할 가능성이 높음을 알수 있다.
유질은 성분과 위생상태로 결정되어 진다. 질/위생은 사람건강 보호와 적정소비에 대한 관점에서 보면 장점인 영양적 중요성에서 오는 욕망을 이르키는 성질과 일정범위의 좋은점 사이에 원유변화와 만나게되는 것이 필요하다. 높은 질/위생적 원유에 대한 가치의 주요 평가는 : - 부패미 생물의 낮은 수 - 유방염 병원성균이 포함된 병원성군이 없거나 대단히 낮은 수 - 가능한 한 멀리 피할 것은 잔류와 오염 그리고 또는 최고잔류한계(Maximum Residue linits. )이하를 지킬 것. 우유내 부패세균은 다음 군에서 주요 우유성분에 대한 공격의 그들 주요점에 의하여 세분할 수 있다. - 당분해(Glycolytes) - Streptococci, lactobacill; - 단백질 분해(Proteolytes) - Pseudomonads, Enterobacteriaceae, Aerobic sporeformer - 지방분해(Lipolytes) - Pseudomonads, Micncocci, Aeromonads, Coryneb acteria 원유내 부패세균의 존재와 분열은 우유성분 변화와 생산품의 질에 영향을 줄 것이다. 더구나 원유의 맛은 역의 영향이 될 것이며 열 안정성 세균성 효소는 생산품에서 계속적으로 작용된다. 특히 오랜 저장시에 그러하다. 그리고 안정성, cream의 맛과 UHT 우유에 나쁜 영향을 준다. 이 병원성 세균을 고전적 미생물과 최근 발견된 미생물이 포함된다. 현재는 Salmonella, 병원성 E. Coli 균주, Listeria monocytogenes, Campylobacter Jejuni, Yersinia enterocolitica, Staphylococcm aureu는 대단히 중요하다. 원유의 세균학적 질과 지불제도에 대한 법적요구는 우유위생지침 92/94 EEC와 IDF설문 2893/A(전문가모임 A8군)의 결과를 기준으로 설명되었다. IDF Nr. 305/1995는 농장 지불제도에 관한 정보가92/93년 동안 IDF국가들 사이 차이나는 실제적 위치가 실려있다. 지불제도의 차이나는 현상은 보고의 초점과 연관 유질, 위생적 질, 우유시료채취, 수집방법론 그리고 여러가지 지불공식과 관계된 조사는 논쟁이 있었다. 현재 있는 자료를 제시한 몇 나라는 1992년에 응용한 것이고, 기타는 그후 응답으로 1993년과 1994년에 있던 것이 제시되었다. 식품위생에서 법적인 요구는 HACCP제도가 더욱더 추가로 포함된다. 더우기 위험분석은 위생과 질에 관련시켜 모든 연결결정에 대하여는 과학적 근거가 있어야 한다.
저온성 세균 Acinetobacter calcoaceticus A1-1의 유류분해 특성을 연구하기 위해 환경적 요인에 대한 영향을 살펴보았다. 이 세균의 성장율과 유화활성도에 대한 적정 환경조건은 온도 $15^{\circ}C$, pH 7.5, 염분도 0-3, 원유농도 0.1로 나타났고 질소원과 인원의 적정농도는$(NH_4)_2S0_4$과 $K_2HP0_4$, 형태로 각각 0.76 mM, 0.057mM이다. 온도에 따른 A.calcoaceticus A1-1의 유류분해 양상을 개스크로마토그라피로 분석한 결과 $10^{\circ}C$, $15^{\circ}C$에서 대부분의 탄화수소 피크가 감소되어 상당 정도의 유류분해를 관찰 할 수 있었다. 반면 $25^{\circ}C$의 경우에는 120시간 배양한 후에도 원유에 포함된 포화탄화수소 화합물들이 부분적으로만 분해되었다.
원유 분해세균에 의한 원유 분해능을 조사한 결과, Xanthomonas camperstris M12, Xanthomonas sp. M28, Acintobacter lwoffi G1, Klebsiella pneumoniae L25, 그리고 Pseudomonas maltophilia N246 등의 순서로 나타났다. Xanthomonas maltophilia M12, Xanthomonas sp. M28, 그리고 Pseudomonas maltophilia N246 균주 모두 pctane 분해시의 온도는 $30^{\circ}C$에서 최적이었으며, 최적 pH는 X.camperstris M12와 Xanthomonas sp. M28이 7.0-7.5 이었고, P.maltophilia N246이 7.5-9.0이었다. N246 균주의 최적 NaCl농도는 3.0-3.5 이었다. P.maltophilia N246와 X.campestris M12는 모두 플라스미드를 갖고 있음을 확인하였고, N246 균주로 부터 플라스미드를 제거하였을 경우 octane 분해능이 소실되었으므로 이 플라스미드 위에 octane 분해 유전자가 있음이 확인되었다. 이 균주이 OTC 플라스미드의 크기는 118kb이었다. 또한, N246 균주는 ampicillin 항생제에 내성을 나타내었다.
경기도 일원의 각 목장에서 집유한 원유의 일반세균수와 저온세균수를 조사하고, 유질의 변화를 검토하였다. 원유의 총 균수는 1980년 여름에 $10^{7}/ml$, 겨울에는 $10^{6}/ml$을 유지하였다. 대장균군도 1982년 여름에는 $10^{6}/ml$였고 겨울에는 $1{\times}10^{5}/ml$였으나 매년 감소하여, 1985년에는 년중 균일하게 $1{\times}10^{5}/ml$ 이하였다. 저온성 세균은 매년 증가하는 추세에 있고, 원유를 $5^{\circ}C$나 혹은 $10^{\circ}C$에 저장하는 경우에도 저온성 세균은 증식하며 동시에 단백질과 지방이 분해하여 유리지방산과 유리아미노산의 생성량이 증가하였다.
오랜 세월 동안 저온환경으로 유지된 남극생태계에서 원유분해능을 나타내는 저온성 세균을 24균주 분리하여 그 중 분해능이 우수한 균주를 선발하였고, 그 중 활성이 가장 높은 A1-1을 선발하여 동정한 결과 Acinetobacter calcoaceticus로 밝혀졌다. A.calcoaceticus A1-1에는 분자량 약 110Md인 plasmid 하나만이 확인됐으며 mitomycin에 의한 plasmid curing은 transfer를 계속할수록 또는 온도를 상승시킬수록 curing의 빈도가 높았다. plasmid가 제거된 균주의 탄화수소 분해능 실험결과 저온성 세균 A. calcoaceticus A1-1의 alkane 화합물 이용능력은 plasmid에 유전정보가 있음을 시사했다. 또한 본 균주의 plasmid 안정성은 세 번째 transfer 후에도 90%정도의 안정성을 보여주었고 항생제 중 ampicillin에 대한 내성을 나타내었고 streptomycin, chloramphenicol, kanamycin, tetracycline에 대해서는 감수성을 나타내었다. 이와같은 결과들은 A. calcoaceticus A 1-1가 매우 안정적이며 항새제 내성과 관련이 있는 유류이용에 관여하는 프라스미드를 갖고 있음을 시사한다.
남해안 유류 오염지역으로부터 유류분해능이 우수한 균주를 선별하여 동정한 결과 Pseudomonas aeruginosa로 동정되었으며, Pseudomonas aeruginosa BYK-2로 명명하였다. 균 성장 및 생물 유화제 생산을 위한 최적배양온도, 시간, pH, NaCl 농도는 각각 $25^{\circ}C$, 48시간, 7.0 이었으며, NaCl은 첨가하지 않았을 때 가장 많은 양의 생물유화체가 생산되었다. 본 균주의 경우, 1%(w/v) arabian light 원유와 bunker C oil을 기질로 7일간 배양한 결과 92.1%(w/w)와 76.2%(w/w)가 생분해되었다. n-hexadccane 에 대한 세포부착능이 실험에서는 탄화수소화합물들(arabian light 원유, kuwait 원유, bunker C 유, n-paraffine, n-hexadecane, n-tetradecane)을 기질로 배양했을때는 모두 80% 이상의 높은 세포부착능을 나타냈으며, 지방산들(oleic acid, olive oil, lecithin)중에는 lecithin을 기질로 배양했을 때 91.5%로 가장 높은 세포부착능을 나타냈어다. 또한 당들(arabinose, trehalose, dextrose, galactose, lactose, fructose, maltose, sorbitol, sucrose)을 기질로 했을 경우 arabinose, galactose, sorbitol, sucrose를 제외하고는 대부분 70%이하의 세포부착능을 나타냈다.
해양세균 Pseudomonas sp. CHCS-2는 배양과정 중에 포도당 첨가에 의해 생물유화제의생산이 증가되었으며, 196시간 배양시 원유에 포함되어 있는 paraffine계 탄화수소 중에서 $_nC_{12}~_nC_{22}$까지 범위의 carbonchain이 거의 대부분 분해됨을 알 수 있었다. chloroform : metahnol = 1 : 1(V/V)로 추출하여 얻은 8.5g/L의 crude 생물 유화제를, Amberlite XAD-7, Sepharose CL-4B, DEAE-sepharose CL-6B 수지를 사용하여 정제한 결과 최종적으로 0.21g/L의 정제된 생물유화제를 얻었다. 본 균주가 생산하는 생물유화제는 단백질과 octadecanoic acid가 결합된 분자량이 약 67kDa인 lipoprotein으로 확인되었으며, 정재된 생물유화제중 단백질성분만을 분리하여 N-말단 아미노산배열을 분석한 결과, Ser-Val-He-Asn-Thr-Asn-IIe-Thr-X-Met-Ile-Gly-Gin-Gln-의 배열을 가지는 것으로 확인되었다. 이는 기존에 보고된 lipoproten과 다른 형태의 것으로, 본 균주가 생산하는 생물유화제의 경우 구성성분, 분자량 등을 고려해 볼 때 새로운 형태의 lipoprotein 계열 생물유화제로 추정된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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