장차 세포증식과 분화의 전환에 있어서 세포주기의 구성요소들과 Rb 사이의 상호관계 및 세포주기의 조절과 DNA 손상에 대한 p53의 역할을 함께 상세하게 �P혀야 한다. 형질전환된 경우에는 p16과 p21을 포함하여 관련된 CDI들에 의한 cyclin과 CDK의 복합체의 조절에 있어서 중요한 변화들을 야기시키므로 CDI들의 불활성과 발암현상과의 정확한 인과관계를 �P혀내야 한다. 발아 또는 분열효모균에서 Sic 1과 Rum 1과 같은 cyclin-CDK의 중요한 조절인자들이 확인되었는데, 포유동물에 있어서 이러한 단백들에 대한 대응물들을 기대해보며, 체크포인트와 세포사망기전 및 암세포들에 있어서 탈조절에 대한 이해가 새로운 항암치료제 개발에 중요하다고 생각된다.
한국 전통약주의 암세포주에 대한 세포독성과 체내에서의 암세포 성장 및 전이에 대한 영향을 조사하기 위하여 무증자 발효 방법으로 발효시킨 전형적인 약주(전통약주II)와 이 약주에 한약재를 첨가하여 발효한 것(전통약주I), 비교 시료로 일본 청주에 대하여 연구하였다. 각 시료를 동결건조하고 증류수로 재용해하여 실험에 사용하였는데 암세포주에 대한 세포독성 실험 결과 B16BL6 mouse melanoma 세포에 대하여 전통약주는 2종류 모두 본래 농도의 16배 미만의 희석 배수에서 세포독성을 나타냈으며, 일본 청주는 8배 미만의 희석배수에서 나타냈다. HRT18 human colon adenocarcinoma 세포에 대한 독성은 비교적 B16BL6 세포의 경우 보다 모두 낮았다. 일상적인 음용 범위 내에서 모든 시료들의 세포에 대한 직접적인 독성은 미약하였으나, 낮은 희석배수에서도 대상 세포들의 형태가 변화하는 것을 관찰할 수 있었다. 각 시료들의 항암효과를 조사하기 위하여, B16BL6 세포를 이용하여 체내에서의 암세포 성장 및 전이를 분석하였다. 암세포를 마우스의 발바닥에 피하접종하고 시료를 섭취시켜 암세포의 성장과 전이를 조사한 결과 일본 청주에 비교하여 전통약주I과 전통약주II 섭취 군에서 높은 암세포 성장을 억제하는 경향을 나타냈으며, 특히 전통약주I은 암의 전이 억제에 뚜렷한 효과를 보였다. 본 연구의 결과에 의하면 이러한 항암효과는 전통약주의 어떤 성분이 직접적으로 암세포에 작용하기보다는 면역세포 등을 포함한 여러 다른 세포의 성장과 분화에 작용하여 간접적으로 항암효과를 나타내는 것으로 판단되었다.이내에는 소비하는 것이 바람직한 것으로 나타났다..3{\sim}11.9%$ 였으며 기온은 $4.3{\sim}6.5^{\circ}C$낮았다. 또한 지온은 5월에서 8월까지 $17.5{\sim}20.1^{\circ}C$로 경과되어 외기기온의 $25.1{\sim}30.8^{\circ}C$에 비하여 낮았으나 변화폭이 작았다.ol, cis-3-hexenol, trans-2-hexanol 등(等)이 높은 함양(含量)을 보였다. 유기물(有機物) 종류간(種類間)에는 침엽수(針葉樹)/이끼 퇴비(堆肥)에서 주요(主要) 향기성분(香氣成分)인 1-hexanol이 78.62, cis-3-hexenol이 36.65. trans-2-hexanol이 120.41 peak area%를 나타내었으며 이는 향기(香氣)가 높은 자생지(自生地) 토양(土壤)의 1-hexanol이 74.47, cis-3-hexenol이 44.21, trans-2-hexanol이 147.33 peak area%인 것과 유사(類似)하게 높았다.tarrow}6$보다 $4{\beta}{\rightarrow}8$의 결합방식이, 그리고 procyanidin 류에서는 gallate를 갖는 물질이 이를 함유하지 많은 물질보다 더욱 높은 ACE의 저해효과를 나타내었으며, 또한 hydroxyl 기가 많을수록 효소 저해효과도 증가하는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 chocolate의 주원료인 cacao bean의 polyphenol 성분 또한 녹차 등에서 볼 수 있는 생리활성효과에 손색없는
Butyrate는 탄소사슬이 짧은 지방산 중 하나로 소화되지 않은 식이성 섬유의 혐기적 발효결과 포유동물의 위장관내에 millimolar 농도로 유지되며 대장의 상피세포에서 흡수되어 energy원으로 사용된다. 70%정도 confluent하게 자란 사람의 대장암세포주인 HT29 cell에 5mM sodium butyrate를 시간별로 처리하고 세포의 생존율, 암세포의 분화정도의 biomarker로 알려진 alkaline phosphatase 및 PLC-rl의 발현정도를 측정하였으며 sphingolipid의 생합성 및 ceramidase 활성도 측정하였다. Sodium butyrate 처리는 성장중인 HT29 cell의 부착을 저해하여 처리 1일째부터 세포수가 감소하였고 형질막 효소인 alkaline phosphatase의 발현을 증가시켰으며 PLC-${\gamma}$의 발현을 감소시켰다. 또한, 복합 sphingolipid들의 생합성을 측정한 결과, 세포성장의 저해와 함께 sphingomyelin은 2일째부터 감소하였으며, galactosyl ceramide는 1일째부터 급속히 감소하였다. 그러나 ceramide의 경우, 1일째는 처리하기 전보다 680dpm/mg protein정도 증가하였으며 2일째에는 다시 급속히 감소하였다. 또한 butyrate처리에 의하여 HT29 cell의 acid ceramidase와 neutral ceramidase활성이 저해됨을 관찰하였는데 그 결과 ceramide함량이 초기에 증가된 것으로 생각된다. 본 실험결과들로부터 HT29 cell의 sodium butyrate처리는 세포분화 또는 세포성장저해를 가져오는데 이와 함께 초기의 ceramide함량 및 alkaline phosphatase활성의 증가와 galactosylceramide함량 및 LC-rl 발현의 감소현상이 동반됨을 알 수 있다.
중간엽 줄기 세포는 다분화능을 가지고 있으며 골수, 지방, 태반, 치아속질, 윤활막, 편도 및 가슴샘 등 인체의 다양한 조직에서 분리된다. 중간엽 줄기세포는 조직의 항상성을 조절하며 다분화능, 분리와 조작의 용이함, 암세포로의 화학주성 및 면역 반응 조절 등의 특징을 가지고 있어서 재생 의학, 암 치료 및 식대주 질환(GVHD) 등에 이용할 수 있는 세포치료제로 주목 받고 있다. 하지만 주위 세포와 조직을 지지하고 조절하는 특징과 관련하여 중간엽 줄기세포가 혈관 생성을 촉진하고 성장인자를 분비하며 암세포를 공격하는 면역 반응을 억제함으로써 암의 진행을 촉진시킨다는 사실 또한 보고 되고 있다. 이러한 사실들로 인해 중간엽 줄기세포의 임상 적용이 제한되고 있다. 본 연구에서는 어떠한 기전을 통해서 중간엽 줄기세포가 암의 진행을 촉진하는 지지 세포로 기능하는지를 밝히기 위해서 인체 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기세포를 두 개의 암세포주(H460, U87MG)와 각각 공동 배양하고 microarray를 이용해서 암세포와 공동 배양되지 않은 중간엽 줄기세포와 유전자의 발현을 비교하였다. 두 암세포주와 공동배양에서 공통적으로 2배 이상 차이 나는 유전자를 DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)와 PANTHER (Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships)를 이용해 분석하였으며 생물학적 과정, 분자적 기능, 세포의 구성 성분, 단백질의 종류, 질병과 인체 조직 그리고 신호전달에 관련된 정보를 획득하였다. 이를 통해서 암세포는 중간엽 줄기세의 분화, 증식, 에너지 대사, 세포의 구조 및 분비기능을 조절하여 유전자의 발현 양상을 암 연관 섬유모세포(cancer associated fibroblast)와 유사한 세포로 변형 시킨다는 사실을 알 수 있었다. 본 연구의 결과는 중간엽 줄기세포를 이용한 임상 치료제의 효과와 안정성을 개선하는데 응용될 수 있을 것이다.
인간 면역 세포 중 하나인 T세포에 대한 각 시료의 생육촉진 활성은 시료의 1.0 g/l에서 기준물질로 사용한 유향열매의 정유 성분이 T세포의 생육촉진 활성 측정에서 가장 좋은 활성을 나타내었으며, 노간주나무의 열매의 정유성분이 줄기 부분의 정유 성분보다 높은 생육 촉진 활성을 보였다. T 세포의 각 cell 당 $TNF-{\alpha}$의 분비량을 살펴보면 모든 시료의 정유 성분들이 배양 2일째 최대분비량을 나타내었고, IL-6의 경우는 모든 시료들이 배양 시간 의존적으로 증가하는 경향을 나타내었다. 유방암 세포인 MCF-7에 대한 각 시료의 생육 억제 활성은 각 정유 성분에 대하여 농도 의존적인 경향을 나타내었으며, 가장 좋은 활성을 나타낸 시료는 노간주나무 열매의 정유 성분으로 약 84%의 높은 생육 억제 활성을 나타내었으며, 유향 열매와 노간주나무 줄기의 정유 성분들도 약 80%에 가까운 높은 생육 억제 활성을 나타내었다. 간암 세포인 Hep3B에 대한 각 정유 성분들의 암세포 생육 억제 활성도 유방암 세포와 같이 각 정유 성분에 대하여 농도 의존적인 경향을 나타내었으며, 유향 열매의 정유 성분이 약 83%의 높은 생육 억제 활성을 나타내어 가장 좋은 활성을 나타내었다. 항암 및 면역기능의 역할에 대한 분자수준에서의 검증을 위해 HL-60 세포의 분화도를 살펴본 결과, 배양 시간 의존적으로 분화도가 증가하는 경향을 나타내었으며, 유향열매의 정유 성분이 Control 군에 비하여 1.38배의 증진활성을 나타내어 가장 높은 분화도를 나타내었으며, 노간주 열매의 정유 성분이 줄기의 정유 성분에 비하여 높은 분화도를 나타내었다.
본 연구에서는 퉁퉁마디 추출물의 용매 분획을 통해 얻은 Fr.H, Fr.E, Fr.EA, Fr.B, 및 Fr.W, 분획의 인간 단핵구 THP-1 세포에 대한 면역조절 활성과 정상 장관계 세포 및 장관계 암세포를 이용하여 면역세포와 장관상피 세포의 상호작용에 미치는 영향을 조사하였다. THP-1 세포는 PMA에 의해 분화가 진행되었으며 분화된 THP-1 세포는 LPS에 의해 활성화되어 COX-2 단백질 발현이 유도 되었다. 퉁퉁마디 분획은 분화된 THP-1 세포에서 COX-2, iNOS, 및 $cPLA_2$ 발현에는 영향을 미치지 않았으나, 분획 중 Fr.E는 LPS에 의해 유도된 COX-2의 발현을 유의적으로 증가시켰다. 분화된 THP-1에서 퉁퉁마디 분획을 처리하여 얻은 배양액은 INT-407 정상 장관계 세포의 성장을 촉진한 반면, HT-29 대장암 세포에는 영향을 미치지 않거나 성장 억제 활성을 나타내었다. THP-1에 LPS를 처리한 배양액은 HT-29 세포의 COX-2 발현을 유도하였으며 이러한 LPS의 효과는 Fr.E의 처리에 의해 억제되었다. 본 연구에서는 면역세포와 장관계 세포 간의 상호작용에 미치는 퉁퉁마디 분획의 영향을 조사하여 이를 통한 면역조절 활성을 나타낼 수 있음을 보였으며, 면역조절 기능성 소재로서의 퉁퉁마디의 이용성 확대를 위한 기본 정보를 제공하고자 하였다.
Objectives : To analyze the effect of retinoids on the differentiation in HNSCC xenografts. Materials and Methods : RA (20mg/kg) or 13-cis-RA (60mg/kg) was orally administered once in a day for 30 days in the xenograft model we prepared using athymic nude mice with AMCHN-4 and -6. We carried out H & E staining and immunohistochemical staining with the monoclonal antibody against involucrin and cytokeratin 10. Results : Both RA and 13-cis-RA were found to suppress the differentiation of AMC-HN-4. Interestingly, RA enhanced the differentiation of AMC-HN-6, although 13-cis RA did not exhibit any effect on the differentiation. These results suggest that in vivo effect of retinoids on the HNSCC growth and differentiation might be various. Retinoids-induced P450 in AMC-HN-6 might be one of the mechanisms to explain the reason why the retinoids exhibit various functions in the HNSCC.
연구배경 : 암화 과정상의 한 요소는 조절되지 않는 세포의 증식인바 그 증식성을 알아볼 수 있는 많은 방법들이 소개되었는데 그중 한 방법이 소위 증식표지인 PCNA를 검색해 보는 것이다. PCNA는 36KD의 핵단백질로서 세포의 증식과정에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는데 암세포에선 그 발현성이 잘 조절되지 않으므로 이를 이용하여 암세포의 생물학적 성상을 보다 잘 이해하려는 연구들이 시도되었다. 지금까지 알려진 바로는 암세포에서의 PCNA 발현율은 암세포중 증식세포 비율뿐 아니라 암세포의 분화정도, DNA의 배수성, 항암제에 대한 감수성 등과 관련된다고 보고되었다. 또한 그 방법의 단순성 및 신속성과 아울러 통상적 조직 보관법인 파리핀 포매 절편을 이용하므로써 조직형태를 그대로 유지한다는 장점이 있다. 이에 저자들은 폐암조직에서 PCNA 발현양상을 조사 분석하여 그 병태 생물학적 의의를 알아보고자 하였다. 방법 : 연구 대상은 폐암으로 진단받고 폐절제술로 적출되어 파라핀에 포매된 43예의 폐암조직을 사용하여, 면역조직화학 염색법으로 PCNA 발현을 조사하여 암세포형, 병기, 병소 종류, 생존율 등과 어떤 관계가 있는지 분석하였다. 결과: 1) 세포형에 따른 구분 : 편평상피암은 89%, 선암은 54%의 양성율을 나타내어 세포형에 따른 차이를 보였고 대세포암은 1예인데 양성이었다. 2) 병기에 따른 구분 : 병기가 진행할수록 즉 1기에서 보다 2, 3기에서 양성율은 높은 경향을 보이나 통계적 의미는 없었다. 3) 병소에 따른 구분 : 원발암 부위와 전이 임파절 부위에서의 양성율은 각각 77%와 62%로서 큰 차이가 없었고, 전이 병소를 가진 13예에서 두 부위간의 양성율은 92%와 62%로서 원발부위에서 높으며, 전이 병소를 가진 원발 부위에서의 양성율이(92%) 전이 병소가 없는 원발 부위의 양성율보다(70%) 높았다. 4) 생존 기간에 따른 구분 : 12개월 생존율을 비교할 때 양성율에 따른 차이는 없었다. 결론 : 본 연구 결과 폐암조직에서의 PCNA의 발현은 편평상피암에서 보다 높으며, 전이병소를 가진 원발 부위에서 높게 나타났으나, 병기 및 생존율 등에서는 차이가 나지 않았으므로 향후 더많은 예수에 대한 검증, 여러 다른 치료를 받은 경우에서의 검증, 더 오랜 기간의 생존율 관찰 및 다른 생물학적 지표와의 비교 검토가 필요할 것으로 사료된다.
폴리아민은 거의 모든 세포에 있어서 성장과 분화에 필수적인 물질이다. 이들 폴리아민의 기작은 상당히 복잡하고 다양하여 그 정확한 작용기전은 아직 확실하지가 않다. 본 논문에서는 폴리아민이 세포 증식을 유도 하기도 하지만 일정농도 이상에서는 오히려 세포사멸을 초래한다는 결과를 밝히고자 한다. 본 실험에 사용된 인간의 전립선 암세포(LNCaP cells)에 있어서, 폴리아민 가운데 putrescien은 세포 증식에 거의 영향을 미치지 않았으나 spermidine과 spermine의 경우 10 ${\mu}M$ 이하에서는 세포 증식을 촉진하였다. 그러나, 20 ${\mu}M$ 이상의 농도에서는 농도와 시간의존적으로 세포사별을 유도 하였다. 폴리아민 처리에 의한 세포사멸의 초기과정인 핵 응축과 염색질 condensation이 Hoechst와 PI 염색에서 뚜렷이 관찰되었다. 또한, 폴리아민 처리시 anti-apoptotic protein으로 알려진 Bcl-2 protein의 발현은 거의 완전히 억제된 반면, pro-apoptotic protein으로 알려진 Bax의 발현은 현저히 증대되었다. 본 연구의 결과에 따르면, 폴리아민에 의해서 유도되는 세포사멸은 세포 내 칼슘농도 변화에 의한 것으로 사료된다. 전립선 암세포에 있어서 폴리아민 처리시 시간과 농도 의존적으로 세포 내 칼슘농도가 증가되었다. 세포막을 통한 칼슘이동을 억제하는 nifedipine과 flufenamic acid 등의 억제제를 처리한 실험 결과 세포내 칼슘증가는 세포 내부의 저장소로부터 칼슘의 유출보다는 주로 세포막상에 있는 비선택적 칼슘통로를 통한 외부의 칼슘 유입에 의한 것으로 판단된다.
Akt는 세포의 증식과 분화에 관여하며 많은 암종에서 과발현되어 있다는 것이 보고되었다. 본 연구에서는 Akt의 조절을 통한 셀레늄의 HT-29 세포의 세포증식억제 시너지효과를 확인하였다. 셀레늄을 농도별과 시간별로 처리하였을 때 HT-29 세포의 증식이 억제되었고, apoptosis가 일어남을 확인하였다. 셀레늄을 농도별로 처리하여 Western blotting 및 immunofluorescence를 실시한 결과 Akt의 인산화가 저해되었고 COX-2의 발현도 저해되었다. 또한 Akt 저해제인 LY294002를 처리한 결과, HT-29 대장암세포의 증식이 억제되었으며, LY294002를 셀레늄과 병행처리하였을 때 셀레늄에 의한 세포증식억제 효과가 더 강하게 나타나는 것을 확인하였다. Akt siRNA에 의한 Akt의 불활성화는 non-transfected 세포에 비하여 HT-29 세포의 성장을 더 강하게 억제하였으며, Akt가 불활성화 되었을 때 COX-2의 발현 역시 non-transfected 세포에 비하여 감소된 것을 확인하였다. 따라서 HT-29 세포에서 셀레늄의 세포증식억제 효과는 Akt와 COX-2 신호분자의 조절을 통해 일어나며, Akt 의 저해는 셀레늄의 대장암세포증식 억제에 시너지 효과를 나타냄을 확인하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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