척수 손상은 중추 신경계의 손상으로 신경학적 회복이 어려운 것으로 알려져 있었으나 최근 그 병태 생리에 대한 이해의 발전과 함께 다양한 신경 보호적 시도 및 신경 재생에 대한 시도가 보고되어 이에 대한 새로운 치료적 접근법이 제시되고 있다. 이에 본 종설에서는 제시되고 있는 병태 생리와 함께 신경학적 재생을 위한 실험적 연구의 내용을 정리하며, 임상적 시도에 대하여 현재까지의 결과와 함께 향후 객관적이며 안전한 임상적 적용을 위한 선행 조건 등에 대하여 정리하여 보고자 한다.
본 연구에서는 석곡(Dendrobium nobile Lindl.) 추출물에 대한 신경세포 보호 효과를 확인하기 위하여 $H_{2}O_{2}$에 의해 유도된 스트레스 상태의 PC12 세포주에서 MTT-dye reduction assay와 LDH release assay를 이용하였다. MTT reduction assay 결과, 스트레스 상태에서는 47%의 생존율을 보인데 반하여 석곡 추출물 50${\mu}$g/ml 농도로 처리하였을 때 99.5%의 높은 세포 생존율을 확인할 수 있었다. 이 결과는 LDH release assay 에서도 일치하는 결과를 확인하였다. 그리고 광학 현미경을 이용한 형태학적 변화를 관찰한 결과에서도 신경돌기의 출현 유도를 통한 신경세포 생존을 확인 할 수 있었다. 또한 핵의 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과 정상 세포의 핵은 타원형의 온전한 핵 모양을 나타낸 반면 산화적 손상을 입은 세포는 apoptotic body가 핵 주변에 나타나는 전형적인 apoptosis를 나타내었고 석곡 추출물을 처리한 결과 핵의 condersation현상과 fragmentation이 현저히 감소함을 확인 할 수 있었다. 그리고 $H_{2}O_{2}$에 의한 capase-3의 활성은 석곡 추출물을 50${\mu}$g/ml 처리 후 약 1.1배 이하로 감소함을 보였다.
본 논문에서는 스코폴레틴이 알츠하이머병 신경염증보호제로서의 가능성을 제안하기 위해 미세아교세포 BV-2에서 아밀로이드베타 올리고머(Aβ1-42)로 유도된 염증을 억제하는지 확인하였다. 또한, 염증관련 사이토카인 및 염증매개인자가 어떠한 메커니즘으로 조절되는지 확인하였다. 알츠하이머병은 가장 흔한 신경 퇴행성 질환이지만, 특정 병인을 알 수 없는 질환이며, 이를 해결하기 위해 많은 연구에서 노력을 기울이고 있다. 우리는 먼저 스코폴레틴과 Aβ1-42가 BV-2 세포에 독성을 보이는지 확인하기 위해 CCK-8 assay 방법으로 세포 생존율을 측정하였다. Western Blot을 통해 Aβ1-42로 유도된 염증반응에서 interleukin 1 beta (IL-1β), cyclooxygenase-2 (COX-2), inducible nitric oxide synthase (iNOS), nuclear factor-κB (NF-κB)의 발현정도를 분석하였다. ANOVA 분석법을 통해 Aβ1-42를 단독 처리한 BV-2 세포와 스코폴레틴을 전 처리한 BV-2 세포에서 단백질 발현 차이를 비교하였다. 그 결과 스코폴레틴을 전 처리한 BV-2 세포에서 IL-1β, COX-2, iNOS, NF-κB 발현수준이 유의미하게 감소되었다 (p value < 0.05). 따라서 본 연구는 향후 스코폴레틴이 알츠하이머병의 신경염증보호제로서 개발 가치가 있음을 제시하였다.
상황버섯균사체 쌀의 뇌세포 보호 효과를 분석하여 상황버섯균사체 쌀에 대한 기초자료를 제공하고, 이를 이용하여 뇌 질환의 예방과 관련된 기능성 식품으로의 개발가능성을 찾고자 하였다. 상황버섯균사체 쌀 추출물을 처리하여 마우스 해마세포주 HT22의 세포보호 효과를 알아보기 위해 MTS assay를 이용한 세포생존율과 western blot을 이용한 세포사멸 단백질의 발현을 관찰하였다. 상황버섯균사체 쌀 추출물의 단일 독성을 측정한 결과 상황버섯균사체 쌀 추출물 처리군은 102.68% 이상의 생존율을 보여 신경세포의 사멸에 영향을 주지 않았다. 또한, 상황버섯균사체 쌀 추출물과 $H_2O_2$를 함께 처리하였을 때 $H_2O_2$로 자극된 세포는 63.80%의 세포생존율을 나타내었고, 상황버섯균사체 쌀 추출물과 $H_2O_2$가 함께 처리된 세포는 76.85%, 92.46%, 95.57%로 농도 의존적으로 세포생존율이 증가하였다. HT22 cell에 $H_2O_2$와 상황버섯균사체 쌀 추출물을 처리하여 apoptosis 유도 단백질을 측정한 결과, pro-apoptotic protein인 Bax는 발현이 억제되었고, anti-apoptotic protein인 Bcl-2는 발현이 증가함을 확인하였다. 또한, caspase-3와 PARP의 발현을 억제하여 상황버섯균사체 쌀 추출물이 $H_2O_2$로 유도되는 apoptosis를 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
본 연구는 저산소증에서 반하가 대뇌신경세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여 $E_18$의 배양 흰쥐 대뇌신경세포를 반하로 전처리한 후, LDH assay와 tryphan blue 염색으로 세포 생존율을 측정하였고, $H_2DCF-DA$, JC-1 염색으로 MMP, ROS 및 RNS 변화를 조사하였다. 이에 반하는 저산소증으로 유발된 대뇌신경세포를 2.5 ${\mu}g/ml$까지 농도의존적으로 세포 생존률을 증가시켰으며, 시간에 따른 생존율을 살펴보면 저산소증 유발 후 1 시간에는 별 차이를 보이지 않았지만 3 일, 5 일 후에는 각각 10.2%, 17.8%로 매우 유의한 증가를 보였다. 저산소증에서 반하가 MMP에 미치는 영향을 보기 위해 저산소증 유발직전과 유발 후 1 일, 3 일, 5 일에 JC-1으로 염색하고 미토콘드리아의 염색강도를 측정한 결과 적색형광은 실험군에서 전반적으로 대조군에 비하여 강하게 염색되는 미토콘드리아의 비율을 증가시킨 반면 녹색형광은 대조군과 뚜렷한 차이를 보이지 않았다. 즉 반하가 저산소증으로 유발된 MMP의 소실을 감소시킴을 알 수 있다. 또한 반하는 전반적으로 $H_2DCF-DA$에 염색되는 세포 비율을 현저하게 낮추는 것으로 나타나 저산소증으로 유발된 ROS 및 RNS의 생성을 유의성 있게 감소시켰다. 따라서 반하는 저산소증에서 ROS의 생성을 억제하고 MMP의 소실을 막아 세포의 에너지고갈을 방지함으로서 신경세포를 보호하는 것으로 이해된다.
본 연구팀의 선행 연구 결과, L. helveticus IDCC3801의 발효유 주정 침전물이 BACE의 활성 억제를 통한 amyloid beta($A{\beta}$) 생성 저해효과를 갖고 있음을 확인하였다(15). 이러한 결과를 바탕으로 L. helveticus IDCC3801의 발효유 주정 침전물의 산업화를 위한 공정 개선연구를 진행하였고, 대량생산을 통해 LHFM을 확보하였다. 본 연구는 LHFM의 인지기능 개선 기능성 입증 연구로써 $A{\beta}$ 저해효과 외에 신경세포 보호효과 및 기억력 개선 효능을 확인하고 어떠한 작용 기전으로 개선 효과가 나타나는지 조사한 것으로 scopolamine으로 기억 손상을 유발한 mouse에서 학습 능력과 기억력 개선 효과, 신경세포 보호 효과, AChE 저해와 ACh 증가 효과 등을 평가하였다. LHFM은 신경세포 사멸을 유도하는 고농도의 glutamate가 존재하는 환경에서 농도 의존적으로 신경세포의 사멸을 억제하여 신경세포를 보호하였다. 또한 LHFM은 in vitro에서 농도 의존적으로 강력하게 AChE의 활성을 저해하였다. 이러한 in vitro 결과들을 근거로 scopolamine으로 기억 손상을 유발한 mouse에서 Morris water maze와 Y-maze 행동 시험을 통해 LHFM의 학습능력과 기억 개선 효과를 조사하였다. LHFM은 Morris water maze에서 실험 2일째부터 escape latency시간을 유의적으로 감소 시켰으며 5일째에서는 정상 mouse와 동등한 수준으로 감소되어 우수한 학습 효과를 보였다. 실험 6일째 platform을 치운 후 시행한 probe trial에서도 platform이 있던 위치에 머무는 회수가 scopolamine을 단독으로 처리한 것보다 유의적으로 높아 장기기억의 개선에도 효과가 있었다. Y-maze 시험에서도 LHFM은 scopolamine 단독 처리군과 비교하여 뚜렷하게 변경 행동력을 증가시켜 여러 행동 시험을 통해 LHFM의 인지기능 개선 효과를 확인하였다. 행동실험 후 hippocampus를 적출하여 ACh 및 AChE의 활성을 측정한 결과, donepezil과 마찬가지로 LHFM은 AChE의 활성을 유의적으로 억제하였으며 또한 ACh 함량도 증가시켰다. 결론적으로 LHFM은 신경세포 보호 효과와 신경전달물질인 ACh의 뇌 조직 내 농도를 높여 인지기능 개선 효과를 보이는 것을 확인하였다.
Amyloid $\beta$ peptide($A{\beta}$)은 지방산화 및 free radical의 생산에 의해 신경세포의 apoptosis를 유도하거나 산화적 스트레스를 증가시키는 원인이 되는 물질로 알려져 있으며, 알츠하이머와 같은 신경계 질환은 뇌에 아밀로이드베타 단백질들의 축적에 의해서 일어난다. 따라서 본 연구에서는 수분 활성도 0.813인 분말 녹차를 저장기간별로 저장한 후 $70^{\circ}C$에서 5분간 추출한 분말 녹차 열수추출물을 이용하여 아밀로이드 베타단백질에 의해 유도된 신경세포 보호효과를 측정하였다. 아밀로이드 베타 단백질에 의해 유도된 PC 12 신경세포에 대한 보호효과를 MTT방법으로 측정한 결과 저장하지 않은 시료와 1주일 동안 저장한 분말 녹차 열수추 출물에서 가장 높은 보호효과를 보였다. 저장기간에 따른 분말 녹차 열수추출물의 산화적 스트레스에 의한 세포막 보호효과를 LDH 및 trypan blue exclusion 방법으로 측정한 결과 모든 시료에서 $20{\sim}25%$의 LDH release 보호효과를 보였으며, 또한 trypan blue exclusion 실험에서 positive control로 사용한 $91.0{\pm}1.6%$의 vitamin C 보다 분말 녹차 열수추출물에서 $96.3{\pm}1.8{\sim}96.2{\pm}2.4%$로 더 높은 세포막 보호효과를 보였다.
본 연구에서는 갑주백목 에탄올 추출물(ethanolic extraction from Diospyros kaki (Gabjubaekmok))을 이용하여 in vitro 항산화 활성과 더불어 $A{\beta}$로 유도된 인지기능 저하를 갖는 마우스 모델에서 인지기능 및 뇌 신경세포 보호 효과를 검증하였다. 갑주백목 추출물은 양성대조군과 비교하여 우수한 ABTS 및 DPPH 라디칼 소거활성($IC_{50}=83.30$, $403.88{\mu}g/mL$) 및 MDA 생성 억제 활성($IC_{50}=62.10{\mu}g/mL$)을 보여주었고, in vitro 아세틸콜린 분해효소 억제 활성은 $312.82{\mu}g/mL$의 $IC_{50}$ 값을 나타내었다. 또한, MC-IXC 뇌 신경세포에 과산화수소를 처리하여 산화적 스트레스를 유발시킨 뇌 신경세포 사멸에 대해 보호 효과를 나타냈다. 갑주 백목 추출물의 인지기능 개선 효과를 확인하기 위하여 $A{\beta}$를 사용하여 인지기능 장애 마우스 모델을 수립하였으며, Y-미로, 수동 회피 및 Morris 수중 미로 실험과 같은 행동실험을 통해 인지 및 기억능력에 대한 개선 효과를 나타냈다. 이후 마우스 뇌조직에서의 아세틸콜린 함량의 증가 및 아세틸콜린 분해효소의 활성을 억제함으로써 cholinergic 시스템을 보호하였고, SOD, 환원형 GSH 및 MDA 함량 측정을 통해 항산화 시스템을 개선시켜줌을 확인하였다. 더불어 뇌 조직의 미토콘드리아에서 ROS의 생성 억제, MMP 보호 및 ATP 함량을 회복시켜주었으며, western blot 분석을 통해 $TNF-{\alpha}$와 같은 염증성 사이토카인을 억제시켜 줌으로써 면역반응에 관여하는 JNK의 인산화를 감소시키고 Akt 신호전달을 활성화시켜 세포자동 사멸화를 억제시키는 것으로 확인되었다. 마지막으로 HPLC 분석을 통해서 갑주백목의 주요 생리활성물질이 갈산으로 확인되었다. 이러한 결과를 종합하였을 때, 갑주백목 에탄올 추출물은 뇌 조직에서의 cholinergic 및 항산화 시스템 보호효과를 통해 $A{\beta}$ 처리에 대하여 학습 및 기억 능력을 개선 시킬 수 있는 천연 소재로서의 가능성뿐만 아니라 $A{\beta}$ 및 과산화수소로부터 유발된 산화적 스트레스의 환경에서 뇌신경세포를 보호함으로써 알츠하이머성 질환과 같은 퇴행성 뇌신경질환을 예방할 수 있는 고부가가치 건강기능식품 소재로서의 활용 가능성을 확인하였다.
신경흥분독성과 간질발작발현은 glutamate 수용체활성과 연관이 있다고 알려져 있다. a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionate (AMPA), kainate 수용체에 대한 glutamate 활성을 포함하는 다양한 기전을 가진 항전간제인 Topiramate는 신경보호작용을 가진다는 증거가 제시되어 Topiramate가 간질발작 후 해마의 glutamate 수용체 발현에 미치는 효과를 관찰하였다. 흰쥐에 kainate를 복강 내 주사하여 간질중첩증을 유발시킨 후 Topiramate를 1주일 주사하였다 Apop tag in situ detection kit를 이용하여 세포손상을 관찰한 결과 kainate 유발 간질중첩증 1주일 후 해마의 CA1, CA3에서 심각한 세포사를 보였으나, Topiramte 처리 군에서는 세포사가 현저히 감소하였다. 간질중첩증 이후 NMDA 수용체 아형 1,2a, 2b 발현이 현저히 증가했으나 Topiramate 처치에 의해 NMDA수용체의 발현에는 뚜렷한 변화가 없었다. AMPA수용체에서는 GluR1이 간질중첩증 이후 현저히 상향 조정되었고 GluR2는 현저히 하향조정 되었다 Topiramate 1주일 처리 시 간질중첩증으로 인해 변화된 CluR1과 GluR2의 발현이 역전되었다. 결론적으로 Topiramate는 간질중침증에 의한 CluR1/CluR2 발현비의 증가로 유발되는 흥분성 신경세포사를 억제시킴으로써 신경보호작용이 있는 것으로 보인다.
이 연구는 Ⅰ) 혈관 폐색에 의한 인지 및 기억장애 동물모델에서 뇌졸중 치료제로써 인간배아줄기 세포의 신경세포 보호효과 및 작용기간을 밝히며, Ⅱ) 행동 약리학적 연구를 통해 기억력증진에 미치는 효과에 대해 밝히고 혈관 폐색에 의한 동물모델에서의 기억기능 증진 및 세포효과를 검증하고자 실시하였다. 중대 뇌동맥 폐색에 의한 쥐의 동물모델은 Sprague Dawley계 흰 쥐(260∼300 g)의 국소 중대뇌동맥을 일시적으로 폐색시켜 만들었다. 본 연구(미국 국립보건원에 등록된 MB03세포)에 사용된 인간배아줄기세포는 3×10⁴ cells/㎠ 밀도의 배양접시 내에서 4일 동안 embryoid bodies(EBs)의 형성을 위해 집합체를 이루도록 유도하였다. (중략)
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[게시일 2004년 10월 1일]
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