We carried out an image analysis of living cells forming their contacts at the bottom of the cell culturing substrate. In order to visualize the contact area selectively, we adopted total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) method, which can illuminate the specimen volume within only several hundred nano-meters above the substrate. From the fluorescent intensity of the TRF image, we could calculate the distance of the cell surface from the substrate. As a result, we visualized the origin of cell contacts, their movements, and the change of cell-contact type from the close-contact into focal-contact with information of its vertical displacement representing the temporal evolution process of the three-dimensional cell-surface-profile near the contact area during this metamorphosis.
임상에서 암 관련 질병의 확진을 위해 영상장비를 이용한 기초 진단 이후 추가적인 방법으로 생체검사 등을 이용한 병리적 검사가 필수적이다. 이러한 생체검사를 진행하기 위해서는 전문지식을 가진 종양학자, 임상병리사 등의 도움과 최소한의 소요시간은 확진을 위해 반드시 필요하다. 최근 들어, 인공지능을 활용한 암세포의 자동분류가 가능한 시스템 구축에 관련된 연구가 활발하게 진행되고 있다. 하지만, 이전 연구들은 한정된 알고리즘을 기반으로 하여 세포의 종류와 정확도에 한계를 보인다. 본 연구에서 심층 학습의 일종인 합성곱 신경망을 통해 총 4가지의 암세포를 식별하는 방법을 제안한다. 세포 배양을 통해 얻은 광학영상을 OpenCV를 사용하여 세포의 위치 식별 및 이미지 분할과 같은 전처리 수행 후, EfficientNet을 통해 학습하였다. 모델은 EfficientNet을 기준으로 다양한 hyper parameter를 사용하고, InceptionV3을 학습하여 성능을 비교분석 하였다. 그 결과 96.8%의 높은 정확도로 세포를 분류하는 결과를 보였으며, 이러한 분석방법은 암의 확진에 도움이 될 것으로 기대한다.
임상병리 검사분야에 있어서 환자로부터 유래된 조직이나 세포의 형태학적 변화, 세포 생리, 세포 내 분자의 추적 및 신호전달 체계 등의 임상검사 및 관련 연구를 위한 빼놓을 수 없는 주요한 진단과 연구장비로서 현미경이 가지는 의미는 크다고 할 수 있다. 현미경에 대한 포괄적인 지식과 이해를 바탕으로 현미경의 올바른 사용, 관리와 유지보수는 신뢰도 높은 이미지 획득과 그에 따른 정확한 데이터 분석을 통한 질병의 진단을 위해서 반드시 요구되는 부분이라고 할 수 있다. 광학현미경의 표준 운영 절차(standard operating procedure, SOP)는 현미경의 작동 절차와 함께 검사실 규모에 따른 현장 사용자의 체계적인 현미경 장해 해결 방안과 기계적 원리에 대한 핵심 정보가 함께 수록되어야 한다. 현미경 유지관리 업무에는 대물, 접안렌즈와 현미경 내부 광학필터의 청소, 광원의 교체와 교정, XY재물대 유지보수, 공초점 레이저 주사 현미경(confocal laser scanning microscope)에서의 점확산함수(point spread function, PSF) 측정, 형광현미경에서의 검사 품질관리(quality control, QC)와 체계적인 현미경 장해 해결방안 등이 포함되어야 한다. 본 종설에서는 국제적 기준에 따른 레이저의 위험도에 따라 일부 현미경에 장착된 레이저 광원에 대한 안전지침과 보호장구에 대한 내용을 함께 소개하였다. 현미경을 통해 획득된 이미지는 촬영된 시점의 검체에 대한 모든 정보를 제공한다고 할 수 있으며, 적절한 유지보수 프로그램과 그에 따라 적합하게 관리된 현미경만이 이미지 데이터를 통한 정보의 획득, 올바른 해석과 정확한 진단에 반드시 필요한 선제 조건들이라고 하겠다.
목적: 본 연구에서는 한국관박쥐 망막에서의 시각계를 이해하기 위하여 한국관박쥐의 망막 내 글루타메이트 및 ${\gamma}$-aminobutyric acid (GABA), 아세틸콜린과 같은 중추신경계의 주요 신경전달물질과 수용체, 신경교세포인 뮬러세포의 분포를 분석하였다. 방법: 성체 한국관박쥐의 망막을 대상으로 하였다. 망막을 수직 절편한 다음, 표준면역세포화학법을 적용하였다. 공초점 현미경을 사용하여 면역형광이미지 내 면역반응성을 확인하였다. 결과: 한국관박쥐의 망막에서 글루타메이트에 대한 면역반응성을 나타내는 신경세포들은 주로 신경절세포층에 존재하였다. GABA에 대한 면역반응성을 가지는 신경세포들은 내핵층에 주요하게 분포했으며, GABA의 수용체들은 내망상층에 존재하였다. 아세틸콜린의 면역반응성 신경세포들은 주로 내핵층에 위치하고 있었으며, 니코틴성 아세틸콜린 수용체 각각의 면역반응성들은 대부분 내망상층에 밀집해 있었다. 한국관박쥐의 망막에서 신경교세포 중 하나인 뮬러세포는 신경절 세포층에서 외핵층까지 길게 뻗어 있었다. 결론: 본 연구를 통하여 한국관박쥐의 망막에도 다른 포유동물의 망막에 있는 주요 신경전달물질 및 수용체, 뮬러세포가 존재한다는 것이 밝혀졌다. 이와 같은 연구결과는 한국관박쥐는 조직화된 망막 신경회로를 가지는 기능적 망막을 가지고 있음을 의미한다.
본 연구에서는 Chlorin e6 (Ce6)를 입힌 자궁경부암세포를 사멸시키기 위해 레이저 또는 LED를 인가한 PDT (photodynamic therapy)을 실시하고, Ce6 농도와 투여 시간별 사멸도의 변화를 실험하였다. 이를 위해 자궁경부암세포에 광자극을 인가한 후 영상의 처리 및 CCK-8을 이용한 정량적인 평가를 진행하였다. 실험 결과, Ce6은 일정 농도가 높아질수록 많은 양의 세포가 사멸되었고, Ce6를 이용한 PDT 실험군에서 사멸도가 높은 것을 확인하였다. LED와 레이저를 비교하였을 때 레이저는 국소적 위치만 세포의 사멸이 가능하고 LED는 비교적 넓은 범위의 사멸에 효과적인 결과를 확인하였다. 또한 레이저와 같이 국소적 위치를 조사하는 경우 세포 생존도 측정 시 해당 위치의 이미지를 획득한 후 영상처리를 통한 정량분석을 시행하는 방법이 효과적임을 확인하였다.
암 세포 주변의 저산소증은 방사선, 항암치료제, 절제술 등을 이용한 항암치료법에 중요한 역할을 하는데, 특히 암세포 주변의 모세혈관 내에서의 산소의 이동 분석은 암의 발달 및 전이, 주변 혈관의 생성과 변이에 직간접적 영향을 미친다. 따라서 현재 암 병변 주변의 모세혈관 내 헤모글로빈 산소포화도를 측정하고 혈관의 생성 및 변이상태를 측정하는 연구가 활발하게 진행되고 있지만, 대부분의 계측장비는 침습적인 방법으로 진행되며, 해상도 또한 기대이하의 공간 및 시간영역을 제공하는 한계가 있다. 따라서 본 연구에서는 비침습적 헤모글로빈 산소포화도 이미지와 다양한 이미지프로세싱 기법을 이용하여 실시간 혈관변화의 분석을 통해 암 혈관 생성 및 변이의 특성을 제공할 수 있는 초분광 이미징 시스템 활용 방법을 제시하고자 한다.
본 연구에서는 고압산소치료 후 포유동물의 피부에서 Melanin 세포의 생성이 줄어들었음을 이미 보고된 바 있고, 치료 후 전층 피부이식 생존율을 높였고, 또한 인체의 피부 진피층 확인은 더 많은 임상데이터가 필요하나 고압산소치료 후 표피면의 변화는 빠른 시간에 확인 할 수 있다고 판단됨으로 이에 피부진단기의 기준면과의 평행(parallel polarization) 이미지로 피부표피의 변화를 확인 하고자 했다. 본 연구의 고압산소챔버를 활용한 피부표피에 대한 분석 및 실험 결과, 주름살 및 상처(Wrinkle & Scar) 분석에서 피실험자 남자1 3%, 남자2 2%, 여자1 5.9%, 여자2 2.3%로 피실험자 모두 감소 현상을 보여 피부 탄력도가 좋아 지는 효과를 보였다. 피부미백(S-Gray) 분석에서는 피실험자의 피부 표피면의 멜라닌 및 에리즈마 색소의 피부 톤이 남자1 1.1%, 남자2 2.3%, 여자1 4% 로 피실험자 4명 중 3명은 상승 효과를 얻었으나, 피실험자 다른 1명인 여자2는 2.3% 하향의 결과가 나타났다. 홍도(Erythema) 분석, 피실험자 정상인 부위인 D.BLUE/BLUE 값이 남자1 5.6%, 남자2 4.9%, 여자1 17.3%, 여자2 15.3% 증가 현상을 보였으며 남자와 여자의 효과 차이가 10% 이상으로 나타낸 것으로 보아 남자 보다는 여자가 우세한 것으로 판단되었으며, 비정상인 에리즈마 색소(민감도)의 비정상인 부위인 YELLOW/RED 컬러 값에서 남자1 5.2%, 남자2 5%, 여자1 9.2%, 여자2 4.5% 감소 하였음을 보였다. 이에 피실험자 모두 에리즈마인 민감성 산소치료에 따른 피부에 미치는 영향이 효과가 있는 것으로 판명되었다.
체세포 핵이식에 의한 복제기술은 매우 낮은 성공률 나타내고 있어 실용화에 지장을 초래하고 있다. 이것은 후생적인 유전현상인 reprogramming이 불완전하게 이루어지기 때문인 것으로 추측되어지고 있다(Reik et al., Theriogenology 2003, 59: 21-32; Han et al, Theriogenology 2003, 59: 33-44). 체세포 핵이식 후에 태아사망의 원인이 태반의 비정상적인 기능과 관계가 있는 것으로 추정되는데 복제시 태아사망의 원인을 찾기 위해 본 연구를 시행하였다. 한우에서 체세포 복제 후 임신 말기에 태아가 사망한 태반조직 3개와 IVF 수정란 이식 후 동일한 시기에 제왕절개술을 실시한 태반조직 2개를 실험에 이용하였다. 태반 protein을 Two-Dimensional electrophoresis와 Mass spectrometer를 이용하여 분석 비교하였다. IPG-system을 이용하여 pH 4~7, pH 6~9에서 1차 전기영동을 한 후, 8~l6%의 SDS-PAGE gel에 2차 전기영동을 실시하였고 G-250 Coomassie로 염색하였다. gel 이미지는 Malanie III program을 이용하여 분석하였다. 전체 gel에서 약 1800개의 구분 가능한 protein spot이 나타났다. pH 4~7 범위에서 양적으로 차이나는 것 15개 중 복제한우 태반에서 증가되는 protein spot 5개와 감소하는 protein spot 10개를 골라 protein identification을 실시하였다. MALDI-TOF-MS를 이용하여 동정한 결과 phosphatidylinositol transfer protein-$\alpha$와 interleukin-18 등의 protein이 복제태반에서 발현이 증가되었고, 복제한우에서 발현이 감소되는 것으로는 vimentin, Rho-GDI-$\beta$, TRAST $\beta$-chain, ovarian sterol carrier protein 2, triosephosphate isomerase, tropemyosin beta chain, Aldose reductase 등으로 나타났다. 이러한 protein들은 inositol 지질 신호전달과 면역시스템, 세포분열, 산소 운반, steroidogenic 세포에서의 콜레스테롤 이동, 촉매 작용, 대사 작용 등에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 체세포 복제에 의한 태아사망 원인은 태반에서 이러한 protein들의 비정상적인 발현에 기인된 것으로 추정된다.
최근 대기압 플라즈마 젯을 이용한 바이오/메디컬의 활발한 응용연구가 진행 중이다. 박테리아 및 세균의 살균은 물론 암세포 세포예정사에 핵심적인 역할을 하는 활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS) 또는 다양한 라디칼들은 대기압 플라즈마의 다양한 변수를 이용하여 조절할 수 있다고 알려져 있다. 수십 kHz의 고전압에서 발생된 마이크로 헬륨 플라즈마 젯에서 질소종의 제어를 통해 같은 부피의 플라즈마 젯에서의 방출광을 살펴보았다. 또한 광섬유센서를 이용하여 플라즈마의 기체온도를 측정하고 Boltzmann plot method를 통해 전자의 여기온도 변화를 관찰하였다. 실험의 결과, 같은 부피의 플라즈마에서 질소종이 증가할 때 기체온도는 큰 변함이 없지만 여기온도가 증가하는 것을 관찰하였다. 시간분해 이미지 촬영으로 질소종의 양에 따른 플라즈마 불릿의 속도 변화를 분석을 하였고, 최종적으로 대기압 플라즈마 젯의 질소종 변화에 따른 대장균의 비활성화 정도를 관찰하였다.
목적: 한국관박쥐 망막의 기능을 알아보기 위해서 흥분성 신경전달물질인 글루타메이트 수용체의 분포도를 분석하였다. 방법: 성체 한국관 박쥐의 망막을 $40{\mu}m$ 수직 절편 한 후 표준면역세포화학법을 이용하였다. 면역형광이미지는 Bio-Rad MRC 1024 공초점 현미경을 사용하여 얻었다. 결과: AMPA (GluR1-4), Kainate (GluR5-7, KA1-2), NMDA (1, 2A, 2B)는 내망상층과 외망상층에 주로 분포되어 있었다. KA1은 신경절세포층에도 많은 수의 수용체가 존재하였다. 결론: 한국관박쥐는 포유류망막에 있는 신경세포와 신경전달물질을 동일하게 가지고 있었다. 한국관박쥐도 기능적 망막을 가지고 있음을 제시한다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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