• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
• /
• 제34권2호
• /
• pp.117-124
• /
• 2007

목 적: 본 연구는 생쥐 전핵시기 배아를 완만동결법과 유리화동결법으로 동결-융해 후 배아의 생존율과 성장률을 비교하고자 시행하였다. 연구방법: 과배란을 유도한 생쥐로부터 전핵시기 배아를 획득하여 10% SSS가 첨가된 HTF 배양액으로 약 1시간 동안 배양한 후 두 개의 전핵이 관찰되는 정상적인 형태의 배아만 선별하여 동결하였다. 동결방법으로는 1.5 M PROH에 0.1 M sucrose가 함유된 완만동결법과 40% ethylene glycol, 18% Ficoll, 0.5 M sucrose가 혼합된 EFS40 용액과 EM grid를 이용하여 이용한 유리화동결법을 실시하였다. 동결-융해 후 전핵시기 배아의 회수율, 생존을 및 부화 포배기로의 성장률과 부화율을 비교하였다. 결 과: 각각의 방법으로 동결-융해 후 24시간 동안 배양하였을 때 2-세포기까지의 성장률은 완만동결군이 59.1%이었고 유리화동결군이 77.0%로 두 군간에 유의한 차이를 보였고 (p<0.003), 48시간 동안의 배양에서도 완만동결군이 53.3%이고 유리동결군이 72.6%로 유의하게 유리화동결군에서 높은 수세포기까지의 성장률을 보였으며 (p<0.003), 72시간 배양하였을 때의 상실배로의 성장률 역시 완만동결군이 46.7%이고 유리화동결군이 67.3%로 유리화동결군에서 유의하게 높은 성장률을 보였다 (p<0.001). 융해 후 144시간 동안 배양하였을 때의 부화포배기로의 성장률은 완만동결군이 26.3%이고 유리화동결군이 43.4%로 유리화동결군에서 유의하게 높은 성장률을 보였다 (p<0.005). 결 론: 생쥐 전핵시기 배아의 동결보존에서 유리화동결법은 완만동결법 보다 시간이 단축되고 비싼 장비가 필요없어 경제적이고 간단했을 뿐 아니라 동결-응해 후 전반적으로 높은 생존율과 성장률을 나타내었다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
• /
• 제2권2호
• /
• pp.197-203
• /
• 1998

포유류 배아발생 중 DNA 메틸화는 세포분화와 유전자발현에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 생쥐 착상전 초기배아 발생 중 메틸화효소에 의해 유지되는 DNA 메틸화의 중요성과 자세한 기작은 잘 이해되고 있지 않다. 이 연구에서 DNA 메틸화의 역할에 관하여 알아보기 위하여, 성숙난자와 착상전 초기배아에서 DNA 메틸전이효소의 발현양상을 조사하였다. 이를 위해, DNA 메틸전이효소를 암호화하고 있는 cDNA에서 primer를 고안하였다. Primer의 정확도와 PCR조건의 적합화를 통하여, DNA MTase 전사물이 성숙난자와 착상전 초기배아에서 검출되었다. DNA MTase의 mRNA량은 성숙난자에서 가장 높으며, 전핵시기까지 비슷한 정도로 유지되었다. 이후 8-세포기까지 지속적으로 감소하다 상실기 배아에서 다시 검출되어 포배기까지 증가하는 양상을 보였다. 그리고, RNA polymerase II 억제제를 전핵시기 배아에 처리하여, 난자와 전핵시기 배아에 다량 존재하는 전사물이 모계유래인 것을 확인하였다. 결국, 난자와 전핵시기 배아에 상대적으로 다량 존재하는 DNA 메틸전이효소의 전사물은 아마도 착상전 초기배아에서 DHA 메틸화의 유지에 필요하며, 착상전 초기배아 발생에 있어서 유전자발현과 세포분화에 영향을 줄 것임을 시사하고 있다.

• 대한생식의학회:학술대회논문집
• /
• 대한불임학회 1996년도 추계 학술대회 및 정기총회
• /
• pp.39-40
• /
• 1996

• 한국발생생물학회지:발생과생식
• /
• 제3권1호
• /
• pp.75-85
• /
• 1999

생쥐 초기 배아의 형태형성에 영향을 주는 세포질내 인자의 기원과 작용기작을 연구하기 위해 단백질 합성과 단백질 활성화 효소 (protein kinase)의 억제제를 처리한 배아의 세포질로 재조합된 배아에서 발생과 RNA합성, 단백질 인산화를 조사하였다. 단백질 합성 억제제인 cycloheximide (CHX)가 함유된 배양액에서 24시간 배양한 1-세포 배아의 제핵된 세포질을 두 개의 전핵을 모두 가진 절반의 1-세포 배아와 재조합한 P+P-CHX군의 배아 발생과 유전자의 활성화는 P+P군의 배아와 유사하였으나, 밀집 형성과 밀집형성이 일어나는 세포 시기는 빨라져서 P+2군과 유사하였다. 또한 초기 배아의 발생 시 1-세포기에서 2-세포기 사이에 일어나는 단백질 인산화가 형태형성과정에 미치는 영향을 알아보기 위해, tyrosine protein kinase와 serine-threonine protein kinase의 억제제인 genistein (Gen)과 6-dimethylaminopurine (6-DMAP)이 처리된 배아의 제핵된 세포질과 2개의 전핵을 가진 절반의 1-세포 배아를 융합시킨 P+2-Gen과 P+2-DMAP군 배아의 발생과 밀집현상을 대조군인 P+P와 P+2군과 비교하였다. P+2-Gen과 P+2-DMAP군 배아에 발생은 대조군에 비해 빨랐으며, 특히 P+2-Gen군 배아는 밀집이 4-세포기에 일어나 8-세포기에 일어나는 P+2-DMAP군의 배아에 비해 일어나는 시간과 세포 시기가 빨라졌다. SDS-PAGE 방법으로 분석한 재조합 3시간째 P+2-Gen과 P+2-DMAP군의 단백질 인산화량은 대조군인 P+P와 P+2군에 비해 증가하였으나 종류의 변화는 없었다. 한편 2차원 전기영동법을 이용하여 P+2-DMAP군의 배아에서 P+2-Gen에 비해 80KD와 110KD 단백질의 인산화가 억제된다는 결과를 얻었다. 이상의 결과들은 생쥐의 초기 배아에서 형태 형성의 조절은 유전자 활성화 또는 난자내 모계 mRNA에 의해 수정 후 합성되는 새로운 단백질에 의한 것이 아니고, 난자내에 존재하는 인자에 의해 조절됨을 시사한다. 이 인자들 중 단백질의 인산화는 배아 발생과 형태형성에 밀접한 관계가 있으며, 특히 초기 1∼2세포기 사이에 serine-threonine protein kinase에 의해 인산화되는 단백질이 밀집현상을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
• /
• 제20권1호
• /
• pp.31-36
• /
• 1993

The effects of freezing and 1,2-propanediol on early and late pronucleate stage mouse ova were investigated in terms of survival after thawing and development in vitro. The samples were divided into two groups according to different age in pronucleate ova: ova in(1) early pronuclear stage with two distant pronuclei at 18h after hCG injection, and (2) late pronuclear stage with adjacent pronuclei at 30h. Zygotes in the late pronuclear stage have been proven to be more resistant to 1,2-propanediol, showing a significantly higher developmental rate than zygotes in early stage (80.3 versus 66.3%, <0.05), but survival rate was similar in the two groups (91.0 versus 93.5%). After freezing and thawing, survival and developmental rates were decreased in both groups when compared to the control group (54.3 versus 92.3%, 47.7 versus 73.3%. respectively). And developmental rate in the late pronuclear stage zygotes showed significantly higher than in early (55.4 versus 40.0%) after thawing. In conclusion, early pronucleate mouse ova have a lower developmental capacity in vitro and a lower survival rate after freezing and thawing than late ova. These findings suggest that the timing of freezing could be important for survival and further development in vitro in cryopreservation of human pronucleate ova.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
• /
• 제25권1호
• /
• pp.59-64
• /
• 1998

This study was designed to evaluate the influence of pronuclear age on the survival and post-thawing development after cryopreservation of mouse embryos. Freezing and thawing were performed in the different pronuclear stages of mouse embryos after IVF. Embryos were obtained from $F_1$ hybrid mice and classified into 4 groups according to the pronuclear stage (6hr, 9hr, 12hr and 15hr after insemination). Pronuclear ova were slowly cooled in a biological freezer using 1.5M 1,2-propanediol and 0.1M sucrose as cryoprotectant. Thawing was done at room temperature and 1,2-propanediol was removed by multi-step dilutions. Both frozen-thawed embryos and control fresh embryos were cultured in vitro in Ham's F-10 medium supplemented with 4mg/ml BSA. In control group, the development rate after 48hr was 99.3%, and the complete hatching rate after 144hr was 61.3%. In experimental groups, the survival rate after thawing was 95.4% in 6hr, 88.7% in 9hr, 75.2% in 12hr and 62.4% in 15hr after insemination, the development rate after 48hr was 61.1, 77.0, 67.0 and 79.6%, respectively, and the complete hatching rate after 144hr was 25.7, 43.7, 42.2 and 60.0%, respectively. The survival rate in 15hr was significantly lower (p<0.05) compared with other groups. In vitro development rates after 48hr were similar in all groups, but complement hatching rate was significantly lower (p<0.05) in 6hr group. In conclusion, cryopreservation of mouse pronuclear ova with 2 distinct pronuclei (9hr and 12hr groups) showed better results after thawing compared with early (6hr group) or late pronuclear ova just prior to cleavage (15hr group).