• Proceedings of the KSAR Conference
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• 2001.03a
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• pp.63-63
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• 2001

본 실험은 소에서 체외수정란과 복제수정란을 modified CRlaa (mCRlaa) medium에서 각각 배양하였을 때 배반포단계까지 발육율을 비교하였다. 체외성숙은 TCM-199 medium에 10 %의 Fetal Bovine Serum (FBS)를 첨가한 배양액에서 실시하였고 이를 이용해 체외수정과 복제를 시행하였다. 체외성숙란과 복제수정란의 배반포까지 발육율은 각각 22.5 %, 19.4 %이었다. 복제수정란을 생산하기 위해서는 제핵을 실시한 난자내로 공여핵를 도입하는 과정이 필요한 데 할구보다 체세포를 이용하는 경우 융합율이 저하되는 것으로 보고되고 있다. 따라서 본 연구에서는 공여핵을 제공하는 체세포와 수핵란간에 융합을 기존에 많이 사용한 chamber와 비교해 Needle을 사용했을 때 복제수정란의 발육율간의 차이를 서로 비교하였다. Ear skin cell을 이용해 핵이식을 실시한 다음 Zimmerman cell fusion medium에서 융합하였다 융합된 핵이식란은 5 % $CO_2$, 5 % $O_2$, 90 % Na, 38.5$^{\circ}C$ 조건에서 배반포까지 배양하였다. Chamber와 Needle을 사용한 경우 융합율은 각각 46.1 %, 70.4 %, 분할율은 62.6 %, 76.4 %로 Needle의 경우가 유의적으로 높았다.

• Proceedings of the Korean Society of Embryo Transfer Conference
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• 2002.11a
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• pp.89-89
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• 2002

2001년도 국내에서 실시된 가축의 수정란이식 현황을 파악하기 위하여 전국의 수의·축산분야의 대학, 국·공립 축산관련 연구소, 농업기술센터, 가축 인공수정소 및 동물병원 등의 108개 관련기관에 2001년 1월 1일부터 12월 31 일까지 소, 돼지 및 기타 동물의 수정란 생산, 이식 및 임신진단 결과에 대하여 설문서를 통하여 조사하였으며, 설문서를 작성하여 제출한 51개 기관의 자료를 분석한 결과는 다음과 같다. 가축의 수정란이식을 실시하고 있는 기관은 국림기관 4개소, 지방자치단체 10개소, 대학 11개소, 생산자단체 2개소, 개인 시술소 25개소로 전체 51개소였다. 한우 및 젖소 228두를 과배란 처리하여 회수된 난자수는 1,536개였으며, 그 중 이식가능 수정란 수는 995개로 두 당 평균 4.4개였다. 체외수정의 생산은 OPU유래 244개, 도축난소 유래 20,957개, 복제수정란 8,154개로 29,355개의 이식가능 체외수정란을 생산하였다. 한우에서 수정란이식은 체내수정란 359개, 체외수정란 2,686개, 복제수정란 713개 등 3,758개가 이식되었고, 젖소에는 체내수정란 U개, 체외수정란 120개, 복제수정란 106개 둥 294개가 이식되었다. 이식된 수정란의 상태별로는 신선수정란이 61.7%(2,500개), 동결수정란이 38.3%(1,552개) 이식되었고, 수란우의 품종별로는 한우 수정란을 한우 수란우에 1,471개, 젖소 수란우에 2,287개가 이식되었고, 젖소 수정란을 젖소 수란우 236개, 한우 수란우에 58개가 이식되었다. 수정란이식 수란우의 수태율은 임신진단이 이루어진 체내수정란이식(368 두)은 32.3%, 체외수정란이식(968두)은 40.4%, 복제수정란이식(536두)은 9.3%였다. 기타동물의 체내수정란 생산은 돼지 105두에서 1,623개, 염소 2,662두에서 1,720개, 기타 39두에서 228개의 수정란을 회순 하였으며, 돼지에서 체내수정란 695개, 체외수정란 1,200개, 복제수정란 67,750개 이식되었고, 기타동물에서 58,950개가 이식되었다.

• Proceedings of the Korean Society of Developmental Biology Conference
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• 2003.10a
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• pp.131-131
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• 2003

2002년도 국내에서 실시된 가축의 수정란이식 현황을 파악하기 위하여 전국의 수의ㆍ축산분야의 대학, 국ㆍ공립 축산관련 연구소, 농업기술센터, 가축인공수정소 및 동물병원 등의 168개 관련기관에 2002년 1월 1일부터 12월 31일까지 소, 돼지 및 기타 동물의 수정란 생산, 이식 및 임신진단 결과에 대하여 설문서를 통하여 조사하였으며, 설문서를 작성하여 제출한 32개기관의 자료를 분석한 결과는 다음과 같다. 가축의 수정란이식을 실시하고 있는 기관은 국립기관 4개소, 지방자치단체 10개소, 대학 7개소, 생산자단체 3개소, 개인시술소 148개소로 전체 172개소였다. 한우 및 젖소 185두를 과배란처리하여 회수된 난자수는 1,334개였으며, 그 중 이식가능수정란수는 871개로 두당 평균 4.7개였다. 체외수정의 생산은 OPU유래 266개, 도축난소 유래 16,650개, 복제수정란 21,852개로 38,768개의 이식가능 체외수정란을 생산하였다. 한우에서 수정란이식은 체내수정란 475두, 체외수정란 7,515두, 복제수정란 257두 등 8,247 두가 이식되었고, 젖소에는 체내수정란 68두, 체외수정란 58두, 복제수정란 435두 등 294두가 이식되었다. 이식된 수정란의 상태별로는 신선수정란이 73.9% (6,511두), 동결수정란이 26.1%(2,297두) 이식되었고, 수란우의 품종별로는 한우 수정란을 한우 수란우에 690두, 젖소 수란우에 7,557두가 이식되었고, 젖소 수정란을 젖소 수란우 81두, 한우 수란우에 480두가 이식되었다. 수정란이식 수란우의 수태율은 임신진단이 이루어진 체내수정란이식은 33.8% (160/472두), 체외수정란이식은 34 7%(1,547/4,456두), 복제수정란이식은 10.5%(70/669두)였다. 소의 수정란이식두수는 2001년도에 비해 217%(8,808/4,052두)가 증가하였다. 돼지에서 체내수정란은 공란두 30두에서 505개의 이식가능수정란을 회수하였으며, 체외수정란은 351,777개를 생산하였고, 형질전환수정란을 수란돈 20두에 1,919개를 이식하였었다. 염소에서는 7두의 공란축으로부터 47개의 이식가능 수정란을 회수하였다.

• Proceedings of the KSAR Conference
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• 2004.06a
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• pp.255-255
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• 2004

본 연구는 한우 체세포 복제수정란의 발달에 있어서 난자가 체외성숙 된 시간이 미치는 영향을 확인하고, 또한 체외성숙 시간별 성숙난자의 MPF 활성도 변화를 조사함으로서 소 복제수정란 생산을 위한 적정 체외성숙 조건을 살펴보는데 목적이 있었다. 도축된 한우로부터 채취된 난소로부터 미성숙 난자를 채취하여, 1 ㎍/㎖ FSH와 1 ㎍/㎖ E2가 첨가된 TCM-199 배양액에서 18, 20, 22시간 체외성숙 후에 각각 성숙난자를 회수하여 22시간째 제핵을 실시하였다. (중략)

• Development and Reproduction
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• v.7 no.2
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• pp.61-68
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• 2003

Zygote genome should entail a complex process of epigenetic reprogramming including a global DNA demethylation to reach a totipotency or pluripotency during early mammalian development. In this study, we have analyzed methylation patterns in cloned bovine embryos to monitor the epigenetic reprogramming process of donor genomic DNA. Aberrant DNA methylation patterns were observed in various genomic regions of cloned embryos except single-copy gene sequences. The overall genomic methylation status of cloned embryos was quite different from that of normal embryos produced in viかo or in vivo. Abnormal methylation profiles were also specifically represented in trophectoderm cells of cloned embryos, which probably result in widespread gene dysregulation in extraembryonic region or placental dysfunction familiar to cloned animals. Our findings suggest that developmental failures of cloned embryos are due to incomplete epigenetic reprogramming of donor genomic DNA. Understanding the epigenetic reprogramming processes of donor genome will clearly define the faulty development of cloned embryos.

• Proceedings of the KSAR Conference
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• 2001.03a
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• pp.65-65
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• 2001

본 연구는 칡소 귀세포를 공여핵으로 이용한 체세포 복제송아지 생산에 있어서 배양방법이 배발생 및 배반포 발달율에 미치는 영향과 체세포 복제란의 이식후 수태율에 미치는 영향을조사하여 복제송아지의 생산 효율을 제고하고자 실시하였다. 실험에 공시된 공여핵은 칡소 의 귀세포를 회수하여 10%FBS가 첨가된 DMEM배지에서 3-4일 동안 배양하여 monolayar Confluent 형성 후 0.25% trypsin을 처리하여 준비하였으며 공여세포는 적어도 passage가 5회 이상의 세포만을 사용하였다. 복제수정란의 생산은 18-20시간 동안 체외성숙 된 난자의 핵을 제거하고 공여핵을 주입하여 2.2kv/cm, 10$\mu\textrm{s}$의 전압으로 2회 자극함으로 융합하였으며, 융합된 난자는 5$\mu\textrm{g}$/$m\ell$ ionomycin에서 4분간, 1.9mM 6-dimethyl aminopurine에서 4시간동안 배양하여 활성화처리를 하였다. 핵이식수정란의 배양은 39$^{\circ}C$, 5%$CO_2$ incubator에서 처리구 I은 CRlaa에서 4일간 배양 후 CR2aa배지에서 배양, 처리구II는 CRlaa에 4일간 배양후 CR2aa배지에 cumulus cell과 공배양, 처리구III은 CR2aa 배지에 camulus cell과 함께 배양하였다. 수정란이식은 발정발현 7일째에 비외과적 방법으로 젖소 미경산우에 이식하였으며 이식란수는 2~4개의 핵이식된 수정란을 이식하였다. 임신진단은 45~60일 사이에 직장검사 및 초음파 진단기를 이용하여 실시하였다. 배양방법에 따른 배발생율은 처리구 I에서 92.2 %(83/90)으로 처리구II와 III의 62.4%(63/101)와 77.8%(144/185)에 비하여 높게 나타났으나 배반포 발달율은 처리구II와III에서 65.1%(41/63)와 50.0%(72/144)로 처리구 I의 30.1%(25/83)보다 높게 나타났다. 각 처리구에 따른 수정란 이식후 수태율은 처리구II와 III에서 공히 20%의 수태율을 나타낸 반면 처리구 I에서는 수태가 되지 않았다. 따라서 체세포 복제수정란의 생산에 있어서 배반포 발달율과 수태율을 높이기 위해서는 단순배양보다 공배양이 더 효과적인 것으로 사료되지만 이런 결과가 복제송아지 생산효율에 있어서도 효과적일지는 향후 더 많은 연구가 있어야 할 것으로 사료된다.

• Proceedings of the KSAR Conference
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• 2003.06a
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• pp.41-41
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• 2003

본 연구는 한우 복제수정란의 이식에 의해 고능력 복제한우를 생산할 수 있는 효율과 산자의 성장능력을 검정하기 위해 수행되었다. 고능력 한우의 귀세포를 이용하여 체세포복제수정란을 생산하였고 그 신선수정란을 대리모에 이식한 결과는 다음과 같다. 2000년 (n=35)과 2001년 (n=121)에 이식한 복제소의 분만율은 각각 5.71%, 8.26%로 나타났다. 복제송아지의 임신기간은 평균 287일 (279~295일)이었으며 같은 기간내 인공수정 우군의 평균 임신기간인 287일 (255~293)과 동일하였다. 복제송아지의 분만시 사산율은 6.67%였으며, 인공수정시의 94.44%와 비슷하였다. 그러나 분만후 복제송아지의 생존율은 36.67%로서 인공수정의 100% 보다 매우 낮았다. 그리고 태어난 후 200일 이상 생존한 송아지의 생시 평균체중은 28.25kg (AI 23.67kg)이었고, 복제송아지의 경우 생시체중이 표준체중보다 적거나 (<20kg) 또는 거대체중 (>35kg)의 경우는 분만후 대부분 사망하였다. 상기 결과에 의해 현재의 복제기술에 의한 한우 생산효율은 아주 낮고 분만 후 거대체중등 비정상인 경우가 많아 생존율이 낮음을 알 수 있었다. 따라서 이에 대한 원인구명에 관한 기초연구의 확대가 요망된다.

• Proceedings of the KSAR Conference
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• 2003.06a
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• pp.37-37
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• 2003

본 연구실에서는 체세포복제 수정란 이식우의 분만전후 태아와 모체 및 태반과의 내분비적인 관계를 검토하기 위해 복제수정란 이식우의 분만 전후에 있어서, 혈중progesterone 과 TGF-$\beta$$_1$ 수준을 분석한 결과 정상우의 분만직전과 달리 혈중progesterone 및 TGF-$\beta$$_1$ 농도는 감소되지 않고 높은 수준을 그대로 유지되어 복제수정란이식우의 경우 정상적인 분만 signal이 나타나지 않는 것으로 나타났다. 본 연구는 체세포 복제소 수정란 이식우에 있어서 태반조직의 특성을 정상우의 동일한 시기의 태반과 비교 검토하였으며 분만시기에 있어서 태반의 역할을 검토하였다. 태반은 복제란 이식우 및 정상우 임신우를 술을 실시하여 태반을 채취하여 실험에 공시하였다. 정상우의 임신기간중 혈중 progesterone 농도는 임신초기와 중기에 다소 증가되어 유지되다가 임신말기에는 급격한 progesterone의 감소현상과 더불어 분만이 유기되는 것으로 나타났으나 복제우의 경우 분만예정일 직전까지 progesterone의 급격한 감소는 일어나지 않고 높은 농도로 유지되는 현상을 보였다. 이때 제왕절제 수술중 제대근방에 있는 태반궁부를 적출하여 중량을 측정한 결과 정상우의 궁부에 비해 유의적으로 무거웠으며, 이것은 태아의 중량과 정의 상관관계가 있음이 확인되었으며 태아 및 궁부의 중량이 무거울수록 분만 전후의 태아사망율이 높은 것으로 나타났다 이때의 궁부를 조직학적으로 검토한 결과, 복제우의 태반궁부는 정상우의 궁부에 비해 cytotrophoblast 및 syncytiotrophoblast가 적었으며 치밀하지 못한 형태를 확인할 수 있었다. 이때의 태반조직를 이용하여 세포질을 추출하여 단백질양상을 검토한 결과, 정상태반에 비해 복제태반은분자량 90kd, 65kd 및 18kd의 특이단백질이 존재하고 있음을 확인할 수 있었으며 이들 단백질을 HPLC system에 의해 분리한 결과 fraction 2와 3에서 특이한 단백질을 분리하였다. 이와 같이, 복제우의 태반에는 정상적인 임신과 분만을 비롯하여 복제송아지의 생존에 중요한 인자가 관여하고 있을 확인할 수 있었다.

• Korean Journal of Animal Reproduction
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• v.22 no.4
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• pp.419-424
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• 1998

The present study was carried out to examine the efficiency of cloning of transgenic embryos by nuclear transfer(NT) using gene-injected rabbit embryos. The rabbit embryos at pronuclear stage were microinjected with methallothionein-human growth hormone(MT-hGH) gene and cultured to 8- and 16-cell in TCM-199 containing 10% FCS with a monolayer of rabbit oviductal epithelial cells in a 5% $CO_2$incubator. The recipient oocytes were collected from the oviducts 14~16 h after hCG injection. The oocytes were enucleated and activated with 5$\mu$M ionomycin and 2mM 6-dimethylaminopurine. Blastomeres form gene-injected embryos were transferred into the enucleated oocytes by micromanipulation. The nuclear transplant oocytes were electrofused and co-cultured with rabbit oviductal cells. Following 120 h of culture, blastocysts were prepared for gene analysis by polymerase chain reaction(PCR). In previous experiment, the rate of gene-positive embryos detected by the nested PCR analysis was significantly decreased while developing to blastocyst(25%)(Kang et al., 1998). The fusion rate of gene-injected blastomeres was significantly(P＜0.05) lower than non-injected blastomeres(66% vs 80%). However, the NT embryos that were derived from gene-injected donor embryos did not differ from control embryos in development to the blastocyst stage(39% vs 31%). Of the 43 NT blastocysts developed from the gene-injected donor embryos, twelve(28%) were positive for the injected DNA. The results indicate that NT with gene-injected embryos can be successfully used for cloning and multiplication of transgenic embryos, furthermore applicable to improvement of transgenic animal production.

• Proceedings of the KSAR Conference
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• 2003.06a
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• pp.42-42
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• 2003

복제기술은 기존의 형질전환 동물 생산의 효율을 향상시킬 수 있는 기술로서 인정하고 있으며 또한 이를 이용하여 형질전환 동물의 생산이 이루어지고 있다. 따라서 본 연구는 표지유전자 (GFP)와 유용유전자 (hFSH)를 이용하여 임신 45일령에 채취한 태아섬유아세포에 transfection 하고, transfection 된 세포의 효율적인 선발과 이를 이용한 형질전환 복제 수정란을 생산하고자 실시하였다. 대조구 (KbFF), GFP (79KbFF-GFP c-3) 및 hFSH (79KbFF-hFSH n-1)에 공시한 세포는 모두 동일한 태아유래의 세포 (모 79, 부 KPN178,♂)를 이용하였다. pAB-eGFP와 hFSH 유전자는 각파 electroporation 방법을 이용하여 transfection 하고, 이를 2주 동안 G418로 배양하며 selection 하였다.