• 한국미생물·생명공학회지
• /
• 제37권2호
• /
• pp.153-159
• /
• 2009

Rhodobacter capsulatus 유래의 hemA 유전자를 항시발현 벡터(pHCEIIB vector)에 클로닝한 후 과발현시킨 Escherichia coli BLR(DE3) 균주를 사용하여, 5-aminolevulinic acid (ALA) 생산을 위한 적정 배양조건을 조사하였다. ALA 생산을 위한 배양온도는 $37^{\circ}C$보다는 $30^{\circ}C$에서 더 나은 결과를 나타내었다. Glycine 농도가 세포생장에 미치는 영향이 컸으며, 세포생장을 저해하지 않고ALA를 고농도로 생산하기 위한 적정 glycine 농도는 5-10 g/L 수준이었다. Succinic acid의 적정 첨가수준은 10-20 g/L이었으며, succinic acid의 일부를 glutamate로 대체할 경우에 ALA의 생산량을 향상시키는 효과가 있었다. 한편, 배지 중의 glucose 첨가는 ALA 생산성을 저하시키는 결과를 초래하였다. 이상과 같은 배양 조건 최적화를 통한 jar-fermentor 발효실험을 통하여, 고가의 유도제(IPTG)나 ALA dehydratase inhibitor를 첨가하지 않고도 8.2 g/L 수준의 고농도 ALA를 얻을 수 있었다.

• 한국미생물·생명공학회지
• /
• 제45권2호
• /
• pp.149-154
• /
• 2017

본 연구에서는 Bacillus 유래 esterase를 생산할 수 있는 재조합 대장균을 사용하여 유가식 배양을 이용한 고농도 균체 배양을 통해 esterase 생산성을 극대화하고자 하였다. 유가식 배양 중 순수 산소의 공급을 통해 용존산소를 30% 이상 유지한 경우와 포도당농도를 1 g/l 이상 유지한 경우 각각 $OD_{600}$ 76 (35.8 g/l DCW)과 $OD_{600}$ 90 (42.4 g/l DCW)까지 균체량을 증가시킬 수 있었다. 포도당의 공급에도 불구하고 배양 후반에 세포의 성장이 정체되는 현상을 극복하기 위해 yeast extract가 강화된 추가 배지의 공급을 시도하였으며, 그 결과 $OD_{600}$ 185 (87.3 g/l DCW)까지 고농도 균체 배양이 가능함을 확인하였다. 단백질 생산 수율의 향상을 위해 성장 시기에 따라 induction에 의한 세포 성장과 esterase 생산성을 평가하였고, 그 결과 대수 성장기 후반에 induction을 유도한 경우 세포 성장 측면에서는 최대 $OD_{600}$ 190(89 g/l DCW)까지 고농도 균체 배양이 가능함을 확인하였다. Esterase 생산성 측면에서는 대수 성장기 초반에 induction 을 유도한 경우에 비해 최대 5.8배 생산성이 증가됨을 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구를 통해 순수산소와 질소원의 공급을 통해 확립된 대장균 고밀도 배양방법을 기초로 IPTG 유도시간을 최적화 함으로써 Bacillus 유래 esterase의 최대 생산성을 확보할 수 있는 배양방법을 확립하였다.

• KSBB Journal
• /
• 제14권6호
• /
• pp.718-723
• /
• 1999

알카리성 염색가공폐수를 처리하기 위햐여 아조염료인 Acid Red 1을 분해하는 호알카리성 균을 자연계에서 분리하였으며, 반응표면분석법인 SAS(statistical analysis system)프로그램을 이용하여 최적배양조건을 조사하였다. 염색공단 폐수처리장에서 배출되는 방류수 및 하천토양을 시료로 하여 알카리성(pH 10.0)배지에 성장하는 균 15종을 순수분리하였다. 그 중 탈색율이 가장 우수한 균주 하나를 선별하여 AR-1로 명명하였다. 탄소원(sucrose, fructose, galactose), 질소원(polypeptone, yeast extract) 및 인산원($K_2HPO_4$)이 분리균의 성장 및 탈색율에 미치는 영향을 조사한 결과, 1.0% fructose, 1.0% polypeptone, 1.0% yeast extract, 0.5% $K_2HPO_4$이 최적의 조건으로 나타났다. 반응표면분석에 의하여 염료의 생분해조건을 최적화하고자 배양온도와 배양시간에 따른 탈색율과 균성장의 특성을 모니터닝하였다. 탈색율은 34.73$^{\circ}C$에서 12.96시간, 균성장은 34.77$^{\circ}C$에서 12.97시간 배양시 각각 최적인 것으로 나타났다. 한편, 균성장과 탈색율을 다같이 만족할 수 있는 최적배양조건은 32.86~36.36$^{\circ}C$, 10.96~15.75시간으로 각각 나타났다.

• KSBB Journal
• /
• 제15권2호
• /
• pp.174-180
• /
• 2000

본 연구에서는 다른 host cell 에 비하여 여러 가지 장점을 가지고 있는 Methylotrophic yeast 중 Pichia pastoris와 Hans-enula polymorpha의 fed batch 실험을 통하여 유전자 재조합 단백질 발현최적조건을 구하여 각 균주의 유전자 재조합 albumin 발현 최적화 연구를 수행하였다. 글리세롤이 두 균주의 promoter의 AOX 1과 MOX promoter repression에 미치는 영향을 확인한 바 H. polymorpha가 P. pastoris보다 promoter repression이 심함을 알 수 있었다. 두 균주의 promoter를 induction시키는 최적 메탄올 농도는 P. pastoris의 경우 메탄올 8g/L, H. polymorpha의 경우는 13 g/L임을 알 수 있었다. 또한 메탄올에 의한 induction시기는 두 균주 모두 O.D. 4 정도되는 exponential growth stage에서 메탄올을 첨가하는 경우가 초기 세포 성장단계에 메탄올을 첨가한 경우에 비해 약 20% 정도 높아짐을 확인하였다. 두 균주의 재조합 albumin 발현에 미치는 pH의 영향을 조사하였는데, p. pastoris의 경우 pH 5에서 가장 높은 albumin 생산성을 보여 약 300mg/L albumin을 발현하였고, H. polymorpha 의 경우 pH 5와 6에서 최대 약 180 mg/L의 albumin을 발현하였지만 pH 8에서는 이의 절반 수준에 그쳤다. 두 균주의 최적 fed-batch 방법을 확인하는 실험을 수행하였는데 P. pastoris의 경우의 최적 fed-batch 방법은 mixed feeding은 바람직하지 않고 글리세롤 배지를 공급하여 세포를 성장시킨 후 글리세롤 공급을 멈추고 바로 메탄올로 전환하는 방법을 효과적이며, H. polymorpha의 경우 비성장속도 제어를 통한 글리세롤 공급으로부터 메탄올 공급으로의 단계적 전환방법이 균주의 albumin 발현에 큰 영향을 준다는 것을 알 수 있었다. 이 방법을 통하여 두 균주의 고농도 배양 실험을 수행한 결과 P. pastoris의 경우는 O.D. 300에서 약 4.7g albumin/L를 발현하였다. 이와같은 결과를 바탕으로 산업체에서 methlotrophic yeast를 이용한 상업화를 계획함에 있어서 host로서의 균주를 선택할 수 있는 기본 자료를 제공함과 아울러 균주가 선택된 후에 그 균주를 이용한 재조합 단백질 최적화 방법을 제공하여 줄 것으로 생각된다.

• KSBB Journal
• /
• 제15권2호
• /
• pp.188-194
• /
• 2000

본 연구에서는 P. productus를 이용하여 체계적인 CO로부터 아세테이트 전환방법 최적화 연구를 수행하였다. 먼저 CO 소비속도에 대한 kinetic model과 그에 따른 여러 가지 상수 값을 계산하여 Vmax와 Km은 각각 39.3 mmol/L-hr-O.D., 0.578 atm임을 알 수 있었으며 또한 고농도 구간에서 CO의 저해상수 KSI는 0.792 atm이었고 Smax는 0.677 atm 이었다. 질소원인 YP의 농도에 따른 아세테이트 생산 정도는 YP 농도가 증가할수록 세포의 성장과 생성된 아세테이트의 양이 증가하여 YP 3%의 경우 O.D. 1.14에서 약 6g/L의 아세테이트를 생성함을 알 수 있었다. 그러나 아세테이트 생성속도는 YP 농도 2%와 3%에서 최대값이 0.11 g/L.hr.O.D로 비슷하였다. P. productus를 이용해 아세테이트 생성을 최적화 하기 위한 초기 pH 실험의 결과 pH 6, 7 그리고 8의 경우는 O.D. 약 0.7에서 3 g/L 아세테이트를 생성하여 거의 비슷한 양상을 보였다. 또한 P. productus의 아세테이트 생성 최적 온도는 $37^{\circ}C$임을 확인하였다. 기상과 액상의 접촉 표면적의 한계에 의한 물질전달문제의 해결을 위하여 5L 발효기에서 고농도 아세테이트 생성실험을 수행하였다. 균주성장의 경우 O.D. 약 1.4 까지 성장하였다. 아세테이트의 경우 접종초기 낮은 생성속도로 생성되다가 60시간 이후 활발한 생성을 보여 약 21g/L를 생산하였다. 이때의 최대 아세테이트 생성속도는 0.48 g acetate/L.hr.O.D 이었고 최대 CO 소비속도는 26.4 mmole CO/L.hr.O.D. 이었다. 이 수치는 bottle 의 경우 0.11 g acetate/L.hr.O.D에 비하여 4배이상 증가한 값이고 생성량에 있어서도 약 4배가 증가하였다. P. productus가 이산화탄소와 수소로부터 아세테이트를 만드는 것으로 확인되는바 이산화탄소와 수소를 이용한 균주성장 정도와 아세테이트 생성량을 확인하는 실험을 수행하였다. 30%와 20% CO2 거기에 H2를 각각 10%, 20% 주입한 경우를 비교하였는데 각 경우 모두 비슷하게 O.D. 0.5 정도에서 약 2g/L의 아세테이트를 생성하였다. 이상의 연구를 통하여 CO를 이용한 CSTR 실험시 pH 조절과 배양중 질소원등 배지의 추가 공급, 그리고 CO 머무름 시간, 교반속도의 물질전달에 영햐을 주는 요인들을 적절히 조절할 경우 생물학적 아세테이트 생성공정은 경제적으로 충분한 가치가 있을 것으로 기대되어진다.

• Current Research on Agriculture and Life Sciences
• /
• 제14권
• /
• pp.101-110
• /
• 1996

Jar fermentor 배양에서 S. chibaensis J-59로 부터 포도당 이성화효소의 최적 생산조건을 확립하기 위하여 반응표면분석을 이용하였다. 실험계획은 중심계획합성법을 이용하였고, 3가지 실험요인으로는 공기주입량(vvm), 교반속도(rpm), 포도당의 농도(%)로 선별하였다. 요인실험의 결과로 회귀계수를 산출한 후 반응표면 회귀식을 구하였다. 효소 생산량의 변화에 대한 회귀식의 결정계수(R2)는 0.9776이였고, 분산분석의 F-ratio가 12.487이었으며, 이때 유의성(Prob>F)은 5% 이내로 인정되었다. 능선분석 결과, 효소생산 최대값은 공기주입량 2.227vvm, 교반속도 587.5rpm, glucose 농도 0.586%로 나타났으며 이때 반응표면 회귀식에 의해 추정하는 예상 효소활성은 7.67 단위로 나타났다. Jar fermentor 배양에서의 최적화 회귀식에 따라 1% birchwood xylan, 1.5% CSL, 0.1% $MgSO_4{\cdot}7H_2O$, 0.012% $CoCl_2{\cdot}6H_2O$, (pH 7.0)로 구성된 배지에 초기 pH를 7.0으로 조정하여 배양 종료까지 7.0을 유지하면서 공기주입량을 2.2vvm, 교반속도를 580rpm, glucose 농도를 0.586%로 하여 $30^{\circ}C$에서 42 시간 배양하였을때, 실제 효소생산량은 7.43 단위로 상기 분석법에서 예상한 효소 생산량의 97%에 달하였고, 플라스크배양의 효소생산량 (2.78 GIU/ml)보다 약 2.7배 가량 효소생산이 증가되었다.

• Journal of Ginseng Research
• /
• 제24권3호
• /
• pp.118-122
• /
• 2000

식물조직배양기술을 이용하석 인삼의 주요약리성분인 사포닌을 생산하고자, 식물생장조절물질로 유도된 인삼 root를 사용하여 사포닌 생산을 위한 최적액체배양조건을 RSM으로 조사하였다. 최적액체배양조건을 배지의 pH, sucrose 농도,nitrogen 농도, phosphate 농도의 3 level-4 factor의 fractional factorial design에 의하여 조사한 결과, 인삼 root의 사포닌 함량은 최저 0.174%에서 최고 0.303울까지 나타났다. 다중회귀분석으로 구한 model식을 가지고 등고분석과 3차원분석을 수행한 후 독립변수의 최저 또는 최고수준에서 종속변수가 최대치를 나타내지 않는 phosphate농도 변수에 대하여 model식을 편미분한 결과 인삼 roe떠 사포닌 함량이 최고치를 나타내는 액체배양조건은 pH 5.5, sucrose 5%, nitrogen 50 mg/L, phosphate 93 mg/L 예측되었다. 이렇게 결정된 조건값들을 model식에 대입하여 얻은 예상치는0.308%였다.

• 한국식품과학회지
• /
• 제47권6호
• /
• pp.687-697
• /
• 2015

단세포유지 생산에 이용되는 미생물은 효모, 곰팡이, 미세조류 등이다. 단세포유지의 생산 효율은 배지의 조성을 조절하여 영양공급을 최적화하거나, 배양 조건을 조절하거나, 최신의 생명공학기술을 활용하여 균주를 개량함으로써 증가시킬 수 있다. 단세포유지를 상업적으로 대량 생산하기 위해서는 값이 싼 탄소원을 확보하는 것이 무엇보다 중요하므로 지구 상에 풍부한 섬유질 자원을 활용하는 방법이 주목을 끌고 있다. 미세조류는 대기 중의 탄산가스를 탄소원으로 이용하므로 탄소원의 비용이 들지 않는 는 장점이 있다. 단세포유지 생산 미생물의 유전자를 조작하거나 대사공학기술을 이용하는 방법은 균주의 생산성을 획기적으로 높이기도 한다. 단세포유지는 그 동안 식품, 사료, 의약품 등으로 사용되어 왔으나 최근에는 바이오디젤(biodiesel)의 원료로도 사용될 수 있어 또 다른 관심을 끌고 있다.

• Ocean and Polar Research
• /
• 제39권4호
• /
• pp.269-277
• /
• 2017

Medium compositions for the hyperthermophilic archaeon, Thermococcus onnurineus NA1 was statistically optimized to enhance formate-driven hydrogen ($H_2$) production by using response surface methodology. From the Plackett-Burman design-based experiment, it was confirmed that among the minor components of medium such as KCl, $MgSO_4$, $NH_4Cl$, Cystein-HCl, trace elements, Fe-EDTA and $CaCl_2$, the trace elements were screened as the only positively effective components with respect to $H_2$ production. Subsequently, the optimal concentrations of the trace elements and the major components of a medium such as NaCl, yeast extract and sodium formate were determined from the five-level central composite design (CCD)-based experiment. The resulting quadratic model predicted the maximum $H_2$ production of 46.6 mmol/L in serum bottle and it was validated experimentally using the optimal medium initially supplemented with 26.70 g/L of NaCl, 9.81 g/L of sodium formate, 3.50 g/L of yeast extract and 4.59 mL/L of trace elements. From the duplicate batch cultivations in the fermentor using the optimized medium, the a maximum $H_2$ production rate up to 71.8 mmol/L/h could be obtained, which was a 65% enhanced value compared with that obtained using the control medium, showing the high efficiency of the optimized medium.

• 한국미생물·생명공학회지
• /
• 제30권4호
• /
• pp.305-311
• /
• 2002

Aspergillus ficuum 유래 acetyl xylan esterase(AXEase) 유전자(AXE)를 Pichia pastoris에서 과발현ㆍ분비 생산하기 위해 AOXI promoter와 mating factor $\alpha$-1 분비신호서열 하류에 AXE를 연결한 염색체 삽입 발현계(pPICZ$\alpha$C-AXE, 4.6 kb)를 구축하였다. 이것을 SacI으로 절단한 뒤 P. pastoris의 염색체 DNA 5'AOX1 부위에 삽입시켰다. 형질전환된 P. pastoris 균주를 메탄을 배지에서 플라스크 회분배양한 결과, 배양 36시간 때의 건조균체농도는 6 g-DCW/1, AXEase 총 발현량은 77 unit/ml이었다. 최적화된 methanol과 histidine 공급방법을 채용한 유가배양시 균체농도는 97 g-DCW/1, AXEase 총발현량은 930 unit/m1로 크게 증가하였다. 효소활성의 90% 이상은 배양 상등액에 존재하였으며, 상등액 단백질의 80%이상이 AXEase 단백질(33.5 kDa)였다. 이러한 결과는 9.8 g/l의 AXEase 단백질을 배양 상등액으로 대량 분비ㆍ생산할 수 있음을 의미한다.