반추위 속에는 박테리아, 고세균, 프로토조아, 곰팡이 및 바이러스와 같은 다양한 미생물들이 편성의 혐기조건에서 공생하고 있다. 사료의 발효에 중요한 역할을 하고 있는 반추위 미생물은 위내 발효과정에서 에너지 손실에 영향을 주는 메탄의 발생을 제외하면 에너지와 단백질 대사에 필수적인 다양한 휘발성 지방산을 생산한다. 반추위내 미생물의 이용효율을 개선시키기 위해 사료배합비조절, 천연사료첨가제, 생균제첨가 등의 다양한 접근방법들이 사용되고 있다. 최근에 반추위 군집에 대한 메타유전체 또는 메타전사체와 같은 차세대 유전체 해독기술 또는 차세대 시퀀싱 기술의 적용으로 반추위 미생물의 다양성 및 기능에 대한 이해가 크게 증가하였다. 특히 메타단백질체와 메타대사체는 반추위 생태계의 복잡한 미생물네트워크에 대한 더 깊은 통찰력을 제공할 뿐만 아니라, 다양한 반추가축용 사료에 대한 반응을 제공함으로서 생산효율을 개선시키는데 기여하였다. 본 논문에서는 반추위내 사료의 발효와 이용을 향상시키기 위한 메타오믹스 기술, 즉, 메타유전체, 메타전사체, 메타단백질체 및 메타대사체의 최신 응용기술을 요약하고자 한다.
식물유래 생리활성물질인 garlic, scallion, fla- vonoid, urushiol 및 anthocyanidin과 기존의 항균 제품인 Bio-MOS?瑛? 병원성 미생물과 반추위 미생물에 대한 효과를 조사하기 위하여 병원성 균인 Escherichia coli O157, Salmonella paratyphi, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus에 항균활성과 in vitro 반추위 미생물 성장률, 가스 생성량, 암모니아 농도, CMCase 활성 및 미생물 수를 측정하였다. 생리활성물질 0.10% 첨가 후, 배양시험에서는 flavonoid, scallion 및 Bio-MOS?怜? 병원성 미생물의 성장을 억제하였으나, paper disc법에 의한 항균활성 시험에서는 flavonoid나 scallion을 5.00%이상 처리 시 clear zone이 뚜렷하였으며, scallion이 가장 강력한 항균활성을 가지고 있는 것으로 나타났다. 생리활성물질의 in vitro 반추위 미생물 발효에 대한 영향은 크지 않았는데, 병원균에 활성을 나타내었던 flavonoid는 1.00% 처리 시 CMCase의 활성이 완전히 없어져 반추위 미생물에 대한 억제효과가 있는 것으로 나타났다. 그러나 scallion은 병원균에는 강한 항균활성을 가지면서 반추위 미생물 발효에는 저해작용을 나타내지 않아 반추 가축의 대체 천연항균제로서 개발 가능성을 나타내었다.
본 연구에서는 기능성 우유의 생산을 위해 높은 항산화 효과를 가지고 심혈관계 질환 환자에게 유익한 CoQ10을 홀스타인 젖소의 우유에 전이시키기 위해 CoQ10 생산성이 높은 R. sphaeroides가 반추위 내에서 생존하며 반추위 환경에 적응하여 CoQ10 생산의 가능성과 반추위 발효에 미치는 영향을 판단하였다. 반추위 환경과 가장 유사한 환경을 만들 수 있는 반추위연속배양장치(RSCC)를 이용하여 CoQ10 생산과 반추 발효를 분석하였다. 전체 15일의 배양기간에서 배양이 안정되는 12일 후부터 5% R. sphaeroides 처리한 군과 R. sphaeroides를 처리하지 않은 대조구로 나누어 실험을 진행한 결과, RSCC system시험에서는 NDF, ADF, pH, NH3-N그리고 미생물 단백질 합성량은 대조구와 유사한 결과를 보였으나, R. sphaeroides가 성장함으로써 반추위에서 분해되지 않는 반추위 비분해성 단백질인 UDP가 대조구에 유의적으로 높게 나타났다. 특히, CoQ10은 대조구에서는 검출되지 않았으나, 처리구에서는 CoQ10 함량이 336.0 mg/l로 높게 나타났다. 이 연구를 통해서 R. sphaeroides는 반추위 내에서 항산화 물질인 CoQ10을 높은 농도로 생산할 수 있음을 확인하였다. 추후 젖소 착유 실험을 통한 CoQ10 우유 전이 실험을 진행하여 기능성 우유 생산을 위한 첨가제 개발에 활용할 예정이다.
옥수수 알곡(whole corn)을 분쇄(ground corn; GC), 파쇄(cracked corn; CC), 박편(flaked corn; FC) 및 수침(soaked corn; SC)등 가공방법을 달리하여 처리하였을 때 반추가축에 대한 in situ 및 in vitro 소화율에 미치는 영향을 구명하고자 본 연구를 수행하였다. 실험 1 : 옥수수 알곡의 가공방법이 건물, 유기물 및 조단백질의 반추위내 in situ 소실율에 미치는 영향 1. 반추위내의 건물, 유기물 및 조단백질의 반추위내 소실율을 관찰하고자 반추위 누관이 장착된 한우 4두를 공시하여 nylon bag 기법으로 0, 2, 6, 12, 24 및 48시간 반추위내에서 각 가공된 옥수수를 배양시켰다. 2. 반추위 배양시간 48시간대에서 분쇄옥수수가 76.1 %로 가장 높은 건물소실율을 보였으며(P<0.01) 다음으로 파쇄 옥수수 (55.1%) 그리고 박편 처리 옥수수 (30.9%)의 순으로 소실율이 높았으며 알곡 옥수수와 수침 옥수수의 경우는 약 12%로 48시간 이후에도 거의 소실이 되지 않음이 관찰되었다. 3. 조단백질의 소실율은 반추위 발효시간 48시간대에서 분쇄 및 파쇄 옥수수의 단백질 소실율이 각각 48 및 38%로 가장 높았지만(P<0.01), 박편 옥수수는 건물 소실율과는 달리 단백질 소실율이 18.9%로써 알곡과 수침 옥수수와 비슷하게 나타났다. 0시간대의 단백질 소실율은 분쇄 옥수수가 소실율이 16.14%로 가장 높았다(P<0.01). 4. 유기물의 소실율은 반추위 발효시간 48시간대에서 분쇄 옥수수가 76.04%로 가장 높았으며(P<0.01) 그 다음이 옥수수를 파쇄한 경우 54.64%였으며 옥수수 알곡과 수침 옥수수가 각각 11.82 및 12.26%로 가장 소실율이 낮았다(P<0.01). 0시간대 소실율은 분쇄와 파쇄 옥수수에서 소실율이 각각 20.27과 18.86%로 가장 높았다(P<0.01). 실험 2 : 옥수수 알곡의 가공방법이 반추위내 미생물에 의한 건물 분해을 및 two-stage in vitro 건물 소화율에 미치는 영향 1. 옥수수 알곡의 가공방법에 의한 반추위내 미생물들의 건물 분해율을 측정하기 위하여 한우로부터 반추위액을 채취하고 미생물을 분리하여 각 사료기질을 0, 2, 6, 12, 24 및 48시간 미생물과 함께 배양시켰다. 48시간 동안 반추위 미생물에 배양시 분쇄 옥수수의 분해율 (65.01%)이 가장 높았다(P<0.01). 옥수수 알곡과 수침 옥수수를 48시간 배양시 건물분해율은 각각 18.83 과 17.26%로 처리구중 가장 낮은 분해율을 보였다 (P<0.01). 2. 한우로부터 분리한 반추위액에 각 사료기질을 two-stage 배양법으로 배양하여 건물 소화율을 측정하였다. 무처리 옥수수가 가장 낮은 소화율 (15.36%)을 보였고(P<0.01), 분쇄, 파쇄 및 박편 옥수수에서 높은 소화율을 보였으며(P<0.01) 각각 86.95, 85.84 및 82.29%로 나타났다.
본 연구는 반추가축에 급여되는 사료원 중 종류별, 수준별 lignosulfonate 처리 대두박의 반추위 내 undegradable protein (UDP) 효율을 알아보기 위하여 실험 I 에서 전체 4종의 lignosulfonate (Desulfonated, Na, Ca, Solution)를 각각 수준별 (2, 4, 8%)로 처리하여 전체 12종의 lignosulfoanted soybeanmeal (LSBM)에 대한 반추위 내 미생물 발효 특성의 미치는 영향을 알아보기 위해 in vitro 시험이 실시되었다. 실험 H에서는 실험 I 에서 대두박의 단백질 보호 효과가 가장 높은 LSBM Na 2% 처리구와 LSBM Solution (LSBM Sol) 2% 처리구 그리고 열처리 LSBM (LSBM Heat) 2%를 이용하여 rumen simulation continuous culture (RSCC) system을 이용한 반추위 내 미생물 발효 특성에 대한 연구가 실시되었다. 시험 I in vitro 시험에서 모든 LSBM 처리구에서 전체 배양시간 평균 pH수준, gas 생성량, $NH_3$-N 농도, 건물소화율, VFA 생성량 그리고 ADF 소화율은 배양시간이 지남에 따라 대조구에 비해 낮은 결과를 나타내었다(p<0.05). 반추위 내 미생물단백질 합성량은 대조구가 LSMB 처리구 보다 통계적으로 높은 결과를 나타내었으며 (p<0.05), LSBM 수준이 증가할수록 반추위 내 미생물 단백질 합성량은 감소하는 경향을 나타내었다. UDP 함량은 대조구보다 LSBM 처리구에서 높은 결과를 나타내었으며(p<0.05), 특히 LSBM Sol 처리구는 대조구에 비해 각각 2%, 4% 그리고 8% 처리군에서 11.18%, 11.54% 그리고 29.11%의 UDP 함량이 증가 하였다. 시험 II는 RSCC system을 이용하여 반추위 내 미생물 발효특성에 대한 시험이 실시되었다. 시험사료는 대조구와 In vitro 시험 중 대조구와 UDP 효과가 높은 LSBM Na 2%, LSBM Sol 2% 그리고 LSBM Heat 2% 처리한 사료 4처리 4반복($4{\times}4$ Latin squire)에 의해 15일간 시험이 실시되었으며, 배양 마지막 3일 동안의 sample을 이용하여 분석을 실시하였다. 전체 배양 기간 중 모든 처리구에서 적응기간 동안 불규칙적인 반추위 미생물 발효 특성을 보였으나 배양 12일 이후 안정된 발효특성을 나타내었다. Sampling 기간 동안의 각 처리간의 평균 pH는 모든 LSBM 처리구에서 대조구보다 높았다(p<0.05). $NH_3$-N 함량, VFA 함량 그리고 반추위 내 미생물 단백질 합성량은 LSBM 처리구가 대조구에 비해 낮은 결과를 나타내었다(p<0.05). UDP 함량은 대조구, LSBM Heat 2%, LSBM Na 2% 그리고 LSBM Sol 2%에서 각 41.55, 43.49, 45.28 그리고 43.52%로 모든 LSBM 처리구가 대조구에 비해 유의하게 높은 경향을 나타내였다(p<0.05). 시험 I과 시험II에서 UDP 함량은 LSBM 처리구에서 lignosulfonate 처리 수준이 증가할수록 증가하는 경향을 나타내었고, 모든 LSBM 처리구는 대조구에 비해 높은 UDP 함량을 나타내었다. 이와 같은 결과는 사료원으로써 대두박에 대한 lignosulfonate 처리가 coating 작용과 열처리에 의한 물리 화학적 효과로 인하여 대두박의 단백질 분해율을 저해 시킨 것으로 사료된다. 그러나 LSBM 처리군 중 건물소화율과 반추위 내 미생물단백질 합성량은 LSBM 2% 처리구에서 가장 높은 결과를 나타내였다. 따라서, 반추가축 사료내 LSBM 첨가가 In vitro와 RSCC system을 이용한 반추위내 미생물발효 특성 시험에서 반추위 내에서 by-pass protein 함량을 증가시키는 결과를 나타내었으며, 추후 착유우를 이용한 LSBM 급여를 시험을 통하여 유단백질 증진효과에 대하여 추가적인 평가가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
높은 C4 대사활성을 보이는 반추위미생물이 가지는 포도당 발효대사 조절양식의 한가지를 대장균에서 모사하였다. 대장균은 glycolytic condition에서는 phosphoenolpyruvate(PEP) ${\leftrightarrow}$ oxaloacetate(OAA)간 반응을 phosphenolpyruvate carboxylase(PPC)에 의해, gluconeogenetic condition에서는 phosphoenolpyruvate carboxykinase(PCK)에 의해 촉매하도록 조절한다. 반면 반추위미생물은 glycolytic condition에서 PCK를 통하여 반응이 촉매된다. 이러한 조절양식의 차이점이 C4 대사활성에 미치는 영향을 조사하기 위하며 ppc가 돌연변이되고 대신 인위적으로 PCK를 발현할 수 있는 대장균을 제조하였다. 이렇게 PEP-OAA간 대사조절이 변이된 대장균 K12 ppc-/pck+는 야생형 K12보다 2.5배의 높은 C4대사활성을 보였다. 대장균에서의 C4 대사생리를 증가시키는 연구는 대사공학을 이용한 여러가지 유용물질(i.e. 숙신산, ALA)생산에 응용하기 위한 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
홀스타인 건유우의 반추위에서 분리한 혼합 곰팡이에 첨가한 linoleic acid가 biohydrogenation 과정 중 생산되는 지방산의 농도와 종류를 측정하고, 최종 산물로 생산되는 지방산이 trans-11 vaccenic acid인지 stearic acid인지 조사하기 위하여 본 연구를 수행하였으며 결과는 다음과 같다. 반추위 혼합 박테리아 배양구에 linoleic acid 용액을 첨가한 결과, 배양 90분 이내에 100%의 linoleic acid가 stearic acid로 biohydrogenation되었다. 반면에 linoleic acid 용액을 반추위 혼합 곰팡이에 첨가한 결과 24시간 이내에 모든linoleic acid는 conjugated linoleic acid (cis-9, trans-11)와 trans-11 vaccenic acid로 biohydrogenation되었다. Linoleic acid가 함유된 혼합곰팡이 처리구는 배양시간이 증가할수록 stearic acid의 농도도 소량 증가하는 경향을 보였다. 또한 linoleic acid가 함유되지 않은 혼합곰팡이 대조구에서도 배양시간이 증가할수록 stearic acid 농도가 처리구와 비슷하게 증가하는 경향을 나타내었다. 그러나 혼합 박테리아의 linoleic acid 첨가구에서는 배양시간이 증가할수록 stearic acid의 농도가 급격하게 증가하는 것을 조사되어 반추위 혼합곰팡이의 stearic acid생산은 linoleic acid의 biohydrogenation과 무관하게 생산되는 것으로 조사되었다. 따라서 반추위 혼합 곰팡이에 의한 linoleic acid biohydrogenation의 최종 산물은 trans-11 vaccenic acid로 판단되며, 혼합 박테리아는 stearic acid로 나타났다.
옥수수 알곡(whole corn)을 분쇄(ground corn; GC), 파쇄(cracked corn; CC), 박편(flaked corn; FC) 및 수침(soaked corn; SC)등 가공방법을 달리하여 처리하였을 때 반추가축에 있어서 미생물의 부착양상에 미치는 영향을 구명하고자 한 본 연구의 요약은 다음과 같다. 1. 한우의 반추위내에 각 처리별 옥수수를 12 및 24시간 배양하여 주사 전자현미경을 이용하여 반추 미생물의 부착양상과 사료 기질의 형태를 조사하였다. 2. 분쇄 및 파쇄 옥수수에서 가장 많은 미생물들이 부착되어 있는 것이 관찰되었고 옥수수 알곡 및 수침 옥수수는 전분입자에 미생물의 부착을 관찰 할 수 없었으며, 단지 배양시간이 경과함에 따라 옥수수의 외피에 많은 미생물이 부착되었고 외피의 분해가 일어나는 것이 관찰되었다. 3. SEM 결과를 통하여, 옥수수의 입자가 작게 가공처리 될수록 미생물 군락의 형성이 용이하여, 반추위내 옥수수의 분해율을 향상시킨다고 판단된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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