• 한국수정란이식학회지
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• 제15권3호
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• pp.231-236
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• 2000

This study was conducted to examine the effects of exogenous gonadotropins (PMSG+hCG) and an antioxidant (cysteine) on in vitro maturation of bovine follicular oocytes. Cumulus-oocyte complexes (COCs) aspirated from 2 to 5 mm ovarian follicles were cultured for 22 to 24 hours in a modified bovine embryo culture medium (mBECM) supplemented with 3 mg/mL bovine serum albumin, to which PMSG (10 IU/mL) + hCG (10 IU/mL) and/or cysteine (0.6 mM) were added. When examined the expansion of cumulus ce1ls at the end of maturation culture, greater (p<0.05) expansion was found after addition of PMSG+hCG (79 to 96%) to mBECM than after no addition (0%), regardless of the presence or absence of cysteine in the medium. The addition of cysteine did not stimulate cumulus expansion, but a high proportion (92%) of expansion was achieved when COCs were cultured after the addition of PMSG+hCG and cysteine to the medium. No difference in the proportion of oocytes underwent germinal vesicle breakdown (initiation of maturation) was found after the addition of PMSG+hCG and/or cysteine to mBECM. However, nuclear maturation (development to the metaphase-II stage) of oocytes was significantly stimulated by the combined addition of PMSG+hCG and cysteine, compared with no addition. In conclusion, both exogenous gonadotropins and an antioxidant are important for nuclear maturation of bovine immature oocytes and these factors have a cell-specific stimulatory action.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제32권4호
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• pp.331-336
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• 2005

Objective: To investigate the effects of female age on in vitro maturation and fertilization of immature oocytes from controlled ovarian hyperstimulation (COH) in human IVF-ET program. Method: A total of 96 immature oocytes (GV & metaphase I) obtained from 40 cycles of IVF-ET (29 patients). The mean age of female patients was $31.8{\pm}3.1years$. Ovulation was triggered by urinary or recombinant hCG. Immature oocytes were cultured with YS medium containing 30% of patients' human follicular fluids, LH (1 IU/mL), FSH (1 IU/mL) and EGF (10 ng/mL), and then matured oocytes were fertilized by ICSI. In vitro maturation and fertilization of immature oocytes were analyzed according to age of female (< 34 or ${\geq}34years$). Results: The maturation rate was similar between two groups (68% vs 64%). The fertilization rate of in?vitro-matured oocytes was higher in patients < 34 years old, but there was no statistical significance (64% vs 50%, p=0.347). The fertilization rate of in-vitro-matured oocytes was significantly lower compared with those of in-vivo-matured oocytes in both age groups (64% vs 79%, p=0.035, 50% vs 86%, p=0.007). Conclusion: In older female group, fertilization rate of in-vitro-matured oocytes seems to be decreased. Further investigations should be warranted to increase fertilization potential of in-vitro-matured oocytes.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제21권2호
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• pp.183-190
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• 1994

Purpose of the present study was to find the optimal culture conditions for the maturation and fertilization of immature oocytes by the use human body fluids and gonadotropins (Gn) in the mouse model. Cumulus-enclosed mouse immature oocytes were incubated in the medium containing various human body fluids with or without Gn in vitro, and examined to confirm nuclear maturation (NM) and fertilization. Female ICR mice were stimulated with 7.5 IU pregnant mares' serum gonadotropin (PMSG). Cumulus-enclosed immature oocytes were isolated at 48-52 hr post PMSG injection and cultured in TCM 199 supplemented with various concentrations (20, 50, and 70%) of human body fluids such as fetal cord serum (hCS), follicular fluid (hFF), peritoneal fluid (hPF) and amniotic fluid (hAF) in the presence or absence of 10 IU/ml PMSG and 10 IU/ml human chorionic gonadotropin (hCG) for 18 hr. Fetal calf serum (FCS) was used as a control for the supplements. Matured oocytes were fertilized with sperm collected from the epididymis of male mice. Fertilization was conducted in T6 medium containing 15 mgl ml bovine serum albumin, and confirmed at 6 hr post-insemination. Evaluation of nucler maturation and fertilization was carried out by rapid staining using fuchin. There was no significant difference between the effects of human body fluids and FCS supplements on nuclear maturation of cumulus enclosed mouse immature oocytes. When maturation medium was supplemented with 20% hPF or 20% hAF, fertilization rates were significantly (P<0.01) lower than that of 20% FCS, hCS and hFF groups. However, higher concentrations of body fluids during IVM were not more beneficial on fertilizability of oocytes. The addition of Gn significantly increased the fertilization rates in hPF and hAF groups (hPF without Gn; 51.5%, compared with 85.1% for addition of Gn, and hAF without Gn; 30.1% compared with 85.8% for addition of Gn) at 20% concentration. These results suggest that human body fluids at 20% concentration and gonadotropins can be used as supplements for the maturation of mouse immature oocytes in vitro. When gonadotropins supplemented with the human body fluids in the maturation medium, fertilizability of mouse immature oocytes was increased in hPF and hAF groups. These results can be applied to maturation of human immature oocytes in vitro.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제35권2호
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• pp.111-118
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• 2008

연구방법: 미성숙 백서 난소의 과배란 유도를 위해 PMSG를 주사하고, 배란을 위해서 hCG를 주입하였다. RGS-2의 유전자 발현양상을 조사하기 위하여는 Northern blot 분석과 in situ hybridization 분석을 시행하였다. 결 과: 미성숙 백서에 성선자극호르몬인 PMSG를 복강내 주사했을 때 RGS-2 mRNA 발현에 영향을 미치지 않음을 Northern blot analysis로 확인할 수 있었으나, hCG를 주입했을 때는 1시간에서 3시간 내에 발현이 증가됨을 알 수 있었다. In situ hybridization으로 살펴본 RGS-2 mRNA의 발현세포는 난포의 크기에 관계없이 난자였으나, hCG로 처리한 후에는 배란 전 난포와 성장중인 난포의 과립막 세포이었다. 그러나, RGS-2 단백의 발현은 hCG 처치와 관계없이 난포막 세포이었다. 상기 생체 실험과 마찬가지로 시험관에서도 배란 전 난포의 과립막 세포에 대한 LH 처리는 RGS-2 유전자 발현을 1시간 내에 촉진하였다. 또한, 성선자극호르몬 분비호르몬 2 길항제도 이러한 LH의 촉진작용을 증진시켰다. 결 론: 본 연구로 배란 전 과립막 세포에서 성선자극호르몬인 LH/hCG와 성선자극호르몬 분비호르몬 길항제에 의해 RGS-2의 발현이 증진되는 양상으로 보아 RGS-2가 배란과정 동안에 Gq protein 신호전달을 조절할 것으로 추정된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제24권3호
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• pp.213-220
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• 2009

The objective of this study was to examine the effect of eCG and various concentrations (20, 40, and 80 ${\mu}g/ml$) of porcine FSH on nuclear maturation and intracellular glutathione (GSH) level of oocytes, and embryonic development after parthenogenetic activation (PA) and somatic cell nuclear transfer (SCNT) in pigs. Immature pig oocytes were matured in TCM-199 supplemented with porcine follicular fluid, cysteine, pyruvate, EGF, insulin, and hormones (10 IU/ml hCG and 10 IU/ml eCG or $20{\sim}80{\mu}g/ml$ FSH) for the first 22 h and then further cultured in hormone-tree medium for an additional 22 h. Nuclear maturation of oocytes ($85{\sim}89%$) was not influencem foreCG and various concentrations FSH. Embryonic development to the cleavage stage ($86{\sim}94%$) and mean number of cells in blastocyst ($33{\sim}37$ cells) after PA were not altered but blastocyst formation e-treignificaddlor(p<0.05) improvem forthe supplementation eith 80 ${\mu}g/ml$ FSHr(64%) compared to 47%, io8%, iand 47% in oocytes that were treated with eCG, 20,i and 40 ${\mu}g/ml$ FSH,i numectivelo. In SCNT, fusion ($78{\sim}83%$) of cell-cytoplast couplets and siosequent embryo cleavage ($82{\sim}88%$) were not influencem fordifferent gonadotropins but blastocyst formation tended to increase forthe supplementation eith 80 ${\mu}g/ml$ FSHr(25% vs. $11{\sim}18%$). Our nuults demonstrated that oocyte maturation and embryonic development after PA and SCNT e-frinfluencem fortype of gcem fortype of gits concentration. In this study, supplementation of maturation medium eith 80 ${\mu}g/ml$ FSHrimproved preimplantation development of PA and SCNT pig embryos, probably by increasing intracellular GSH concentration of matured oocytes.

• 한국가축번식학회지
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• 제22권4호
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• pp.319-329
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• 1998

본 연구는 돼지 난포란의 동결시기를 결정하고자 미성숙, 성숙중, 생숙후의 3 가지 성숙단계의 난포란을 동해방지제에 노출하거나 동결, 융해하여 체외성숙율과 체외발생율을 대조구와 비교 조사하였다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 각각 0, 24, 44 시간 동안 성숙배양한 난포란을 동해방지제에 노출한 후 추가배양했을 때 난포란의 성숙율은 각각 45.2, 45.0, 50.3%으로 무처리구 55.0% 와 비슷하였다. 2. 각각 0, 24, 44 시간 동안 성숙배양 한 난포란을 동해방지제에 노출한 후 체외수정하고 배양했을 때 난자의 발달율은 각각 18.6, 19.7, 47.6% 로 0 시간과 24 시간에서는 무처리구 50.9% 보다 유의하게 낮은 배발달율을 나타내었으나 44 시간에서는 차이가 나타나지 않았다. 3. 각각 0, 24, 44 시간 동안 성숙배양한 난포란을 일단계 초자화동결법 (one-step vitrification)으로 추가배양했을 때 난포란의 동결, 융해 후 성숙율은 각각 4.3, 7.1, 46.7%로 무처리구 62.4% 보다 유의하게 낮은 성숙율을 나타내었다. 4. 각각 0, 24, 44 시간 동안 성숙배양한 난포란을 일단계 초자화동결법 (one-step vitrification)으로 동결, 융해 후 체외수정하고 배양했을 때 난자의 발달율은 각각 2.5, 2.4, 10.2%로 무처리구 49.6% 보다 유의하게 낮은 성숙율을 나타내었다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2003년도 학술발표대회 발표논문초록집
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• pp.72-72
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• 2003

대부분의 동물에서 체내 또는 체외수정란의 체외 배양 시 일정한 발육 단계까지 발달한 후 발육지연이나 정지가 되는 체외 발육억제 현상이 나타나게 된다. 특히 돼지에서는 타 가축들과는 달리 4 세포기에서 체외 발육억제 현상이 일어나기 때문에 체외에서의 발육율이 매우 낮아 수정란 생산이 제한되고 있다. 따라서 본 연구는 이러한 돼지 체외발육 억제 현상을 극복하고 돼지 체외 수정란의 체외배양 체계의 기초 자료를 얻고자 돼지 미성숙 난자를 체외에서 성숙, 수정시킨 뒤, 체외 수정란의 배양 시 성장인자와 6탄당의 첨가에 따른 체외 발육율을 검토하였다. 난자의 핵 성숙과 세포질 성숙 및 세포 기능에 영향을 미치는 것으로 알려져 있는 성장인자로는 Insulin-like growth factor-I(IGF-I)과 Epidermal growth factor(EGF)를 사용하였고, 여러 종의 번식기관에 존재하여 배반포 형성을 촉진시키는 것으로 알려진 glucose, mannose, galactose 및 fructose가 6탄당으로 사용되었다. 체외수정란의 발육을 위한 기본 배양액인 NCSU-23에 각각 0, 1, 5, 10 및 20ng/ml의 IGF-I과 EGF를 각각 첨가하여 농도의 차이에 따른 발육율을 검토하였다. 또한 5.56mM의 glucose, mannose, galactose 및 fructose에 5ng/ml의 IGF-I 또는 10ng/ml의 EGF 첨가 유, 무에 따른 초기배 발육율을 검토하였다. 마지막으로, 각각의 6탄당에 위와 같은 농도의 IGF-I와 EGF 공동 첨가 유, 무에 따른 초기배 발육율을 검토하였다. 그 결과 돼지 체외 수정란의 체외 발육 시 배양액 내에 서로 다른 농도의 IGF-I과 EGF를 첨가하였을 때 IGF-I은 5ng/ml(12%)에서, EGF는 10ng/ml(10%)의 실험구에서 가장 높은 배반포기 배의 발육율을 나타냈다. 또한 각각의 6탄당과 IGF-I 또는 EGF 유, 무에 따른 초기배 발육율을 검토한 결과 IGF-I과 EGF 모두 glucose 첨가 시 타 첨가구에 비해 초기 발육 단계의 수정란 발육뿐만 아니라 배반포까지의 배발육(10～11%)이 타 첨가구(3～8%)에 비해 높게 나타났다. 한편, 각각의 6탄당이 첨가된 배양액 내에 IGF-I파 EGF 공동첨가 유, 무에 따른 초기배 발육율을 검토한 결과 모든 실험구에서 EGF와 IGF-I 첨가 시 무첨가보다 높은 초기 배 발육율을 나타냈으며 특히 초기 분열단계 수정란에서는 발육의 차이가 크게 나타났다. 본 연구 결과 성장인자와 6탄당의 첨가는 돼지 수정란의 체외배양 시 초기배 배발육에 효과적인 영향을 미치는 것으로 사료되며, 이는 체외 발육율이 타 가축에 비해 낮은 돼지의 수정란 생산에 있어 체외배양체계의 개선을 위한 기초자료가 될 수 있을 것이라 기대된다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2003년도 학술발표대회 발표논문초록집
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• pp.70-70
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• 2003

조류의 배자는 포유류의 배자처럼 모체로부터 영양분을 공급받는 것이 아니라 알속에 저장되어 있는 영양물질로 발육한다. 배자의 발육은 대부분 체외에서 진행된다. 난자는 배란된 후 수정되어 난관팽대부에서 1세포기 수정란이 된다. 그 후 난관협부로 이동하여 최초로 분열이 일어나 배자의 발육이 진행되고, 산란시에는 세포수가 약6만여 개에 달한다. 따라서 수정란에 유전조작기법을 사용하기 위해서는 모체의 난관속에서 일어나는 배발생과 난각속에서 일어나는 개체발생을 위한 체외배양법과 대리난각 배양법이 확립되어 있어야 한다. 그와 같은 기술은 닭 수정란의 배 발생 관찰 및 분석과 유용한 물질을 생산하기 위한 형질전환 가금 연구에 중요한 기술로 사용되고 있다. 따라서 본 연구는 1세포기 닭 수정란의 체외배양과 대리난각 배양에 있어서 수정란의 조건과 대리난각의 조건이 배자의 생존율과 부화율에 미치는 영향을 조사하여 체외배양과 대리난각 배양에 의한 병아리 생산 효율을 제고하기 위한 기초자료를 얻고자 실시하였다. 주요 조사 항목은 수정란의 채란위치, 배자의 발생단계, 수정란의 무게, 대리난각용 계란의 보존 기간, 대리난각의 두께, 대리난각 두께의 감소율, 대리난각의 크기 등을 조사하여 배자의 생존율과 부화율에 미치는 영향에 대하여 조사하였다. 본 실험의 결과는 초기 발생이 빠른 배자가 생존율과 부화율이 높았으며, 본 실험에 사용한 대리난각용 계란의 보관기간이 짧을수록 배자의 생존율과 부화율이 높은 것으로 조사되었다(p<0.05). 그러나 대리난각용 계란의 크기와 대리난각의 두께 차이는 배자의 생존율과 부화율에 큰 영향이 없는 것으로 조사되었다.하였을 때 분할율은 68.0%였으며, 이중 12.0%가 상실배 또는 배반포로 발달하였다. 뿐만 아니라 10% FBS가 첨가된 TCM-199 배양액에 난관상피세포와 공배양을 실시하였을 경우는 72.0%가 분할하였으며, 이중 16.7%가 상실배 또는 배반포로 발달하였다. 이상의 결과로 볼 때 활성화 처리는 ionomycin과 6-DMAP 용액처리가 적합하며, 단위발생란의 체외배양은 보다 적합한 배양조건의 확립이 필요한 것으로 생각된다.icalcium lactate 공동배양은 체외배양에 별다른 영향을 미치지 못하는 것으로 나타났다.생산하는 것을 확인할 수 있었다.4시간에 등급별 회수율이 각각 GI(27.4%), GII(14.7%), GIII(43.2%), GIV(14.7%)로 나타났으며, 46~50시간에는 GI(12.0%), GII(12.0%), GIII(28.0%), GIV(48.0%)로 나타났다. 이상의 결과로 볼 때 미성숙 난자의 회수는 hCG 투여 후 29~34시간이 적합한 것으로 생각된다. 가금의 생산에 있어서 매우 효율적이고 주목할 만한 방법으로 사료된다. 것으로 나타났다.적외선.열풍 복합건조방법이 높게 나타나 이것은 곡물 표면에 원적외선 방사에의한 복사열이 전달되어 열장해를 받았기 때문으로 판단되며, 금후 더 연구하여 적정 열풍온도 및 방사체 크기를 구명해야 할 것이다.으로 보여진다 따라서 옻나무 유래 F는 포유동물의 생식기능에 중요하게 작용하는 것으로 사료된다.된다.정량 분석한 결과이다. 시편의 조성은 33.6 at% U, 66.4 at% O의 결과를 얻었다. 산화물 핵연료의 표면 관찰 및 정량 분석 시험시 시편 표면을 전도

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제30권1호
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• pp.65-70
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• 2006

본 연구는 활성화처리 방법 및 배양 조건이 돼지 단위발생란의 체외발달 및 apoptosis에 미치는 영향을 알아보기 위해 실시되었다. 도축장 유래 난소로부터 채취된 미성숙 난자를 $42{\sim}44$시간 동안 성숙배양한 후 사용하였다. Apoptosis는 TUNEL 방법을 사용하여 조사하였다. 실험 1에서는 성숙배양된 난자들을 electric pulse(1.2 kV/cm for $30{\mu}sec$ 2회, E), E + 6-dimethylaminopurine(6-DMAP) 또는 E + cycloheximide(CH) 방법으로 활성화 처리하여 PZM-3를 이용하여 5% $CO_2,\;38.5^{\circ}C$에서 배양하였다. 실험 2에서는 전기자극을 이용하여 활성화처리된 난자들을 각각 PZM-3 또는 NCSU-23 배양액 내에서 배양하였다. 각 배양액 내의 난자들은 각각 20% $O_2$ 조건으로 나뉘어 배양하였다. E + 6-DMAP(36.5%) 또는 E + CH 구(32.5%)에서 E 구(27.7%)보다 유의적으로 높은 배반포 형성율을 보였다(P<0.05). 처리별 apoptosis 발생율은 각각 5.3%(E), 7.7%(6-DMAP) 및 7.1%(CH)였다. 실험 2에서는 PZM-3 구의 배반포 형성율이 NCSU-23 구에 비하여 산소분압조건과 관계없이 다소 높았다$(28.2{\sim}29.7%\;vs.\;22.6{\sim}24.4%)$. PZM-3 및 20% $O_2$ 조건하에서 유의적으로 낮은 apoptosis 발생 비율을 나타냈다(9.2%, P<0.05). 그러므로 돼지 단위발생란을 chemical agent를 이용한 추가 활성화처리 후 PZM-3, 20% $O_2$, 조건으로 배양하면 더 나은 배반포 발생율을 얻을 수 있다고 생각된다.

• 대한수의학회지
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• 제32권1호
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• pp.15-24
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• 1992

클로미펜 시트레이트가 배란반응, 난자의 형태, 난소 스테로이드 생성 및 수정란 발육에 미치는 영향을 PMSG 처리한 랫드에서 조사하였다. 먼저 세가지 용량(0.05mg, 0.1mg 및 1.0mg)의 클로미펜 시트레이트 또는 부형제를 미성숙의 Sprague Dawley 암컷에 일령 25일부터 27일까지 3일간 투여하였다. 그후 28일령에 이들 모든 암쥐에게 4IU PMSG를, 30일령에는 1.0mg 클로미펜 시트레이트가 처치된 일부의 암쥐에게 10IU hCG를 추가로 투여하였고, 31일령에 모두 도살하였다. 한편 4IU PMSG와 더불어 0.1mg클로미펜 시트레이트 또는 부형제를 투여한 일부의 암쥐는 숫쥐와 교미시킨 다음 임신 2일부터 5일까지 매일 도살하였다. 클로미펜 시트레이트의 용량을 증가시킴에 따라 배란반응(배란율 및 평균 배란난자의 수)과 난소중량이 대조군에 비하여 현저히 감소하였고 반면 배란난자의 변성율(%)은 그 용량에 비례하여 증가하였다. 클로미펜 시트레이트에 의한 배란반응 및 난소중량의 억제적 반응은 10IU hCG 추가투여에 의하여 완전히 대조군 수준으로 회복되었다. 그리고 클로미펜 시트레이트의 투여용량의 증가는 프로제스테론과 안드로젠의 혈장치 감소와 더불어 에스트라디올의 혈장치를 현저하게 증가시켰다. hCG의 추가투여는 이러한 클로미펜 시트레이트 작용에 의해 증가된 에스트라디올치를 현저하게 감소시키고 감소된 프로제스테론치를 증가시키는데 효과적이었다. 0.1mg의 클로미펜 시트레이트를 투여한 임신 랫드로부터 회수한 수정란은 전기간에 걸쳐 그 변성율(%)의 현저한 증가와 아울러 특히 임신 3일부터 그 수가 유의성있게 감소하였다. 클로미펜 시트레이트 투여에 의한 수정란의 난분할 속도도 임신 3일부터 대조군에 비하여 현저하게 지연되었으며 아울러 회수된 수정란의 난분할율(%)도 전기간에 걸처 대조군보다 지속적으로 저하되었다. 위의 결과는 흰쥐에 있어서의 클로미펜 시트레이트 투여에 의한 배란억제반응과 아울러 그 작용기전에 성선자극호르몬의 분비억제 또는 차단작용이 포함됨을 증명하였고 이 약제의 투여에 의한 난자의 형태적 정상성과 수정란발육에 대한 유해효과는 수정이전 시기에 있어서의 난소스테로이드 생성 특히 에스트라디올의 증가에 기인함을 제시한다.