대두(Glycine max L.) 종자로부터 분리된 렉틴을 토끼에 면역화시켜 렉틴항혈청을 얻었다. 이를 이용한 면역화학적 방법을 사용하여 대두렉팅의 면역화학적 특성과 6개 대두 품종의 종자에서 렉틴의 존재를 조사하였다. Crossed immunoeiectrophoresis한 결과 종자는 4종의 침강선을 보임으로서 렉틴에 4종의 항원성분이 존재함을 보여 주었다. 1% agarose gel을 이용하여 Immunodouble diffusion test한 결과 6개 대두 공시품종 모두 렉틴항체에 대하여 침강선을 나타내었고 푸종간 침강선은 모두 유사한 양상을 보였다. ELISA 방법에 의하여 6개 대두 품종간의 렉틴함량을 조사, 비교한 결과 렉틴함량은 장엽콩>광교>황금콩>백운콩>장백콩=팔달콩 순으로 나타났다. 공시품종의 조자로부터 분리한 렉틴은 모두 토끼 적혈구는 응집시켰으나 Fusarium sp., Alternaria sp., Cuvalaria sp. 등의 곰팡이 포자는 응집시키지 못하였다.
강남콩 렉틴과 근류균(R. phaseoli)의 결합에 관한 광범위한 실험을 수행하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 강남콩종자의 자엽에서 가장 많은 렉틴은 성장에 따라 뿌리로 이동하였는데 발아후 약 5일경에, 뿌리의 길이가 $6\~8cm$인 것이 가장 렉틴의 함량이 많았다. 2. 근류균의 배양시기에 따가 강남콩렉틴과의 응집력을 측정 한 결과 배양초기 가 후기보다 응집력이 높았다. 3. 강낭콩종자에 존재하는 렉틴을 추출 정제하여서 6종 근류균과의 응집력을 측정한 결과 R. phaseoli와의 응집이 가장 강했고 이는 렉틴에 대한 특이적 결합, 즉 숙주특이성을 입증하는 것이었다. 4. 단당류에 의한 응집반응의 경쟁적 저해를 시도함으로써 강남콩렉틴의 근류균에 대한 결합부위가 mannose와 galactose를 포함한 oligosaccharides가는 것을 알수 있었으며 이들의 저해효과에 필요한 당의 최소농도는 6.25mM로서 측정되었다. 5. R. phaseoli와 강낭콩 렉틴을 강낭콩 뿌리에 인공감염시켜본 결과 렉틴의 경쟁적 저해가 확인되었으므로 뿌리혹형성에 렉틴의 가교가 관여한다는 가설을 입증할 수 있었다. 6. Immunodiffusion에 의한 R. phaseoli의 항원 결정기는 R. japonicum과 일부 관련성이 있을뿐 다른 Rhizobium spp.과는 전혀 다른 것으로 나타났다.
생쥐의 배우자간 인식과 수란관과 난자의 상호작용을 연구하기 위하여 수정 전후의 난자와 배아에 형광으로 표지된 5가지 렉틴(UEA-1. LCA, PNA RCA-1, GSL-1)을 처리하여 투명대, 위낭강 원형질 막에서 렉틴의 결합양상을 관찰하였다. 미수정난자 및 수정란의 투명 대에는 UIA-1을 제외한 4가지 렉틴이 결합하였다. PNA RCA-1, GSL-1은 투명대의 의총보다 내층에 강하게 결합되었고 UEA-1과 LCA는 투명대의 전층에서 미약하지만 고르게 결합하였다 배란된 난자의 위난강은 LCA와 PNA에 의해 결합되었으며 UEA-1은 수정 이후부터 GSL-1은 2-세포기 이후부터 위난강에 결합하였다. 난구세포를 제거하고 체외성숙을 일으킨 난자의 위난강에는 5가지 렉틴 모두 결합하지 않았다. 난자와 배아의 원형질막은 PNA. RCA-1, GSL-1에 의해 결합되었고, LCA 및 UEA기은 수정 이후부터 원형질막에 결합하였다. 이상의 결과에서 glucosamine, N-acetylgalactoamine 관기를 함유한 물질이 난구세포에서 생성되어 위난강에 축적되며 배란 후부터 난자의 위난강내 탄수화물관기는 수란관내액의 영향을 받는 것으로 사료된다. 난자 투명대의 탄수화물관기는 내층에 밀집되어 분포하는데 이는 정자의 투명대 관입 조절과 관련된 것으로 사료된다. 수정 후 난자의 원형질막 표면에 fucose와 mannose 등의 탄수화물 잔기가 새로이 노출되며 초기배아 발생동안 위난강에 존재하는 구조물의 렉틴 결합 특성이 유지되었다.
렉틴(Lectins)은 세포막의 당단백질의 과당류 말단기에 특이적으로 결합하는 비면역성의 당단백질 혹은 단백질을 말하는데 정상세포와 변형된 세포에서 렉틴반응의 차이가 남으로써 요즘에는 렉틴을 병리학적 진단에 이용 가능하게 되었다. “Loss of contact inhibition”은 세포 악성화의 중요한 특징으로 세포의 악성화는 세포막의 구조의 변화와 관계가 있을 것으로 알려져 왔으며 1989년 후두암에서 PNA의 반응이 양성 반응을 나타낸다고 보고되어 저자들은 7가지의 렉틴을 이용하여 후두암전구증의 하나인 후두각화증에서 이형성(Atypia)의 존재유무에 따른 렉틴 반응의 변화를 알아보고자 본 연구를 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 이형성이 없는 단순 후두각화증에서는 Con A와 WGA만이 기저세포에 반응이 있었으며, 후두각화증의 가장 중요한 부위인 극세포층에서는 WGA, RCA-I, PNA, SBA, UEA-I, DBA가 세포질에는 반응이 없이 세포간교에만 염색이 되는것을 관찰할 수 있었고 Con A는 반대로 극세포층의 세포질에 반응을 하였으나 세포간교에는 반응이 없었다. 2. 이형성을 동반한 후두각화증에서, 기저세포에서는 반응의 차이가 없었고 극세포층에서는 UEA-I, RCA-I. WGA, PNA, SBA는 세포간교에서 반응이 나타나지 않았고 세포질에서 양성 반응을 관찰 할 수 있었으며 DBA, Con-A에서는 반응의 차이를 관찰 할 수 없었다. 따라서 후두각화증의 극세포층 세포막에서 UEA-I, RCA-I, WGA, PNA, SBA 반응의 소실은 후두암으로의 진행과 밀접한 관계가 있는 이형성의 존재를 암시한다하겠다.
렉틴은 T-cell 자극 분열효과 및 항종양효과 이외에도 당특이성에 의한 세포표면이나 용액내에 존재하는 당류의 확인 및 연구에 유용하게 쓰이고 있어 최근들어 특히 흥미의 대상이 되고 있다. 렉틴은 주로 식물을 대상으로 연구되어져 왔으며, 이러한 연구결과, 렉틴은 단백질성 물질이라는 공통점을 제외하고는 생화학적, 면역학적 성질이 매우 다양한 것으로 나타났다. 본 연구에서는 표고버섯을 부위별로 구분하여 그 화학적 조성분석과 단백질 분리를 실시하고, 렉틴을 정제하여 생리활성의 특성을 구명하였다. 표고버섯은 신선한 것일수록 단백질 추출이 용이하며, 균산이 균병에 비해 단백질 량이 2배 정도 많았다. 렉틴은 $40^{\circ}C$ 이하에서 그리고 산성보다는 알칼리성에 더 안정하였다. 당 특이성에 있어서는 galactose, fucose, glucosamine, lactose, N-aretyl-D-galactosamine에 특이성을 지니는 것으로 나타났으며, 분리한 렉틴은 당단백질임을 알 수 있었다.
택사로부터 황산암모늄 분별 침전, DEAE-cellulose ion exchange chromatography, Sephadex G-150 chromatography 등의 방법을 이용하여 렉틴을 분리, 정제하였다. 정제한 렉틴의 분자량은 gel filtration법에 의해 측정한 결과 90,500 dalton이었으며, SDS polyacrylamide gel 전기영동을 실시한 결과 subunit 분자량은 각각 42,000, 27,000, 22,500 dalton으로 나타나므로 택사 렉틴이 heterotrimer임을 알았다. 정제된 택사 렉틴은 사람 적혈구의 경우 모든 혈액형에 대하여 응집현상을 나타내었으며 돼지, 쥐 및 개 등의 적혈구에 대해서도 모두 응집현상이 나타나 혈구 비특이성임을 보여주었다. 또한 이 렉틴은 sialic acid, glucose, ribose, sucrose, lactose, galactose 등 당에 의해서, 그리고 $Hg^{2+},\;Fe^{2+},\;Cu^{2+}$ 이온 등에 의해 적혈구 응집력이 저해되었다.
겨우살이는 전통적으로 항암활성이 있는 약용식물의 하나로 알려져 왔고, 렉틴은 세포독성 및 면역자극 자극 활성을 가지는 대표성분으로 인정되고 있다. 한국산 겨우살이에 함유되는 렉틴은 유럽산의 그것과는 달리 galactose와 N-acetylgalactosamine(GalNAc) 특이성을 동시에 가지는 렉틴 성분인 KML인 것으로 나타났다. Sandwich ELISA법을 이용하여 각기 다른 종류의 숙주나무에서 유래된 5종의 겨우살이로부터 렉틴 함량을 비교한 결과, 숙주나무별 차이가 인정되어 밤나무 겨우살이는 참나무 겨우살이에 비하여 약 10배 많은 렉틴을 함유하고 있었다. L5178Y-ML25 lymphoma 세포에 약 90%의 세포독성을 나타내는 농도의 KML과 한국산 참나무 유래 겨우살이 추출물인 KM-100에 두 종류의 단일클론 항체(9H7-10 and 8B11-2C5)를 동시처리한 후 세포독성 중화효과를 조사한 결과, KML의 경우 약 10%, KM-110의 경우 약 30%의 세포독성을 보였다. 이러한 결과는 겨우살이에서 렉틴 외에도 세포독성을 가지는 다른 성분이 존재할 것으로 사료되었다. RAW 264.7 대식 세포주에 KM-110과 KM-110으로부터 렉틴이 제거된 분획인 LFKM-110을 자극시킨 결과, LFKM-110에서 $TNF-{\alpha}$ 및 IL-6와 같은 cytokine의 생산을 증진시키는 결과를 보였다. 따라서 KM-110에서 면역 세포를 자극하는 다른 성분의 존재하고 있음을 강하게 제시되었다.
렉틴의 항영양작용기구 해명의 하나로서 마우스 반전소장에의 흡착양상을, $^3$H로 레벨한 렉틴을 가지고, 방사활성을 측정했다. 그 결과, 소장부위에 의한 흡착량은 유의차가 없었고, 흡착포화시간은 60분간 37$^{\circ}C$에서, 흡착량은 8.6$\times$$10^{7}$ 1mg intestine이 되고, 렉틴이 소장세포와 반응해서, 여러 가지 항영양작용을 유도한다고 생각된다. $^3$H 레벨한 렉틴 농도가 높아짐에 따라 흡착량은 크게되고, 2mg/$m\ell$에서 거의 포화에 달했다. pH7부근에서 흡착량이 제일 크고, 생체내에서의 소장은 렉틴이 가장 흡착되기 쉬운 상태임을 알 수 있었으며 저해인자는 fetuin과 EDTA이었다.
한국산 바지락으로부터 새로운 렉틴을 아세톤파우더, 황산암모늄 침전, 친화력 크로마토그라피 및 FPLC의 이온교환 크로마토그라피법으로 분리 정제하였다. 이 렉틴은 사람의 적혈구를 비특이적으로 응집시켰으며, 생쥐와 토끼의 적혈구 및 생쥐의 복수 Sarcoma 180 세포를 응집시키지 않았고 사람의 말초혈관 임파구도 분열 촉진시키지 못하였다. 전기영동상에서 하나의 주된 띠로 나타났으며 분자량은 Biogel P-300겔 여과에서 131,000, SDS 전기영동상에서는 125,000으로 나타났다. Subunit는 33,000과 30,000의 다른 폴리펩타이드로 tetramer로 추정된다. EDTA에 의해서 활성이 저해된 바지락 렉틴은 $Ca^{++}$과 $Mn^{++}$에 의하여 적혈구 응집력이 회복되었다. 또한 이 렉틴은 약 4.2% 중성당을 함유한 당단백질임이 확인되었다.
본 연구는 한국산 겨우살이 물 추출물과 이것에서 분리한 렉틴 성분을 실험적으로 간암을 유도한 흰쥐에게 투여하여 이들이 간 발암억제 효과 및 그 기전의 일부인 apoptosis와의 관련성을 조사하고자 하였다. 이를 위해 80~90 g 정도로 이유된 .3주령 Sprague-Dawley종을 한국산 겨우살이 물 추출물 투여 (100 $\mu\textrm{g}$/kg BW), 렉틴의 투여 10 ng/kg BW)와 DEN 투여 여부에 따라6군으로 나누어 발암물질 투여 1주일 후부터 주 2회 복강 투여하였다. 총 사육기간은 9주간이었고, 희생시킨 후 간조직을 분리하여 조직 병리학적 변화 측정을 위한 전암성 병변의 지표인 GST-P$^{+}$foci의 수와 면적을 측정하였고, apopotosis와의 관련성을 조사하기 위하여 apoptosis 염색, DNA fragmentation 측정 및 Bcl-2, c-lAP2, caspase-9, caspase .:, fas-L의 발현정도 측정을 위한 western blotting을 실시하였다. 그 결과 다음과 같은 결론을 얻었다. (1) 체중은 발암물질에 의해 식이 섭취가 감소하는 것을 고려하여 제한 섭취를 실시하였으므로 발암물질 투여 에 따른 차이는 없었으며, 겨우살이 또는 렉틴의 투여에 따른 차이도 나타나지 않았다. 간 무게는 겨우살이, 렉틴의 투여에 따른 변화는 보이지 않았으나 발안물질 투여 에 따라 유의적으로 증가하였고, 체중에 대한 상대적인 간 무게에 대한 결과도 간 무게의 결과와 유사하였다. 따라서 본 연구에 사용한 투여 량의 한국산 겨우살이 물 추출물 및 렉틴이 간에 독성을 나타내는 농도가 아닌 것으로 보여진다. (2) GST-P$^{+}$ foci의 수, 면적과 PCNA은 겨우살이 물 추출물과 렉틴의 투여에 따라 모두 유의적으로 감소하였고, 겨우살이 물 추출물과 렉 틴에 따른 차이는 보이지 않았다. (3) 조직화학적으로 apoptosis염색한 결과와 DNA fragmentation을 측정한 결과는 모두 apoptosis에 대한 증거가 나타나지 않았다. 그러나 western blot을 측정한 결과 apoptosis을 억제하는 것으로 알려진 단백질인 Bcl-2와 IAP2는 발암물질 투여에 의해 증가된 발현 정도가 겨우살이 물 추출물이나 렉틴의 투여에 따른 차이를 보이지 않았으며, apoptosis를 촉진하는 단백질인 caspase-9, fas-L의 경우에는 발암물질 투여 에 의 해 증가된 발현 정도가 겨우살이 물 추출물 및 렉틴의 투여시 더욱 증가되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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