목 적 : 담즙 흐름의 결정적인 인자는 담즙산의 장간순환이며, 담즙 흐름이 저하되면 직접 빌리루빈 분비 장애가 오고 혈청 직접 빌리루빈과 혈청 담즙산이 증가한다. 담즙산은 연장아나 성인에서 급만성 간염, 간경화, 담즙정체증 등의 진단에 도움이 되는 지표이다. 신생아의 간은 담즙산 저장이 저하되어 있고 담즙산의 흡수와 분비가 미성숙하며 장간순환이 감소되어 있다. 저자들은 총정맥영양에 의한 미숙아 담즙정체증에서 혈청 담즙산의 진단적 의의를 알아보고자 하였다. 방 법 : 2004년 1월부터 2005년 7월까지 충남대학교병원 신생아 집중치료실에 입원하였던 신생아들 중 선천성 감염, 패혈증, 간외담도폐쇄증, 해부학적 소화기계 이상이 배제되고 담즙정체가 없었던 신생아들을 선별하여 생후 1일부터 60일까지 혈청 담즙산을 측정하고 그 변화를 분석하였다. 총정맥영양에 의한 담즙정체증으로 진단되었던 미숙아들에서 혈청 직접 빌리루빈, 혈청 담즙산, 감마글루탐산전이효소, 알칼리인산분해효소를 측정하고 상호관계를 비교 분석하였다. 결 과 : 담즙정체증이 없는 신생아는 292명으로 남아 156명(53.4%), 여아 136명(46.6%)이었고 만삭아 199명(68.2%), 미숙아 93명(31.8%)이었다. 담즙정체증이 없는 신생아에서 출생 당시 혈청 담즙산은 $15.03{\pm}7.43{\mu}mol/L$이었으며, 점차 상승하여 생후 2주 이후에는 $20-25{\mu}mol/L$으로 비교적 일정하였다. 총정맥영양에 의한 담즙정체증이 있었던 미숙아는 34명으로 남아 13명(38.2%), 여아 21명(61.8%)이었으며 재태연령과 출생체중은 각각 $30^{+2}{\pm}2^{+3}$주, $1,381.1{\pm}403.6g$이었다. 총정맥영양에 의한 미숙아 담즙정체증이 있었던 미숙아에서 혈청 담즙산이 95% 신뢰구간의 상한값인 $40.78{\mu}mol/L$을 넘는 시기는 $28.1{\pm}18.3$일이었고 혈청 직접 빌리루빈이 2.0 mg/dL 이상으로 상승된 시기는 $34.9{\pm}18.3$일로 혈청 담즙산 농도의 상승이 혈청 직접 빌리루빈의 상승보다 약 7일 먼저 선행하는 경향을 보였으나 통계적 유의성은 없었다. 혈청 담즙산, 감마글루탐산전이효소, 알칼리인산 분해효소를 비교 분석하였을 때, 혈청 직접 빌리루빈과 가장 상관성이 높은 지표는 혈청 담즙산이었다(r=0.487, P=0.000). 결 론 : 총정맥영양에 의한 미숙아 담즙정체증에서 혈청 담즙산은 가장 상관성이 높은 지표이며 혈청 직접 빌리루빈 보다 먼저 상승하는 경향을 보여 조기 진단 및 조기 치료에 유용할 것으로 사료된다.
한국유가공기술과학회 2003년도 정기총회 및 제57회 추계심포지움 - DDA 농업협상에 따른 유가공 업계의 대응
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pp.61-74
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2003
담즙산은 cholesterol의 대사산물로 체내에서 cholesterol을 제거하는 주경로로서, 체내 cholesterol 대사를 조절하는 중요한 수단이다. 최근에 복합담즙산 분해활력이 높은 L. acidophilus에 의한 혈중 cholesterol 저하효과에 관한 많은 연구들이 보고되고 있으며, 이것은 복합담즙산의 분해로 생성되는 유리 담즙산의 분 배출 증가와 장내 cholesterol 흡수에 필요한 복합 micelle 형성의 방해에 의한 것으로 알려져 있다. 즉, 유리 담즙산은 장내에서 복합담즙산보다 용해성이 낮아서 흡수되지 않고 분으로 배출되기 쉬워, 간에서는 분으로 배출된 양만큼의 부족한 복합담즙산을 보충하기 위해 cholesterol을 이용하여 새로운 복합담즙산을 생성하기 때문에 결국은 체내의 혈중cholesterol 수준을 감소시키는 것으로 생각된다. 또한 담즙으로 분비되는 복합담즙산은 소장내에서 cholesterol의 용해 흡수에 도움을 주지만 유리 담즙산은 cholesterol 용해성이 낮기 때문에, 장내 cholesterol 흡수에 영향을 미치는 것으로 생각된다.
간세포내 두가지 microsome효소인 HMG-CoA reductase와 cholesterol-$7{\alpha}$-hydroxylase는 콜레스테롤 합성과 담즙산으로의 분해의 조절효소임은 이미 알려진 사실이다. 본 실험에서는 콜레스테롤의 대사산물인 4종류 담즙산들이 간세포내의 콜레스테롤 합성 및 HMG-CoA reductase활성에 미치는 효과를 조사하였다. 간세포의 배양에서 간세포로의 담즙산 흡수는 배지내 농도(1mM~10mM)와 배양시간(1/2~3hr)의 차이에 따라 비례적으로 증가하였다. 콜레스테롤 합성저해에 대한 담즙산의 효과는 배지내 담즙산의 농도 및 배양시간에 따라 크게 감소하였다. 분리시킨 microsome내 HMG-CoA reductase의 활성에 대한 담즙산의 저해효과는 insulin 투여에 의하여 효소활성을 촉진시킨 경우에서도 뚜렷하였으며 콜레스테롤 합성 역시 저하되었다. 분리시킨 간세포막 내 $Na^+$,$K^+$-ATPase의 활성은 1.8~2.5mM정도의 배지내 담즙산 농도까지 증가함을 보였으나 cholic acid 흡수는 상기 효소의 활성에 거의 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 이러한 이유는 아직 불분명하나 1차 대사산물인 cholic acid의 흡수는 단순확산에 의한 것으로 사료되며 이에 대한 더 많은 연구가 요구된다.
유리 담즙산 및 담즙산의 글리신복합체를 dansyl cadaverine을 형광유도체화제로 사용하여 역상HPLC에서 분리하고 형광으로 검출할 수 있는 방법을 개발하였다. 8종류의 유리 및 복합체 담즙산을 dimethylformamide를 반응용매로 하여, amide결합 형성반응용 축합제로서 diethyl phosphorocyanidate를 사용하여 형광유도체화제인 dansyl cadaverine과 반응시켰다. 반응액중 일부를 20% methanol-water/acetonitrile을 기본 용리액으로한 직선 농도구배 조건의 HPLC에 의하여, 8가지 담즙산류를 완전히 분리할 수 있었다. 역상컬럼으로부터 용출된 담즙산의 형광유도체는 여기파장(${\lambda}ex.$) 340 nm, 형광파장 (${\lambda}em.$) 520 nm에서 측정하여 콜린산의 경우 약 10 pg(S/N 비=5)까지 측정할 수 있었다.
담즙산과 결합을 하여 콜레스테롤 농도에 영향을 주는 것으로 보고된 대두 단백질의 생체내 효소에 의한 미분해성 분획물 개량 메주로부터 분리하였다. 개량 메주로부터 pH 6.8 과 pH 4.5의 분획물들을 분리하여, 초음파 처리와 투석을 행한 후 Sephadex G-75 column chromatography를 실시하여 부분 정제하였다. 부분 정제된 분획물들을 chemiluminescence 방법에 의해 in vitro에서 검색을 한 결과, pH 4.5 분획물중의 하나가 담즙산과 강하게 결합하는 것으로 밝혀졌다. 또한 대두 기원의 pepsin 비분해성 분획물 또한 pH 4.5 분획물의 chemiluminescence 결과와 일치하였다. 따라서 본 연구에서 고안한 chemiluminescence 법은 in vitro에서 담즙산 결합 활성도 측정 및 콜레스테롤 대사에 관한 연구의 기본적인 연구 수단을 평가되며 따라서 본 연구 결과는 이 분야의 연구에 기초 자료로 제공될 수 있는 가능성을 제시하였다.
담즙산은 cholesterol의 대사산물로 체내에서 cholesterol을 제거하는 주경로로서, 체내 cholesterol 대사를 조절하는 중요한 수단이다. 최근에 복합담즙산 분해활력이 높은 L. acidophilus에 의한 혈중 cholesterol 저하효과에 관한 많은 연구들이 보고되고 있으며, 이것은 복합담즙산의 분해로 생성되는 유리 담즙산의 분 배출 증가와 장내 cholesterol 흡수에 필요한 복합 micelle 형성의 방해에 의한 것으로 알려져 있다. 즉, 유리 담즙산은 장내에서 복합담즙산보다 용해성이 낮아서 흡수되지 않고 분으로 배출되기 쉬워, 간에서는 분으로 배출된 양만큼의 부족한 복합담즙산을 보충하기 위해 cholesterol을 이용하여 새로운 복합담즙산을 생성하기 때문에 결국은 체내의 혈중 cholesterol 수준을 감소시키는 것으로 생각된다. 또한 담즙으로 분비되는 복합담즙산은 소장내에서 cholesterol의 용해 흡수에 도움을 주지만 유리 담즙산은 cholesterol 용해성이 낮기 때문에, 장내 cholesterol 흡수에 영향을 미치는 것으로 생각된다.
본 연구에서는 어린감과 성숙감의 탄닌 함량 및 담즙산과의 결합능력을 비교 조사하였다. 또한 사람의 장내 세포인 Caco-2 cell에 어린감과 성숙감 추출물을 처리한 후 고농도의 DCA로 자극시켜 생성되는 NO의 수준과 TEER의 차이를 확인하였다. 탄닌 함량과 담즙산의 결합능력은 성숙감에 비해 어린감에서 유의적으로 높은 것으로 나타났으며 어린감 산성 에탄올 추출물에서 유의적으로 가장 높은 탄닌 함량 및 담즙산 결합능력을 보였다. NO 생성 억제능으로 확인한 염증반응에서도 어린감 산성 에탄올 추출물이 유의적으로 가장 높은 효과를 보였으며 DCA에 의해 유도된 장세포 간극의 느슨함을 유의하게 막아줄 수 있음이 확인되었다. 본 연구 결과를 토대로 어린감의 산성 에탄올 추출물은 고지방 식사를 통해 고농도로 축적되는 담즙산에 의해 형성된 유해한 장내 환경을 건강하게 유지시켜줄 수 있는 기능성 소재로 개발할 가능성이 있음이 확인되었다.
담즙산 분비 저하 및 콜레스테롤의 과도한 분비는 담석 형성의 주된 원인으로 담즙내의 담즙산과 콜레스테롤 및 그 전구 물질인 스테롤의 상대적인 농도는 담즙 성분의 이상을 알아보기 위한 중요한 지표로 알려져 있다. 이에 본 연구에서는 염기를 이용한 가수 분해와 pH 14와 1에서 두 번의 액체-액체 추출을 거친 후, $MSTFA/NH_4I$ 혼합액으로 유도체화 시키는 전처리 방법과 GC/MS를 이용한 새로운 분석 방법을 설정, 담즙산과 스테롤 그리고 콜레스테롤의 동시 분석을 시도하였다. 그 결고 회수율은 73.56-96.95% 이었고 within-a-day 및 day-to-day 분석의 RSD 값은 각각 1.72-13.79%, 0.68-14.10% 이었으며, 이 방법을 간내 담석증 환자에 적용하여 담즙과 담석내에 존재하는 7종의 스테롤과 5종의 담즙산, 그리고 콜레스테롤의 농도 및 그들간의 상대적인 농도 분포를 측정한 결과 담즙고 담석에서 현저히 다른 차이를 보였다.
미강을 혈중 콜레스테롤 저하 효과가 있는 기능성 식품소재의 원료로 활용하는 데 필요한 기초 자료를 얻기 위하여 미강 단백질의 가수 분해물을 제조하여 담즙산 결합 획분을 분리하고 일부 물리화학적 특성을 조사하였다. 미강 단백질을 탈지 미강으로부터 알칼리 추출과 등전점 침전 방법을 이용하여 제조하였다. 미강 단백질을 기질로 하여 pH-drop method로 측정한 효소의 상대적 활성과 가수분해시 가수분해율의 변화를 비교 평가하여 기질의 가수분해에 적합한 효소를 선택하였다. Esperase에 의한 가수분해물을 한외여과(MWCO : 10 kDa)하여 두 부분으로 나누었다. 각 분획물을 cholic acid를 공유결합 시킨 ${\omega}-aminohexyl$ Sepharose 4B column에 걸어, 소수성 상호작용에 의해 cholic acid와 결합하는 폴리펩티드 및 펩티드를 deoxycholate 완충용액으로 용출시켜 분리하였다. 겔투과 크로마토그래피(Sephadex G-50)를 이용하여 한외여과 여과백의 담즙산 결합물에 대해 분자량 분포를 측정한 결과, 대부분 $2\;kDa{\sim}10\;kDa$에 걸쳐 넓게 분포하였고 일부는 $0.2\;kDa{\sim}0.6\;kDa$사이에 존재하였다. 한외여과 잔류액의 담즙산 결합물에 대해서는 preparative reverse phase HPLC를 실시하여 미강 단백질 가수분해물에서 3개(R-1, 2, 3)의 Peak를 분리하였다. 각 peak의 총 아미노산과 유리 아미노산 조성을 분석하여 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드 부분의 아미노산 조성을 조사하였다. 그 결과 미강 단백질 가수분해물에서 얻은 peak의 경우 proline 함량이 미강 단백질의 4배에 달했고, 평균 소수도가 높은 peak일수록 유리 아미노산이 함량이 높았으며 평균 소수도는 미강 단백질보다 다소 높은 것으로 나타났다.
숙성된 갓김치에서 분리된 유산균을 pH 2.5에서 2시간 반응시킨 후 0.3% oxgall 존재 하에서 3시간 배양시킨 결과 MLK11, MLK22, MLK27, MLK41 및 MLK67 균주들은 $10^5$ CFU/ml 이상의 균수를 유지하여 높은 저항성을 보인 반면, MLK53 균주는 대부분의 균수가 사멸되어 매우 민감한 것으로 나타났다. 담즙산에 대한 내성이 강한 균주들 대부분은 복합 담즙산의 탈포합능이 있었으며, MLK22와 MLK67 균주는 sodium glycocholate로부터 3.5 mM 이상의 cholic acid을 유리시켜 가장 높은 탈포합능을 보인 반면, MLK13과 MLK41은 각각 1.35와 1.16 mM 정도 낮은 양의 cholic acid를 유리시켰다. 특히, MLK22와 MLK67의 탈포합능은 sodium taurocholate 혹은 포합담즙산 혼합물 보다는 sodium glycoholate 존재 하에서 더 높게 나타났다. 게다가 sodium glycocholate와 sodium taurocholate으로부터 MLK22와 MLK67이 생산하는 bile salt hydrolase (BSH)의 활성은 정지기 초기에 최대를 이르렀고 MLK67 보다는 MLK22의 BSH 활성이 다소 높았다. 한편, 실험 균주들의 콜레스테롤 제거능은 5.22-39.16 ${\mu}g$/ml로 균주별 유의적인 차이가 있었으며(p<0.05), 그 중에서 MLK67 균주는 0.3% oxgall, cholic acid 및 taurocholic acid로부터 가장 높은 콜레스테롤 동화능을 나타내었다. 따라서 실험 균주 중 높은 내산성과 내담즙성을 가지며, 담즙산 탈포합능 및 콜레스테롤 동화능이 유의하게 높은 MLK67 균주는 probiotic 균주로서의 가능성이 있는 것으로 간주되어 이를 생화학적 특성과 당분해능 및 염기서열 분석에 의해 동정한 결과 Pediococcus pentosaceus MLK67로 확인되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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