국내에서 분리된 파밤나방 핵다각체병바이러스(Spodoptera exigua nuclear polyhedrosis virus: SeNPV)의 생화학적인 특성을 규명하기 위하여 몇가지 실험을 행하였다. SeNPV는 하나의 envelopeso내에 다수의 nucleocapsid가 존재하는 MNPV(multiple embeded NPV)형태였다. 다각체단백질은 분자량 30kb의 단일 band로 나타났으며, Spodoptera litura NPV와 Bombyx mori NPV의 다각체단백질 항체에 반응하여 뚜렷한 침강선을 형성하였다. 비리온 단백질을 은염색한 결과, 많은 수의 minor band들이 포함된 49개의 band로 나타났으며, 바이러스 DNA를 분리하여 여러종의 제한효소에 의한 대략적인 genome size는 약 110kb 였다.
팽나무버섯(Flammulina velutipes)에서 polyphenol oxidase가 황산암모늄 침전법, Superdex G-75 겔여과크로마토그래피, Phenyl superose 친화크로마토그래피, Mono-Q 이온교환수지 크로마토그래피, 그리고 Superdex S-200 겔크로마토그래피 등의 과정으로 정제되었으며, 특성화 되었다. 정제된 효소의 비활성도는 199.1 units/mg으로 나타났으며, 이 효소는 40 kDa의 단일폴리펩티드 사슬로 구성되어 있음이 밝혀졌다. 효소반응의 최적 pH와 온도는 각각 6.0과 $25^{\circ}C$,이었으며, pH 3과 5 사이의 산성조건과, pH 8과 10 사이의 알카리 조건에서는 활성이 감소되거나 상실되었다. 이 효소는 L-DOPA와 caffeic acid 등의 o-diphenols류에 대하여 높은 효소활성을 나타내었으며, L-DOPA와 caffeic acid에 대한 Km 값은 각각 3.97mM과 1.78mM로 계산되었다. 2-mercaptoethanol, L-ascorbic acid, sodium bisulfite, EDTA와 $Mg^{2+}$은 팽나무버섯 pholyphenol oxidase의 효소활성을 감소시켰으며, $Cu^{2+}$, $Fe^{2+}$, $Zn^{2+}$ and $Ni^{2+}$ 등은 효소의 활성을 촉진하는 인자로 밝혀졌다. 정제된 효소는 $-70^{\circ}C$에서 3개월, 그리고 $-20^{\circ}C$에서 1개월간 활성의 손실 없이 저장이 가능하였다.
Bacillus sp. J105 strain으로부터 유도된 ${\beta}-lactamase$는 ammonium sulfate 침전, 이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 겔 여과 등의 과정을 거쳐 SDS-PAGE에서 단일 band로 정제하였다. 정제된 효소의 분자량은 31 kDa이었으며 등전점은 7.35이었다. 효소반응의 최적 pH와 온도는 각각 5와 $40^{\circ}C$이었다. 정제 단백질의 총 아미노산 조성의 분석 결과, Gly과 Ala이 각각 14.1과 13.3 mole%로 가장 많은 아미노산 잔기를 차지하고 있었다. 정제 효소의 ampicillin을 기질로 하였을 때의 Km값은 1.33 mM이었고 Vmax값은 0.36 mM/ml이었다.
식품의 건조는 저장성을 향상시키고 수송을 간편하게 하나 특별한 경우는 건조과정에서 일어나는 성분변화에 의해 풍미, 색깔, 조직 등이 향성되게 하는 경우도 있다. 그러나 일반적으로 건조에 의해 풍미의 저하, 색깔의 퇴조, 영양성분의 손실 및 조직과 형태의 손상 등 품질을 저하시키므로 가능한 저온에서 단시간에 수분을 제거해야 한다. 건조식품의 저장성은 수분활성도, 제품의 종류, 저장온도등 다양한 요인들에 영향을 받으며, 특히 수분 활성도에 따라 비효소 갈색화 반응, 지방의 산패, 미생물의 발생정도가 달라진다. 따라서 건조식품 저장시 변질을 방지하기 위해서는 식품의 수분함량을 측정할 수 있는 등온흡습곡선을 작성하는 것이 중요하다. 또한 식품의 단분자층 수분함량을 결정하고, 흡습에 필요한 에너지를 구함으로서 건조식품의 저장조건 및 포장조건의 선택시 유용한 자료가 된다. 특히 식품분말의 흡습특성은 분말입자의 크기, 형태, 화학성분 등과 밀접한 관련이 있다. 위의 사실로 미루어 볼 때 본 연구에서는 시판 유통되고 있는 두부를 진공동결 시킴으로써 위생화와 장기저장 가능성을 연구하면서 진공동결 건조 후 시료의 수분활성, 재수화 및 일반성분 변화를 검토하고자 한다.
역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 담배(Nicotiana glutinosa)에 증식시킨 7종의 오이 모자이크 바이러스(CMV)를 검정하였다. RT-PCR을 위한 간단하고 신속한 바이러스 핵산의 조즙액 추출법이 개발되었으며, CMV 외피단백질 유전자 부위를 기초로 하여 제작한 20개의 염기로 구성된 primer를 사용하여 RT-PCR을 실시한 결과, 약 490 염기쌍의 DNA 단편들이 이병식물의 조즙액으로부터 증폭되었다. EcoRI 및 MspI을 이용한 RT-PCR 산물의 분석에 의하여, 공시한 7종의 바이러스는 모두 CMV subgroup I으로 동정되었다. Ouchterlony 한천젤 이중 확산법을 이용한 항혈청 검정에서도 7종의 바이러스 모두 CMV-Y의 항혈청과 단일의 침강선을 형성하였다.
형질전환 작물 개발시, 위해성 평가에 영향을 미치게 될 요인들을 파악하고, 이에 대한 과학적 근거의 마련을 위한 실험 자료 생산계획의 확립과 실험을 진행하는 것이 매우 중요하다. 또한 유전자변형작물을 개발한 후 정부의 승인을 위한 과학적이고 신뢰할 만한 자료를 축적하기 위해서는 오랜 기간과 많은 자본이 투입된다. 이에 따라, 본 연구에서는 CMV 저항성 유전자변형 고추에 대한 평가분석 연구를 통해 유전자변형작물의 환경위해성 평가를 수행하는데 있어 도입유전자 확인을 위한 평가서 작성을 위해 요구되는 서던 분석을 위한 탐침 포화, 도입유전자의 발현 해석을 위한 RT-PCR, ELISA 실험에 관한 사례를 제시하고자 하였다. 서던 분석을 위해 삽입 유전자 전체 서열의 확인이 가능한 10개의 부분적으로 겹치는 탐침을 제작하였다. 서던 분석 결과, 고추에 도입된 외래유전자가 단일사본으로 존재하여, 게놈전체에서 도입된 위치 이외에 상동성을 갖는 다른 조각 부위가 없음을 확인하였으며, 도입유전자 전체의 안정성을 확실히 입증할 수 있었다. 그와 더불어, 역전사 중합효소 연쇄반응 및 효소면역법 실험을 통하여, CMV 저항성 고추의 잎, 과실 등과 같은 주요 기관에서의 삽입 유전자에 대한 안정적인 발현을 확인 할 수 있었다.
Whatman carboxymethyl cellulose CM 32와 CM 70으로 부터 색소단으로서 trinitrophenyl를 함유하는 섬유소 유도체를 합성하였다. 먼저 diaminoethyl기를 부가하여 DAE-CM-celulose를 얻고 다시 DAE-CM기 부위를 2,4,6-trinitrophenyl기로 치환시켜 TNP-cellulose를 조제하였다. CM 32로 부터 얻은 TNP-cellulose는 입자의 평균 크기가 $44.6{\pm}9.6{\mu}mD{\times}127.9{\pm}22.5{\mu}mL$로서 CM 70의 것에 비하여 3분의 1 수준으로 길이가 짧은 반면 폭은 보다 팽윤된 상태이었으며, ${\varepsilon}$-TNP-lysine의 molar extinction coefficient $1.33{\times}10^4$을 적용하여 측정한 그램당 TNP의 몰분율은 0.68 millimole로서 CM 70의 것보다 5.6배 높았다. 섬유소 분해효소에 의한 TNP-cellulose의 분해산물인 TNP-oligosaccharide의 최대 흡수 파장 ${\lambda}_{max}$는 344 nm이었다. 이들 TNP-cellulose를 기질로 하여 Onozuka R-10 효소액을 반응시킨 결과 반응 생성물의 흡광도가 효소의 농도에 비례하는 관계를 나타내었으며 CM 32의 것을 사용한 경우에 그 기울기가 현저히 커서 낮은 효소 농도 범위에서도 감도가 높음을 확인하였다.
목질계 바이오매스를 이용하여 효소를 사용하지 않고 발효당을 얻기 위해 황산을 이용한 당화를 수행하였다. 바이오매스로는 pinus rigida와 palm농업 부산물인 EFB를 사용하였다. 산을 이용한 당화에서는 당의 과분해 생성물을 줄이기 위한 당화조건을 생각해 보아야 한다. 따라서 본 연구에서는 목질계 바이오매스를 이용한 2단 산당화를 수행하였다. 산을 이용한 1차 가수분해에서는 72 wt%의 황산을 이용하여 $80^{\circ}C$에서 반응시켰을 경우 가장 높은 당화율을 보였고 pinus rigida와 EFB 각각 11.49 wt%, 32 wt%의 당화율을 보였다. 이후 1차 가수분해에서 얻은 액상을 9~15 wt%의 산농도가 되도록 묽혀 $50{\sim}120^{\circ}C$의 온도로 2차 가수분해를 진행했다. 2차 가수분해시 9%의 황산농도와 $120^{\circ}C$의 온도조건에서 80분간 반응시켰을 때 최종 글루코오스 당화율은 pinus rigida의 경우 86.8 wt.% (39 g/L), EFB의 경우 95.3 wt%(32.4 g/L)를 얻을 수 있었다. 각 단계에서 분석된 결과는 물질수지를 통해 확인하고 당화 효율을 비교해 보았다.
토양으로부터 역가높은 CGTase를 분비하는 호알칼리성 미생물을 분리하였으며, 동정 결과 Bacillus circulans로 판정되었다. 배양액 중의 CGTase를 ammonium sulfate 침전, DEAE-Sephadex 그리고 Sephadex G-100 column chromatography로 분리, 정제하여 단일 단백질 band를 얻었다. 정제된 CGTase의 분자량은 약 93,000, 최적 pH와 온도는 6.0, $50^{\circ}C$였으며, pH와 온도안정성은 5.5-11, $65^{\circ}C$까지였다. Soluble starch를 기질로 할 때의 $V_{max}$ 와 $K_{m}$ 값은 각각 0.16$\mu$mole $\beta$-CD/min, 14.3mg soluble starch/mi이였고 24시간 반응액의 $\alpha$-:$\beta$-:${\gamma}$-CD 의 생성비율은 1:8.1:1.9로서 $\beta$-CD를 우선적으로 합성하였다. 기질로 glucose와 maltose를 사용하였을 때 CD합성작용이 없었으며, sweet potato 그리고 cornstarch를 사용하였을 때 가장 높은 CD합성작용을 보였다. 어느 수준 이상의 과다한 CGTase 첨가경우에는 $\alpha$-CD생성이 급격히 증가하였다. 또한 정제된 CGTase는 stevioside에로의 당전이성을 갖고 있었다.
대두(大豆)중에 존제하는 장내(腸內) 가스 발생인자인 raffinose와 stachyose의 제거에 이용될 수 있는 Aspergillus niger의 ${\alpha}$-galactosidase는 Czapeck-Dox 액체배지와 밀기울 배지에서 5일간 배양하였을 때 효소생성이 제일 높았다. Czapeck-Dox 액체배양에서 raffinose와 $NaNO_3$가 효소생산에 가장 효과적인 탄소원과 질소원으로 나타났으며 밀기울 배양에서는 질소원 또는 탄소원의 첨가효과가 없었다. 생성된 조효소(組酵素)용액의 작용 최적 pH는 4.0-5.0, 안정도 최적 pH는 3.5-6.5, 최적온도는 $40-50^{\circ}C$ 였다. 합성기질인 p-nitrophenyl-${\alpha}$-D-galactoside에 대한 Michaelis상수는 0.42mM, 최대반응속도는 152${\mu}moles$ substrate/min/kg (고체배지)이었다. $HgCl_2$는 강력한 비경쟁 저해제로 작용하였고 p-chloromercuribenzoate는 낮은 농도에서 경쟁 저해제로 작용하였다. 조효소 용액은 raffinose와 stachyose를 완전 분해하여 단당류 만을 생성하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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