• 대한화학회지
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• 제63권6호
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• pp.427-434
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• 2019

단백질 폴딩 연구에 유용하도록 유비퀴틴 단백질의 페닐알라닌 45를 트립토판으로, 발린 26을 알라닌으로 변이시킨 HubWA 단백질을 모델로 삼아 소수성 상호작용이 단백질 폴딩 반응에 끼치는 영향을 탐구하였다. HubWA의 소수성 아미노산 중 14 개를 알라닌으로 치환한 변이 단백질을 제조하였고 이들 중 폴딩 연구에 적절한 4 개의 변이 단백질(V5A, I13A, V17A, I36A)을 얻어서 폴딩 반응의 진행 과정을 stopped-flow 장치로 측정하였다. 변이 단백질 V17A의 폴딩 반응은 HubWA와 마찬가지로 three-state 메커니즘을 따르며, V5A, I13A, I36A의 반응은 two-state 폴딩 메커니즘을 따르는 것으로 관찰되었다. 이는 HubWA 단백질의 폴딩 반응은 지엽적으로 구조적인 안정성을 지닌 부분이 존재하는 중간 단계가 먼저 형성된 다음 이들이 서로 퍼즐을 맞추는 것과 같은 방식으로 폴딩이 일어나는 collision-diffusion 메커니즘을 따르다가 소수성이 약한 아미노산으로 치환하였을 때 구조적인 안정성을 지닌 중간 단계가 관찰되지 않지만 폴딩 핵의 형성과 핵 주위로 native 구조가 형성되는 반응이 짝지어서 일어나는 nucleation-condensation 메커니즘으로 전환되는 것으로 해석되었다. 이러한 관찰은 단백질의 폴딩 경로는 지엽적인 구조의 안정성에 따라 서로 다른 메커니즘을 띨 수 있음을 시사한다.

• 대한화학회지
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• 제58권6호
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• pp.560-568
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• 2014

단백질 폴딩 반응에서 정전기적 상호작용의 역할을 라이신 29를 알라닌으로 치환한 변이 유비퀴틴을 사용하여 탐색하였다. 유비퀴틴의 입체구조에서 라이신 29의 곁사슬은 글루탐산 16과 아스파르산 21의 곁사슬과 근접한 거리에 있어서 곁사슬끼리 정전기적 상호작용을 통하여서 삼차원 입체구조를 안정화시킬 것으로 예측되었다. 라이신을 알라닌으로 치환하여 정전기적 상호작용을 제거하였을 때 유비퀴틴의 native state의 구조적 안정성이 ~20% 감소한 점은 라이신 29에 의한 정전기적 상호작용이 단백질 삼차구조의 안정성에 상당히 기여하고 있다는 점을 시사하였다. 폴딩 반응의 진행 과정을 stopped-flow 장치로 측정한 folding kinetics 실험은 이전에 관찰된 것과 마찬가지로 unfolded state에서 native state로 진행하는 과정에 중간단계를 거치는 three-state on-pathway 메커니즘을 따르는 것으로 나타났다. 더욱이 라이신 29에 의한 정전기적 상호작용이 중간단계의 구조적 안정성에 기여하는 정도가 native state의 구조적 안정성에 기여하는 정도의 ~55%인 것으로 나타났다. 이는 유비퀴틴 폴딩의 중간단계의 구조도 라이신 29에 의한 정전기적 상호작용에 의하여 상당히 안정화 된다는 것을 의미하며 따라서 정전기적 상호작용이 단백질 삼차원 입체구조의 골격이 완성된 폴딩의 마지막 단계에 형성되어 단백질 native state의 안정성에만 기여하는 것이 아니라 중간단계가 형성되는 폴딩 반응의 초기에도 형성되어 폴딩 반응을 이끌어가는데도 기여한다는 것을 의미한다.

• Biophysical Society Newsletter
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• 제7권1호
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• pp.6-10
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• 2001

• 생명과학회지
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• 제9권2호
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• pp.146-152
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• 1999

본 연구에서는 대장균 트립토판 중합효소(tryptophan synthase) $\alpha$ 소단위체의 폴딩에 있어 24번 잔기의 역할을 보고자 하였다. 24번 잔기인 트레오닌이 메티오닌, 알라닌, 세린, 류신 또는 리신으로 치환된 단백질를 대장균내에서 과량 발현시켜 수용성 구조의 양과 비수용성인 inclusion body양을 조사하였다. 그 결과 메티오닌이나 류신으로 치환된 $\alpha$ 소단위체는 트레오닌이 있는 소단위체와 마찬가지로 수용성 구조가 대부분을 차지하였다. 반면, 세린이나 알라닌 또는 리신으로 치환된 단백질들은 많은 양이 inclusion body로 발현되었다. 이 결과는 트립토판 중합효소 $\alpha$ 소단위체의 폴딩에 있어서 24번 잔기가 관여하고 있음을 제시하고 있다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제47권1호
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• pp.33-40
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• 2004

Ubiquitin 폴딩 반응의 초기에 나타나는 transient 폴딩 intermediate 상태의 열역학적인 특성을 연구하였다. 온도와 화학변성제의 농도를 바꾸어주면서 측정한 폴딩 kinetics의 결과로부터 unfolded 상태와 intermediate 상태의 평형상수 및 자유에너지를 quantitative kinetic modeling을 통하여서 구하였으며 또한 온도에 따른 자유에너지의 변화로부터 unfolded 상태에서 intermediate 상태로 전환될 때의 열역학적 함수인 ${\Delta}H,\;{\Delta}S,\;{\Delta}C_p$를 구하였다. Ubiquitin이 unfolded 상태에서 intermediate 상태가 될 때의 ${\Delta}C_p$는 unfolded 상태에서 native 상태로 되는 과정의 ${\Delta}C_p$의 약 80% 정도 되었다. 이것은 intermediate가 native 상태에 가까운 매우 조밀한 구조를 이루고 있는 ensemble state임을 나타낸다. 상온에서의 ${\Delta}H$는 양의 값을 보였다. 이는 ubiquitin의 unfolded 상태에서 소수성 잔기 주위에 위치한 물 분자의 규칙적인 구조가 intermediate 상태가 될 때 와해되기 때문이라고 여겨진다. 이러한 양의 enthalpy는 자유로워진 물 분자에 의한 전체 계의 entropy의 증가에 의하여서 보상되어 unfolded 상태에서intermediate 상태로의 전환은 음의 자유에너지를 갖게 되며 폴딩 반응의 초기에 관찰되는 것으로 여겨진다.

• 과학과기술
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• 제30권10호통권341호
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• pp.84-85
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• 1997

단백질이 합성된 후 어떻게 고유의 3차 구조를 형성하는가에 대하여 의문을 갖고 15년간 단백질폴딩연구를 계속하고 있는 대전 한국과학기술연구원 생명공학연구소의 책임연구원 유명희박사. 76년 서울대 미생물학과를 졸업한 후 미국에 유학하여 81년 버클리대학에서 박사학위를 받고 귀국한 유박사는 "앞으로 여성후학들이 공동연구로 더욱 좋은 환경 속에서 연구활동을 할 수 있는 분위기 조성을 위해 노력하겠다" 강조한다.

• Korean Chemical Engineering Research
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• 제47권5호
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• pp.624-629
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• 2009

분자진화방법을 이용하여 불용성 단백질을 가용성 단백질로 개량하고자 할 때 가장 중요한 과정은 발현 단백질의 세포 내 폴딩 및 용해도를 어떻게 측정하고 선별할 수 있는가에 있다. 본 연구에서는 ampicillin에 저항성을 가지는 beta-lactamase를 목적 단백질과 접합 형태로 발현하여 목적 단백질의 용해도를 측정 및 선별할 수 있는 방법을 구축하였다. 이를 위하여 먼저 beta-lactamase C-말단에 목적 단백질을 링커를 이용하여 접합단백질 형태로 발현시킬 수 있는 발현 시스템을 구축하였고, 구축된 발현시스템이 대장균의 ampicillin의 저항성을 향상시킴을 확인하였다. 구축된 발현시스템에 용해도가 비교적 높은 adenine deaminase와 aspartate aminotranseferase, 용해도가 매우 낮은 GlcNAc-2-epimerase 세가지 단백질의 유전자를 클로닝하여 Ampicillin 농도에 따라 목적 단백질의 용해도가 세포 성장에 미치는 영향을 조사하였다. Ampicillin 농도 $200{\mu}g/mL$에서 가용성 단백질인 adenine deaminase와 aspartate aminotranseferase의 접합 단백질 발현은 세포 성장을 보이는 반면, 불용성 단백질인 GlcNAc-2-epimerase 접합 단백질 발현은 세포 성장을 저해함을 확인하였다.

• KSBB Journal
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• 제21권2호
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• pp.118-122
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• 2006

본 연구에서는 연속확산식 무세포 단백질 발현 시스템을 이용한 이황화결합 함유 단백질의 생산 시, 발현된 단백질의 응집으로 인한 비활성화의 문제점이 분파샤페론을 통한 발현 단백질의 용해도 증가, 세포 파쇄액의 화학적 처리를 통한 환원활성 제거, 산화환원완충액을 이용한 적절한 산화환원전위의 제공 등을 통해 단백질의 폴딩에 유리한 반응조건을 구축함으로써 해결될 수 있음을 보였다. 이러한 연구 결과는 각종 게놈 시퀀싱 프로젝트의 빠른 진척에 따라 현재 요구되고 있는 고속, 고효율의 단백질 발현 수단으로써 무세포 단백질 발현 시스템이 적용될 수 있는 가능성을 높여 줄 수 있을 것으로 기대된다.

• 생명과학회지
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• 제26권4호
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• pp.490-495
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• 2016

Brefeldin A (BFA)는 Eupenicillium brefeldianum에서 분리한 lactone계열의 항생제이며 ER에서 Golgi로 단백질 이송/전달을 억제히는 기능이 있다. 따라서 BFA를 세포에 처리 시 Golgi 기능 장애와 ER에서 단백질의 폴딩/조립의 문제로 인하여 ER에 기능 장애가 발생하는데 이를 소포체 스트레스(ER stress)라고 한다. 본 연구에서는 정상 astrocyte 세포와 C6 glioma 세포에서의 BFA처리에 따라 ER stress marker 단백질인 CHOP 발현 차이를 확인하였다. BFA 처리 시 CHOP 발현이 정상 astrocyte 세포에서 C6 glioma 세포에 비해 현저히 낮은 발현을 확인하였다. 하지만 CHOP mRNA 발현에서는 astrocyte 세포에서 발현 됨을 RT-PCR로 확인하였다. C6 glioma 세포와 비교하여 astrocyte 세포에서 BFA유도의 CHOP 단백질 발현이 낮은 원인은 proteasome 활성이 높음으로 기인됨을 proteasome inhibitor 실험과 proteasome 활성 측정을 통하여 확인하였다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제46권4호
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• pp.305-310
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• 2003

Hydrophobic core가 변이된 유비퀴틴 단백질이 pH 2 용액에서 보이는 구조적인 특성을 여러 분광학적 방법으로 측정하였다. 낮은 pH값을 갖는 용액에서 이 변이 유비퀴틴의 intrinsic tryptophan fluorescence emission spectrum은 unfolded 상태보다 약간 blue shift되어 있고 또한 그 intensity도 상당히 낮게 나타났다. 이는 이 용액 조건에서 이 변이 유비퀴틴의 삼차구조가 약간 남아 있는 것을 의미한다. 같은 용액에서 이 변이 유비쥐틴의 far-UV circular dichroic spectrum은 native 상태나 unfolded 상태의 spectrum과 현저히 달랐으며 220 nm 에서의 molar ellipticity 값을 통하여 볼 때 pH 2인 용액에서 상당량의 이차구조를 지니고 있었다. 또한 같은 용액에서 이 변이 유비퀴틴은 hydrophobic dye인 8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid(ANS)외 fluorescence emission intensity를 증가시키고 fluorescence emission maximum이 짧은 파장에서 나타나게 하였다(blue shift). 이러한 현상은 pH 2 용액에서 이 변이 유비퀴틴의 hydrophobic core가 느슨하여져서 hydrophobic dye인 ANS가 결합할 수 있는 구조를 띠고 있음을 나타낸다. 이러한 분광학적인 관찰은 이 변이 유비귀틴이 pH 2인 용액에서 상당량의 이차구조를 지니고 있지만 hydrophobic core는 느슨하게 형성된 molten globule과 같은 형태를 지니고 있음을 나타낸다. 이 변이 유비퀴틴의 molten 히obule 형태는 단백질 폴딩 반응의 경로를 연구할 수 있는 좋은 모델이 될 수 있을 것으로 생각된다.