배추흰나비의 조직과 발생시기에 따른 발생 특이 큐티클단백질의 질적 분포를 조사하기 위해 전기영동법, western blotting 및 autoradiography 법을 사용하였다. SDS-PAGE에서 유충기에는 4개, 용기에는 3개의 단백질이 발생 특이 큐티클단백질로 확인되었다. 전기영동적 이동도로 보아 유충기의 62 Kd 큐티클단백질은 지방체 표피, 혈림프에 모두 분포하며. 22 Kd, 16 Kd 단백질은 지방체와 표피, 그리고 19 Kd 단백질은 지방체에서 확인되고 있으며, 용기의 37 Kd 단백질은 표피에서. 28 Kd, 27 Kd 단백질은 표피와 지방체에 분포하는 양상을 보이고 있다 면역학적 방법으로 발생 특이 큐티클단백질의 동질성을 조사한 결과 용기의 27 Kd 단백질은 표피와 지방체에서 반응을 나타내며, 유충기의 22 Kd 단백질은 단지 표피에서만 미약하게 이의 동질성을 보여주고 있다 즉, 27 Kd 단백질은 지방체 22 Kd 단백질은 표피에서 기원하고 있어 발생 특이 큐티클단백질의 합성부위는 한 조직에서 기원하는 것이 아니라 각기 상이한 조직으로 부터 생성되는 것으로 사료된다.
나비목과 파리목 곤충에 독성을 보이는 B. thuringiensis NT0423을 수용체로 하여 형질전환된 B. thuringiensis PT0529에서 원래 수용체가 생성하는 내독소 단백질과 도입된 CryIVD 및 CytA 단백질들간의 발현 특성을 분석하기 위하여, B. thuringiensis PT0529에서 내독소 단백질들간의 발현을 성장 과정에 따라 투과 전자 현미경 관찰 및 단백질 전기영동으로 분석하였다. 그 결과, B. thuringiensis PT0529에서 내독소 단백질의 발현은 원래의 수용체 내독소 단백질보다 도입된 CryIVD와 CytA가 먼저 합성되었으며, 그 발현량에 있어서도 높게 나타났다. 또한, B. thuringiensis PT0529에서 세가지 내독소 단백질은 그들 자신의 고유 형태로 잘 발현되었으나, 수용체인 B. thuringiensis NT0423의 내독소 단백질은 그 크기에 있어서 다소 작게 관찰되었다. 따라서 형질전환체 내에서 도입된 내독소 단백질 유전자의 발현은 수용체의 내독소 단백질 유전자 발현에 영향을 받지 않는 반면 외부 유전자의 도입으로 인하여 수용체가 생성하는 내독소 단백질은 그 발현에 있어서 간섭을 받는 것으로 나타났다.
Autographa californica 핵다각체병 바이러스(AcNPV)의 다각체 단백질과 Bacillus thuringiensis(Bt) cryIA(c) 내독소 단백질의 융합단백질을 생산하는 새로운 재조합 바이러스를 제작하고, 곤충세포주(Spodoptera frugiperda 9)에서 발현된 융합단백질의 특성을 분석하였다. Bt kurstaki HD-73의 cryIA(c) 내독소 단백질 유전자의 N-발단 AcNPV의 완전한 다각체 단백질 유전자의 앞쪽에 융합함에 의하여 또는 다닥체 단백질 유전자내의 제한효소 HindII부위에 삽입함에 의하여 다각체 단백질 유전자의 프로모터 조절하에 도입하였다. 이렇게 작성된 재조합 바이러스를 각각 Btrusl 또는 BtrusII라고 명명하였다. BtrusI은 분명히 단일 전사체를 보임에도 92kDa의 융합 단백질과 다각체 단백질의 두 단백질을 생산하였다. 또한 Btrusl에 의해 만들어진 융합 단백질은 다각체를 형성하지 않았다. 한편, BtrusII에 의해 감염된 곤충세포주에서는 33kDa의 다각체 단백질은 보이지 않았고 단지 융합 단백질만 생산하였으나 다각체는 형성하지 않았다. 따라서 Btrusl에 의해 생산된 융합 단백질의 독성을 조사하기 위하여, Btrusl으로 감염된 곤충세포주를 2령 누에(Bombyx mori)에 접종한 결과 융합 단백질에 의한 독성이 관찰되었다. 결론적으로 다각체 단백질과 Bt cryIA(c) 내독소 단백질에 의한 융합 단백질이 독성을 가지고 있음을 확인하였다.
두가지 쌀 품종(品種) 종자(種子)(S-201, IR-8)의 호분층을 주사(走査) 및 투과(透過) 전자현미경(電子顯微鏡)으로 관찰(觀察)하면 구형(球形)과 결정형(結晶形)의 단백질체(蛋白質體)가 있는 것으로 밝혀졌으며, 구형(球形) 단백질체(蛋白質體)는 세포질내(細胞質內)에 존재(存在)하고 결정형(結晶形) 단백질체(蛋白質體)는 액포내(液胞內)에서 관찰(觀察)되었다. 가상적(假想的)인 한발 스트레스로서 열자극 처리(處理)($40^{\circ}C$ 에서 4시간)는 호분층(糊粉層)내에 단백질체(蛋白質體) 수에서 정상적(正常的)인 대조구보다 $40{\sim}50%$ 감소(減少)되었다. 또한 호분층(糊粉層)에서 단백질체(蛋白質體) 수의 감소(減少)는 IR-8품종(品種)보다 S-201품종(品種)에서 더욱 현저(顯著)하게 관찰(觀察)되었다. 열자극 처리(處理)로서 단백질체(蛋白質體) 수의 감소(減少)는 S-201품종(品種)에서 결정형(結晶形) 단백질체(蛋白質體)를 둘러싸고 있는 tonoplast membrane의 손상(損傷)으로 밝혀졌으며, 이런 손상(損傷)은 IR-8품종(品種)에는 좀 덜하다는 것으로 나타났다. 즉 이것은 S-201품종(品種)이 IR-8품종(品種)보다 열 자극(刺戟)(한발 스트레스)에 더욱 민감(敏感)하다는 것으로 사료된다. 두 품종(品種)의 종자(種子) 내배유(內胚乳)에 녹말(綠末)이 가득찬 주사(走査) 전자현미경(電子顯微鏡) 사진(寫眞)은 녹말(綠末)이 내배유(內胚乳)의 중앙(中央)으로부터 사출(査出)되는 hexagonal rods로 구성(構成)되어 있다는 것을 나타낸다. 이러한 hexagonal rods는 rods부터 쉽게 분쇄될 수 있는 triangular sectors로 구성(構成)되어 있으며, 이 sectors들의 각 내부(內部)는 $2{\sim}8$개의 단위(單位)로 구성(構成)되어 있는 커다란 compound starch grains들이 들어 있다. 이것은 쌀 내배유세포(內胚乳細胞)에서 compound starch drains들의 매우 다양한 크기를 설명(說明)하고 있다.
상당히 성공적인 사람병원체인 결핵균을 Robert Koch가 발견한 이래, 결핵 방제의 상당한 진보에도 불구하고, 결핵의 발생은 현재까지 계속되어오고 있다(Tiruviluamala and Reichman 2002). 그러므로, 완전한 민감성과 특이성을 갖는 신속한 진단방법이 결핵과 결핵의 잠복감염을 진단하는데 요구되어지며(Tiruviluamala and Reichman 2002), 계속적으로 결핵균과 BCG의 유전체와 단백질체 연구를 통하여 결핵 방제수단이 발전되어질 것이다 (Jungblut et al. 1999). 본 연구는 PPD가 결핵을 진단하는 특이한 항원만으로 정확하게 조화를 이루고 있지 않다는 것을 보여주었으며, 그것의 역가는 결론적으로 생물학적으로 평가되어져야 하지만, PPD의 제조는 단백질체 분석 기법에 의해 분석되고 표준화될 수 있음을 보여주었다. 이를 통하여 결핵 피내진단의 일괄된 결과를 위해 PPD 사용 전에 이와같은 단백질체 분석기법을 적용할 수 있을 것으로 사료되며, 본 연구에서 밝혀진 특이 항원은 새로운 피내진단항원으로 적용될 수 있을 것으로 사료된다.
단백질체(Proteome)이란 말은 어원적으로 단백질(protein)에 전체란 뜻을 가진 어미(-body, -some)가 연결된 합성어로 주어진 순간에 세포나 조직이 발현하는 모든 단백질의 총체를 의미하고 이를 연구하는 학문은 Proteomics라 일컫는다. 2001년 2월 International Human Genome Project에 의해 human genome sequence가 밝혀짐으로써 유전체 연구는 일단락 완성되었지만, 염기서열만 가지고는 이 유전자 산물의 기능을 알 수 없었고, 이것이 전사되고 최종적으로 완벽한 모양이 갖추어진 단백질을 분석해야만 그 기능을 알 수 있었다. (중략)
Autographa californica 핵다각체병 바이러스(AcNPV)의 다각체 단백질과 초록색 형광 단백질의 융합단백질의 특성을 분석하였다. 초록색 형광 단백질 유전자는 AcNPV의 완전한 다각체 단백질 유전자의 앞쪽과 뒤쪽에 융합하여 다각체 단백질 유전자의 프로모터 조절하에 도입하였다. 이렇게 작성된 재조합 바이러스를 각각 Ac-GFPPOL 또는 Ac-POLGFP이라고 명명하였다. 이들 재조합 바이러스에 의해 감염된 곤충세포주에서는 56kDa의 융합단백질이 발현되었다. 한편, 흥미롭게도 재조합 바이러스 Ac-POLGFP에 의해 감염된 세포주에서는 초록색 형광이 핵내에서만 다각체 유사 granular particle 형태로 관찰되었다. 반면에 Ac-GFPPOP에 의해 감염된 세포도주에서는 대부분 핵내에 존재하였지만, 세포질과 핵 모두에서 초록색 형광을 관찰할 수 있었다. 그러나 발현된 융합단백질은 분명히 다각체단백질을 포함하고 있음에도 다각체는 형성하지 않았다. 이러한 결과들은 융합단백질에서 다각체단백질의 위치와 관련이 있는 것으로 보여진다.
담배거세미나방(Spodoptera litura: SI), 누에(Bombyx mori: Bm) 및 흰불나방(Hyphantria cunea : Hc)으로부터 분리된 핵다각체병 바이러스(nuclear polyhedrosis virus : NPV)의 다각체의 단백질의 특성과 그에 대한 alkaline protease의 영향을 SDS-PAGE 및 혈정학적 방법으로 분석했다. Alkaline protease를 부활화시킨 후 다가체 단백질을 SDS-PAGE한 결과, BmNPV의 경우 30kD, SINPV와 HcNPV는 31kD의 단일 major band 및 이것들의 종합체(polymer)인 57kD와 66kD의 minor band들이 관찰되었다. Alkaline protease의 부활화를 성략한 SI NPV 다각체를 알칼리 용액으로 시간 차이를 두고 처리한 후 SDS-PAGE한 결고, 알칼리 처리시간이 경과함에 따라서 alkaline protease활성에 의해 다각체 단백질이 일정한 pattern으로 저분자화됨이 뚜렷하였다. SINPV 와 BmNPV 다각체 단백질의 항체를 제조하여 SINPV, BmNPV및 HcNPV 다각체 단백질간의 혈정학적 상동성을 이중형역광산법과 Western blot으로 비교한 결과는 3종 모두에서 공통 antigenic determinants의 존재가 인정되었으며 major 다각체 단백질의 종합체 형성과 alkaline protease에 의한 분해를 확인했다.
식물과 동물 모두 단백질체 분석을 위해 계면활성제를 사용하여 단백질을 효과적으로 가용화 하는 것은 매우 중요하다. 여러 계면활성제 중 광분해성의 Azo는 MS 분석에 적합하며 단백질을 효과적으로 잘 가용화 하는 등의 여러 이점을 보여주었다. 그러나 대부분이 동물 단백질체 분석에 적용되어 있었으며 식물 단백질체 분석에의 적용은 미비하였다. 따라서 본 연구에서는 벼 잎의 단백질체 분석을 위한 계면활성제로 Azo를 사용하여 SDS와 비교 분석을 수행하였다. 비표지 단백질체 정량 분석, 단백질 기능 분석, 세포내 단백질체의 위치 확인 분석 및 KEGG 경로 분석을 수행하였으며, 그 결과 SDS와 비교하였을 때 Azo의 단백질 가용화 효율이 전혀 떨어지지 않음을 확인하였다. 이는 앞으로 벼 뿐만 아니라 식물단백질체 분석 시에 광분해성 계면활성제인 Azo의 적용 가능성이 무궁무진함을 의미 한다.
아스코르빈산(ascorbic acid, AsA)는 강력한 항산화 물질 및 환원제로서 식물에서 산화형 AsA인 dehydroascorbate(DHA)를 활성형인 환원형 AsA로 변환시키는 효소인 dehydroascorbate reductase (DHAR)에 의해 생성된다. 선행연구의 결과로서, 본 연구팀은 참깨의 모상근에서 분리한 DHAR 유전자를 이용하여 항시 발현하는 CaMV 35S 프로모터와 괴경 특이적으로 발현하는 patatin 프로모터의 조절하에 과발현 시킨 형질전환 감자를 개발하였다. 형질전환 감자 식물체들은 비형질전환체 보다 증가된 DHAR 활성과 AsA 함량을 보인 바 있다. 본 연구에서는 단백질체 분석을 통해서 형질전환 감자 식물체에서 DHAR 과발현에 의해 조절되는 단백질들을 조사하였다. 단백질체 분석의 결과로서, 형질전환 감자에서 도입된 DHAR 단백질과 다양한 항산화 관련 단백질들이 식물 생장시기 동안 증가 하였다. 본 연구의 결과로서, 도입된 유전자인 DHAR이 항산화 단백질들의 발현 증가를 통해 형질전환 식물체의 스트레스 내성 기작을 향상 시킬 수 있을 것으로 생각된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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