맥엽과 이를 이용한 항산화 조성물을 제조하여 이에 존재하는 nitrite scavenging효과와 이에 따른 발암원으로 부터의 보호 효과를 조사한 결과는 다음과 같다. 맥엽과 항산화 조성물 모두 수층에 비하여 메탄올층에서 아질산염 소거능이 2배 이상 높게 나타나 M-BL50의 0.01 mg/ml 농도에서 약 64.3%, M-AM 0.01 mg/ml 처리군이 이보다 약간 높은 68.3% 정도로 나타내었다. 마우스 단핵구 기원인RAW 264.7(macrophage, mouse)에 맥엽과 항산화 조성물의 수층과 메탄올층을 처리하고 세포 생존율을 측정한 결과 수층 처리군에 비해 메탄올층 처리군에서 모두 세포 생존율이 더 낮게 측정되었으며 모든 시료에서 농도의존적으로 세포 증식이 억제되었다. 특히, M-AM을 처리한 군의 경우 모든 농도에서 가장 낮은 세포 생존율을 나타내어 항산화물 첨가에 의해 세포 증식 억제 효과가 상승됨을 알 수 있었으며 $IC_{50}$ 수치 또한 메탄올층과 A-AM시료 처리군에서 현저히 낮은 수치를 나타내었다. 또한 세포 내 아질산염 소거능을 측정한 결과 역시 마찬가지로 맥엽 입자 크기에 따른 차이는 나타나지 않았으며 수층 처리군에 비해 메탄올층 처리군과 항산화물을 첨가한 군에서 모두 높은 소거능을 나타내어 맥엽 및 기타 항산화물을 섭취함으로써 체내에서의 니트로사민 생성을 억제시킬 수 있을 것으로 예상된다.
N-니트로사민은 이차 아민과 아질산이 산성조건 하에서 니트로소화 반응을 통해 생성되는 니트로소 화합물이다. 약 300여종이 존재하며, 그 중 90%가 동물실험을 통해 발암성이 있음이 확인되었다. 1987년 IARC에서 NDMA와 NDEA를 Group 2A로 지정하였고, NDPA, NDBA, NPYR, NPIP, NMOR을 Group 2B로 지정하였다. 본 연구에서는 N-니트로사민류의 생물학적 모니터링을 위하여 소변 중 N-니트로사민류의 분석법을 확립하였다. 소변시료는 고체상추출(Solid phase extraction, SPE)을 통하여 전처리 한 후, LC-(APCI)-MS/MS를 이용하여 정량분석 하였다. 확립된 분석법의 정확도는 85.8~110.2% 이었고, 정밀도는 1.1~10.5%로 나타났다. 검출한계는 0.0002 (NDBA) ~ 0.0793 (NDMA) ng/ml 이었고, 검량선 회귀식의 상관계수($r^2$)은 0.999 이상으로 우수한 직선성을 보여주었다. 실제 소변 중 N-니트로사민류의 평균 농도는 NDMA 2.645 mg/g creatinine, NDEA 0.067 mg/g creatinine, NMEA 0.009 mg/g creatinine, NDBA 0.011 mg/g creatinine, NPIP 0.271 mg/g creatinine, NPYR 0.413 mg/g creatinine 이고, NDPA와 NMOR은 검출되지 않았다. 추후 N-니트로사민류의 인체 노출량 평가 및 위해평가를 위한 기기분석방법으로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
천연식물소재 및 한약재 추출제재인 식물추출 혼합제재가 인체내에서 니코틴 분해능에 미치는 영향을 FRCFR5 세포주, Xenopus oocyte, 임상 실험을 통하여 검토하였다. 본 실험은 체내에 잔존하는 니코틴이 식물추출 홉합 제재에 의해 무독한 대사산물인 코티닌으로 분해량이 증가되고 동시에 NNK, NNN, NNA 등과 같은 폐암 유발물질인 니트로사민 유도체 생성 경로가 억제될 것이라는 가정을 전제로 실험을 수행하였다. 본 실험 결과에서 볼 수 있듯이 식물추출 혼합 제재에는 니코틴에서 코티닌으로 전환시키는 대사 활성물질이 함유되어 있다는 사실을 알 수 있으나, 실제로 어떤 유효성분들이 관여하는지 그리고 정확한 작용 기작을 규명하기 위해서는 더 많은 분석 및 생화학적 연구가 앞으로 수행되어야 할 것이다. 간세포에서 유래된 FRCFR5 세포주 실험 결과, 니코틴과 식물추출 혼합 제재가 첨가된 배지에서 니코틴과 물을 첨가한 배지보다 니코틴에서 코티닌으로 전환능력이 약 2∼3배 높게 나타났으며, 이러한 결과는 Xenopus oocyte에 직접 주사한 경우와 거의 비슷한 양상을 보였다. 임상실험 결과 식물추출 혼합 제재음료를 음용하고 담배를 피운 실험군이 물을 음용하고 담배를 피운 대조군에 비해 약 2배 정도 높은 코티닌 함량을 나타내었다. 이는 실험군의 소변 중에 계속적으로 다량의 코티닌이 배출되는 것을 의미하며, 식물추출 혼합 제재 섭취시 체내에 존재하는 니코틴이 코티닌으로 지속적이면서 효과적으로 전환되는 것을 말한다 이상의 생체 내·외 실험에서 알 수 있듯이 식물추출혼합물은 니코틴에서 코티닌 생성을 약 2배정도 증가 시키는 것을 알 수 있었다.
본 연구는 electron impact-gas chromatography/mass spectrometer (EI-GC/MS)를 이용하여 N-nitrosamines 분석하는 방법의 분리성, 정성 및 정량적 유효성을 평가하였다. 극미량의 검출을 위해 시료전처리는 자동고상추출과 질소농축과정을 거쳐 수행하였다. 표준시료를 전처리 없이 EI-GC/MS (SIM)와 EI-GC/MS/MS (MRM)를 이용하여 직접 분석한 결과, 두 방법 모두 유사한 감응도를 보였다. 반면, 전처리한 표준시료를 EI-GC/MS로 분석한 경우 불순물 피크에 의한 간섭영향에 의해 낮은 ng/L 수준의 정량은 어려운 것으로 나타났다. 8종의 N-nitrosamines에 대한 EI-GC/MS/MS 분석결과, 방법검출한계 및 정량한계는 각각 0.76~2.09 ng/L, 2.41~6.65 ng/L 수준으로 기존 분석방법에 비하여 낮게 나타났다. 첨가농도 10, 20, 100 ng/L에 대한 실험에서 정밀도(1.2~13.6%)와 정확도(80.4~121.8%) 모두 만족하였으며, 검량선의 직선성에 대한 결정계수($R^2$)도 0.999 이상이었다. 환경시료에 대한 대체표준물질(NDPA-$d_{14}$)의 회수율도 86.2~122.3%을 나타내어, 본 연구에서 평가된 방법으로 N-nitrosamines의 정밀분석이 가능함을 검증하였다.
전통 기호음료의 하나인 볶음보리 추출물을 사용하여 발암성 니트로사민의 직접적인 생성인자인 아질산염 소거작용을 검토하였는데, 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 볶음보리 추출물의 수율은 볶음온도와 볶음시간에 크게 영향을 받는 것으로 나타났다. $230^{\circ}C$에서 60분간 볶았을 때에 수율이 가장 많았으며, 이 때의 수율은 28.5%였다. 아질산염 소거작용은 pH 1.2, 3.0에서는 반응시간과 더불어 증가하였고, pH6.0에서는 2시간 까지는 증가하였으나, 그 이후부터는 큰 변화를 나타내지 않았다. 볶음보리 추출물의 아질산염 소거작용은 볶음온도와 시간에 영향을 받았으며, 수용성획분의 경우 $230^{\circ}C$에서 볶음 보리에서 가장 강한 것으로 나타났다. 수용성획분을 에탄올 침전획분과 에탄올 가용성획분으로 나눈 경우, 에탄올 가용성획분의 아질산염 소거작용이 가장 강한것으로 나타났다. 볶음보리 추출물과 디메칠아민의 아질산염 소거작용을 조사해 본 결과, 반응시간이 3시간 되었을 때 볶음보리 추출물에 의해서는 아질산염을 거의 100% 소거시켰으나, 디메칠아민은 30% 소거시켜, 발암성 니트로사민 생성억제에 볶음보리 추출물이 유효하다고 생각된다.
양파 추출물의 식품첨가소재로써 그 활용성을 평가하기 위하여 양파의 종류(붉은색, 흰색, 황색)와 추출용매(에틸아세테이트, 에탄올, 열수)에 따른 주요 화학성분과 아질산염 소거능을 분석하였다. 총 유기산과 총 유리당은 각각 건물당 $135.4{\sim}1,255.7mg%$ 및 $51.7{\sim}62.9%$ 범위였으며, 각 양파의 에틸아세테이트 및 열수 추출물이 에탄을 추출물보다 높았다. 총 페놀과 총 플라보노이드 함량은 각각 $9.3{\sim}$13.3% 및 $159.8{\sim}584.1mg%$ 범위였으며, 각 용매별 붉은색 양파의 추출물이 다른 추출물에 비하여 높게 나타났다. 아질산염 소거능은 낮은 pH 범위와 추출물 농도의 증가에 따라 높게 나타났는데, pH 1.2에서 붉은색 양파의 에탄을 및 열수 추출물 10 mg/mL 첨가는 약 55% 정도의 아질산염 소거작용을 나타내었으며, 다른 양파의 추출물에 비하여 2배 이상 높은 수치였다. 따라서 붉은 양파 추출물은 낮은 pH조건에서 아질산염을 소거하여 니트로사민 생성을 억제할 수 있는 천연식품소재로서 이용 가능할 것으로 판단된다.
본 연구는 흡연에 의해 체내로 유입된 독성 물질들로 유발될 수 있는 폐암을 비롯한 각종 질병 기전을 in vitro 상에서 재현한 실험적 모델을 이용하여 8개의 식물로부터 추출한 phyto-extract mixture의 작용에 의하여, 체내 니코틴이 니트로사민으로의 전환되는 대사효율과 NNK의 활성화에 미치는 효과를 분석한 것이다. 이를 위해 in vitro 상에서 phyto-extract mixture에 의한 니트로소모폴린의 생성 억제와 CYP효소 활성 억제를 분석하였다. Phyto-extract mixture에 의한 니코틴으로부터 니트로소모폴린이 생성되는 대사 억제능 실험 결과, phyto-extract mixture(75%)는 비타민 C(64%)와 가루녹차(37%) 보다 우수한 억제 효능을 나타내므로서, phyto-extract mixture는 니코틴으로 부터 유독한 중간 대사물질이 생성되는 경로를 효과적으로 억제시킬 수 있음을 알 수 있었다. 또한 간에서 NNK 활성화에 관여하는 CYP 효소들에 대한 phyto-extract mixture의 효소 활성 억제능 분석 결과, phyto-extract mixture이 가루녹차보다 NNK로부터 발암물질이 생성되는 경로를 효과적으로 억제시키는 것으로 분석되었다. 결론적으로 phyto-extract mixture는 흡연으로 체내에 유입된 니코틴이 NNK와 같은 강력한 발암 물질인 니트로사민 유도체로 전환되는 경로를 효과적으로 억제함으로써 암 발생율을 효과적으로 낮출 수 있는 기능성 첨가제 혹은 식 음료로 활용될 수 있음을 in vitro 실험으로 증명하였다.
본 연구를 통하여 담배 주류연에 포함되어 있는 HPHCs (Harmful and potentially harmful constituents) 중 7 개 그룹의 분석법을 확립하였다. 이 7 개 그룹에는 방향족 아민, 휘발성 유기화합물, 중금속, 담배특이니트로사민, 벤조[a]피렌, 암모니아, 카르보닐 그룹이 있다. 시험법 검증을 위하여 표준담배인 1R5F와 3R4F를 사용하여 분석법의 특이성, 직선성, 정성한계, 정량한계, 정확도, 정밀도 및 회수율을 확인하였다. 모든 상관계수(r2)는 0.995 이상 이였고 정성한계는 방향족 아민, 휘발성 유기화합물, 중금속, 담배특이 니트로사민, 벤조[a]피렌, 암모니아, 카르보닐 순으로 0.01-0.04 ng/cig, 0.01-0.16 μg/cig, 0.01-1.27 ng/cig, 0.06-0.28 ng/cig, 0.04 ng/cig, 0.08 μg/cig, 0.78-1.77 μg/cig으로 확인되었다. 또한 일간과 일내 상대표준편차는 모두 15% 이하였고, 회수율의 상대표준편차는 15% 이하, 회수율 범위는 79.2-117.5%로 나타났다. 이러한 결과들을 바탕으로 7 개 그룹에 대하여 확립된 시험법은 각각의 해당성분을 분석하기에 적합하다고 판단된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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