• 한국수정란이식학회지
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• 제16권3호
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• pp.203-211
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• 2001

성간별에 이용할 돼지 수정란을 체외수정 방법으로 생산하기 위하여 돼지 난소에서 채취한 난자를 NCSU 23 배지에서 eCG, hCG를 첨가한 상태에서 22시간, 첨가하지 않은 상태에서 22시간 체외성숙을 시킨 후 mTBM을 이용하여 여러가지 정자농도(5$\times$$10^4$, 2.5$\times$$10^{5}$ , 6.0$\times$$10^{5}$ 그리고 10.0$\times$$10^{5}$ )에 따라 6시간 수정시켰고, NCSU 23 배지에서 배양시켰다. 배양 후 44시간에 수정란의 분할률을 관찰하였고, 144시간에 배반포 형성율을 확인하였다. 성감별 방법은 체외수정으로 생산된 배반포를 돼지 Y-specific DNA primer를 이용하여 PCR 처리를 한 후 전기영동으로 491 bp에서 증폭된 band의 유무에 따라 암컷과 수컷의 성을 판정하였다. 1. 돼지 체외수정에서 정자농도 5$\times$$10^4$, 2.5$\times$$10^{5}$ , 6.0$\times$$10^{5}$ 및 10.0$\times$$10^{5}$ 에 따른 수정란 분할률은 각각 55.95, 67.88, 60.18, 47,60%이었다. 2. 정자농도 5$\times$$10^4$, 2.5$\times$$10^{5}$ , 6.0$\times$$10^{5}$ 에 따른 배반포 형성율은 각각 16.03, 22.40, 21.41, 12.37%이었다. 3. 31개의 체외수정으로 생산된 배반포에 대한 PCR을 이용한 성감별 결과는 18개가 수컷, 13개가 암컷으로서 각각 58.1%과 41.9%를 나타내었다. 이상의 결과로 보아 돼지의 체외수정으로 생산된 배반포에 대한 성감별시 PCR 기법이 신속하고 정확하게 성감별을 실시할 수 있는 방법으로 판단되었다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제13권4호
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• pp.353-362
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• 2009

GnRH는 국부적으로 난소에서 합성되며, 난소내 과립 및 황체세포에 직접적으로 작용하여 난소의 기능을 조절하는 것으로 알려져 있으며, 특히, GnRH는 난소내 과립-황체화 세포의 세포자연사를 유도하는 것으로 보고하고 있다. 그러나 GnRH에 의한 세포자연사가 FSH에 의해 회복될 수 있는지는 명확히 밝혀져 있지 않다. 따라서 본 실험에서 난자 채취시 획득한 사람 과립-황체화 세포를 배양한 후 5, 50, 100 ng/$m\ell$ GnRH와 1 IU/$m\ell$ FSH를 처리하고 세포의 세포자연사 여부와 분비된 progesterone$(P_4)$과 estradiol$(E_2)$ 양의 변화를 조사하였다. DNA 분절화 분석과 TUNEL 방법으로 세포자연사를 평가한 결과, GnRH는 농도 의존적으로 과립-황체화 세포의 세포자연사를 증가시켰고, 특히 100 ng/$m\ell$ GnRH을 처리한 군에서 유의한 차이를 보이며 세포자연사 비율이 증가하였다. 또한 GnRH에 의한 세포자연사의 증가는 FSH에 의해 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 화학발광면역 측정법을 이용하여 배양내 $P_4$와 $E_2$의 양을 측정한 결과, GnRH을 처리한 후 $E_2$의 양은 변화가 없었던 반면 $P_4$의 양은 감소하였다. 이러한 GnRH의 $P_4$ 합성 억제 효과는 세포자연사 결과 마찬가지로 FSH에 의해 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과는 체외수정 및 배아이식 시술시 사용되고 있는 GnRH 작용제가 난소의 기능을 억제시킬 수 있을 것으로 보이나, 다량으로 투여되는 FSH에 의해 회복될 수 있음을 보여주고 있다. 이러한 실험 결과는 난소에 대한 GnRH의 생리적 기전을 이해하고 향후 새로운 과배란 유도 방법을 개발하는데 필요한 기초 자료로 사용될 수 있을 것으로 사료된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제23권4호
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• pp.281-291
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• 1999

본 실험은 체외 생산된 한우 배반포기배에 적합한 동결 / 융해 방법을 찾고자 실시하였다. 체외배양 7일째에 생산된 배반포기배는 동해제 EFS40(40% ethylene glycol, 18% ficoll, 0.3 M sucrose 그리고 10% FBS가 첨가된 m-DPBS)과 embryo container인 EM grid (V-G) 또는 straw(V-S)를 이용해서 초자화 동결하였다. 동결과 융해는 두 방법 모두 2 단계로 실시하였으며, 처리시간은 V-G 방법이 2 분과 3분, V-S 방법이 3.5분과 10분 각각 소요되었다. 체외 생존능 평가는 융해 후 24시간째의 재팽창율과 48 시간째의 부화율로 조사하였다. 본 실험에서 얻어진 결과는 다음과 같다. 팽창 배반포기배를 이용하여 동결액 노출과 동결과정의 냉해가 배의 생존에 미치는 영향을 조사하였던 바, 융해 후 24시간째, 동결액 노출군 (100.0%)의 결과는 대조군 (100.0%)과 차이가 없었으며, 두 동결군 (V-G: 87.8%, V-S: 77.8%)의 생존율과 비교해 볼 때 유의하게 높았다 (P＜0.00l). 그러나, 융해 후 48시간째 각 처리군의 부화율을 조사하였던 바, V-G 군 (67.8%)은 V-S 군 (53.3%)보다 유의하게 높게 나타났으며 (P＜0.05), 동결액 노출군 (73.3%)과도 유의한 차이를 나타내지 않았다. 또한, 배발달단계 (초기, 팽창, 부화초기 배반포)와 동결에 사용된 embryo container(EM grid, straw)가 체외 생존율에 미치는 영향을 동시에 비교하였던 바, embryo container 에 상관없이 빠르게 발달된 배반포기배가 느리게 발달하는 난자군보다 유의하게 높은 생존율을 나타내었다 (초기 : 57.1, 24.4%; 팽창 : 84.7, 60.6%; 부화초기 : 91.7, 80.0%)(P＜0.001). 특히, 팽창 배반포기배와 부화초기 배반포기배에서, 융해 후 48시간째, V-G군(67.8, 95.0%)의 부화율이 V-S군(53.0, 65.0%)보다 유의하게 높게 나타나 동결시 EM grid 의 유용성을 확인할 수 있었다 (P＜0.05, P＜0.001). 따라서, 한우 배반포기배는 EM grid를 사용하는 초자화 동결방법으로 간편하면서도 효율적이고 성공적으로 동결보존 할 수 있다는 것을 알았다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제26권2호
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• pp.137-148
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• 1999

Purpose of the present study was to find the optimal ovulation induction medicine for the maturation and development of immature oocytes and culture media for 2-cell embryos in the mouse model. ICR female mouse aged 6 to 8 weeks, were stimulated with 5 IU PMSG injection. At 47 to 50 hour post-PMSG injection, ovaries were dissected out and oocytes-cumulus complexes were punctured. The oocyte-cumulus complexes were cultured in media containing various ovulation induction medicine, CC, HMG and Metrodin for 18 hours. Female ICR mice were stimulated with 5 IU PMSG and 48 hours later were injected 5 IU of hCG, then female and male mice were mated. At 48 hour post-hCG injection, oviducts were dissected out and 2-cell embryos were flushed. The 2-cell embryos were cultured in various media, Ham's F-10 media of milli-Q water $(3^{\circ})$, Ham's F-10 media of HPLC (high performance liquid chromatography, Baxter) water, Medicult media, HTF (human tubal fluid) media for 96 hours. The results were as follows. 1. When the oocytes-cumulus complexes were cultured in $10^{-9}{\mu}g/ml{\sim}10^{-8}{\mu}g/ml$ of CC, those were suppressed in meiotic maturation $(28.2{\sim}33.7%)$. Whereas the oocytes-cumulus complexes were cultured in $10^{-7}{\mu}g/ml{\sim}10^{-4}{\mu}g/ml$, these were not effected in meiotic maturation $(54.5{\sim}72.7%)$. 2. When the oocytes-cumulus complexes were cultured in $10^{-4}{\mu}g/ml{\sim}10^{-1}{\mu}g/ml$ of Metrodin, those were suppressed in meiotic maturation $(35.7{\sim}41.5%)$. Meanwhile the oocytes-cumulus complexes were cultured in $10^{-7}{\mu}g/ml{\sim}10^{-5}{\mu}g/ml$, those were not effected in meiotic maturation $(54.2{\sim}70.3%)$. 3. When the oocytes-cumulus complexes were cultured in $10^{-5}{\mu}g/ml{\sim}10^{-4}{\mu}g/ml$ of HMG, those were suppressed in meiotic maturation $(48.2{\sim}50.4%)$. As being cultured in $10^{-7}{\mu}g/ml{\sim}10^{-6}{\mu}g/ml$, increased in meiotic maturation $(75.8{\sim}80.7%)$. 4. When the 2-cell embryos were cultured in Ham's F-10 media of milli-Q water $(3^{\circ})$, Ham's F-10 media of HPLC (high performance liquid chromatograpy, Baxter) water, Medicult media, HTF (human tubal fluid) media, developmental rates to blastocyst and hatching for 96 hour were 50.0%, 45.2%, 71.5% and 95.6%, respectively.

• 한국수정란이식학회지
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• 제21권1호
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• pp.13-20
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• 2006

본 연구의 목적은 요를 통해 hFSH를 발현하는 형질 전환 소의 생산이다. 요의 분비와 관련 있는 유전자로서 mUII promoter를 사용하여 hFSH유전자를 구성했다. 태아섬유아세포(KbFF)는 임신 45일령의 태아(male)에서 채취하였다. hFSH gene은 pcDNA3(neo) vector와 같이 KbFF 세포에 electroporation 방법으로 transfection하였다. 유전자를 transfection한 세포는 G-418로 2주 동안 배양하였고, 선발된 colony는 PCR로 확인하였다. 핵이 제거된 난자는 hFSH가 transfection된 세포와 transfection 되지 않은(control) 세포를 이용하여 핵이식하였다. 48시 간 후 hFSH가 transfection된 세포는 68.7%의 수정란이 난할되었으며, 8일 후 15.7%의 수정란이 배반포로 발달하였다. 그러나 대조구에서는 67.6%가 난할되었으며, 24.5%가 배반포로 각각 발달하였다. 이들 배반포에서 apoptosis 분석 결과 hFSH 유전자가 transfection된 또는 transfection되지 않은 대조구에서 유의적인 차이는 보이지 않았다. 배반포는 53두의 수란우에 이식하여 두 마리의 산자가 생산되었으나(1.9%) hFSH가 transfection되지 않은 것으로 나타났다. 이 결과는 선발된 hFSH colony에서 transfection되지 않은 세포가 혼합되어 있었다는 것을 나타내 주고 있으며, colony의 선발과 검증에 더 많은 연구의 필요성이 있음을 나타내준다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제5권1호
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• pp.47-52
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• 2001

X, Y정자를 분리하여(sexing techlology)필요한 성을 조절한 배아의 연구가 아직 실용화되지 않고 있다 본 연구는 이에 대한 기초연구로서 돼지의 X 정자와 Y정자를 분리하기 위하여 불연속 percoll농도구배를 제조한 후 상층에 정액을 분주하여 120${\times}$g에서 20분간 원심분리 하였다. 분리된 각 층의 정자를 회수(7${\times}$10$^6$ sperms/ml)하여 genomic DNA를 추출한후, PCR 방법을 이용하여 Y 염색체의 성 결정 유전자(TDF)인 SRY(sex determining region of Y chromosome) 유무를 판단하였다. TCM-199배양액에 성숙시킨 난자와 분리하지 않은 정자를 대조군으로, 분리한 X 정자를 실험군으로 인공수정을 한 후 돼지 체외 수정란을 획득하였다. 체외 생산된 2세포기의 배아의 SRY 유전자를 PCR증폭하여 성 판별에 사용하였다. 불연속 percoll 원심분리 후 정자의 생존율은 95%층에서 94.4% ${\pm}$ 5.1% (P < 0.01)로써 가장 높았다. 체외수정한 결과 분리하지 않은 대조군(47.1%)보다 자성정자가 많다고 판단되는 실험군에서 수정율이 높았다(80%).불연속 percoll 원심분리 후 SRY유전자의 PCR을 실시한 결과 30%, 50%, 65%농도에서 80%, 95% 농도보다 Y 염색체 특이적인 밴드가 많이 증폭되는 것을 확인하여 상층에 Y 염색체를 가지는 웅성 정자가 많이 있으며 하층에 X 염색체를 가치는 자성정자가 많이 있는것으로 확인하였다. 또한 95% 농도 층의 정자를 인공수정한 초기배아의 자성은 66.7%로서 대조군 33.3%보다 높았다. 따라서 불연속 percoll 원심분리 후 80%, 95%층에서 X 정자가 많이 회수되고, 활동성이 증가하는 것뿐만 아니라 정자의 질도 개선할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

• 한국가축번식학회지
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• 제25권4호
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• pp.317-325
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• 2001

본 연구는 lipid peroxides를 생산하는 것으로 알려진 ascorbic acid (Asc; 0.5 mM)와 ferrous sulfate (Fe$^{2+}$; 1 mM)가 돼지 동결-융해 정자의 체외수정능력에 미치는 영향을 검토하였다. 그 결과, 동결정액의 융해 처리시 배양액내 Asc/Fe$^{2+}$ (38%)의 동시첨가시 대조구 (27%)에 비해 정자의 첨체반응이 유의적으로 높게 유기되었다 (P＜0.05). 정자침입율 또한 Asc/Fe$^{2+}$ (76%)를 동시에 첨가하므로서 대조구 (55%)에 비하여 유의적으로 높게 나타났다 (P＜0.05). 한편 정자의 peroxidation은 상기의 처리구에서 maiondialdehyde (MDA)의 생성에 기초를 두고 평가하였는데, 정자의 처리시 Asc/Fe$^{2+}$의 동시첨가에 의해 MDA의 생성이 증가하였으나 처리구 사이에서 유의적인 차이는 인정되지 않았다. 또한 sulfhydry1(-SH) group의 용량을 측정한 결과 Asc/Fe$^{2+}$를 동시에 첨가한 실험구에서 가장 높게 나타났으나 타처리구와의 사이에서 유의적인 차이는 인정되지 않았다. 또 다른 연구에서 동결-응해정자가 난자의 투명대에 접착하는 정도를 평가한 결과, 대조구와 Asc처리시 Fe$^{2+}$ 처리에 비하여 유의적으로 (P ＜ 0.05) 높은 정자의 접착을 나타냈으나 Asc/Fe$^{2+}$의 동시 처리에 의한 정자접착의 증가는 인정되지 않았다. 결과적으로 lipid peroxidation의 증가를 야기시키는 Asc/Fe$^{2+}$의 동시첨가는 투명대에서 정자의 접착능력을 증가시키지 않았음에도 불구하고 첨체반응과 침입능력을 향상시키는 것으로 나타났다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제25권1호
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• pp.87-92
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• 1998

본 연구는 생쥐 미수정란을 초자화 동결하였을 때, 체내/외 발달율에 미치는 영향을 연구하고자 실시하였다. 생쥐 미수정란은 30, 35, 40% ethylene glycol, 18% ficoll과 0.5 M sucrose가 함유된 M2 배양액으로 구성 된 EFS30, 35, 40을 이 용하여 초자화 동결되었다. 노출 또는 초자화 동결-융해 후, 형태학적으로 정상적인 미수정란은 $1-2\times10^6/ml$ 농도의 정자로 체외수정되었고, 수정 율과 체내/외 발달율 그리고 배 반포의 세포수 (inner cell mass 와 tropectoderm cell)가 조사되었다. 본 실험에서 얻어진 결과는 다음과 같다. 35%의 ethylene glycol이 함유된 EFS35에서 EFS30과 EFS40보다 높은 분할율을 나타냈다. 초자화 동결-융해 후 체외수정된 미수정란의 2-세포기까지의 발달을 (51.1%)은 동결없이 초자화 동결액에 노출만된 군 (60.0%)과 대조군 (68.2%)에 비해 유의하게 감소하였다 (p<0.05). 그러나 이들 처리군에 있어서 난할된 난자로 부터의 배반포기 배까지의 발달율에는 유의한 차가 없었다. (75.0, 73.3 과 80.0%). 또한 초자화 동결된 군의 배반포기배 세포수 $(92.5{\pm}2.9)$도 노출군 $(98.5{\pm}5.3)$, 대조군 $(100.9{\pm}4.8)$과 유사하였다. 초자화 동결-융해 하여 얻어진 배반포기배를 가임신 생쥐에 이식하였을 때 체내발달율인 산자발달율 (50.7%)과 착상율 (80.0%)도, 대조군 (58.2, 78.2%)과 유사하였다. 이러한 결과로 보아, 생쥐 미수정란은 ethylene glycol를 기본으로 한 EFS35라는 초자화 동결액을 이용하여 동결보존될 수 있음을 알 수 있었다.