보리는 높은 비율로 식이섬유를 함유하고 있어, 일반적으로 영양학적으로는 전곡 형태로의 섭취가 추천되고 있지만, 조직감과 소화율을 고려하여 발효물 형태의 소비가 바람직한 것으로 판단되고 있다. 본 연구는 효소당화 후, 효모 및 유산균 발효를 거쳐 조제한 보리발효물로부터 조다당 BF-CP를 분리하고, 대식세포에 대한 면역증강 효과 및 세포 내 신호전달을 규명하여 기능성 소재로의 이용방안을 모색하기 위해 계획되었다. BF-CP 획분의 일반화학적 특성을 분석한 결과 70.7% 글루코스 11.4% 자일로스 및 9.0% 아라비노스를 포함하여 91.1%의 중성당으로 이루어진 중성다당이었다. BF-CP는 RAW 264.7 대식세포주에서 농도의존적으로 IL-6, $TNF-{\alpha}$와 같은 사이토카인 및 NO의 생산능을 유도하는 등 높은 대식세포 활성능을 나타냈다. 또한 qPCR 분석을 통해, BF-CP 획분을 대식세포주에 처리하였을 때, 처리 농도에 비례하여 IL-6, $TNF-{\alpha}$ 및 iNOS의 mRNA 유전자 발현을 증가시킴을 확인할 수 있었다. 한편 Western blot을 활용한 신호전달 단백질 추적실험에서 BF-CP 획분을 대식세포주에 처리하였을 때, JNK, ERK 및 p38과 같은 MAPK 경로와 $NF-{\kappa}B$ 경로의 관련 단백질을 인산화시킴이 확인되었으며 그 활성은 BF-CP 농도에 의존적이었다. 이상의 결과로부터 보리발효물 유래 다당 BF-CP는 MAPK와 $NF-{\kappa}B$ 경로를 통해 대식세포를 활성화시키며, 이를 통하여 NO, IL-6 및 $TNF-{\alpha}$와 같은 면역활성화 관련 물질의 생산을 높은 비율로 유도시킨다는 것을 최종 확인할 수 있었다.
연구배경 : 대식세포 및 호중구에서 생산되는 superoxide는 외부에서 침입한 병원균을 죽이는 유익한 면이 있는 반면 자체 폐조직에 손상을 주어 폐손상을 일으키기도 한다. 임상에서 중요한 내독소에 의한 성인성호흡장애증후군등의 폐손상시 superoxide 등의 산소유리기가 중요역할을 하는 것으로 알려져 있으며 superoxide의 생산에는 칼슘이 중요한 조절기능을 담당한다. 내독소에 의한 급성폐손상의 경우 실험적으로 verapamil을 투여시 폐부종등의 증상이 완화되는 것이 알려져 있어 칼슘길항제인 verapamil의 산소유리기의 생산에 마치는 영향에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다. 그러나 지금까지 폐포대식세포에서 superoxide의 생산에 대한 내독소와 verapamil의 영향을 같이 관찰한 실험은 없었다. 방법 : 본 실험에서는 백서의 폐포대식세포에서 protein kinase C를 직접 자극하는 phorbol myristate acetate 자극에 의한 superoxide의 생산을 측정하고 내독소 및 verapamil이 superoxide의 생산에 미치는 영향을 관찰하고 내독소와 verapamil을 동시에 투여하여 내독소에 의해 대식세포가 활성화되어 superoxide의 생산이 증가하는 priming 효과에 verapamil이 어떠한 영향을 미치는 가를 관찰하였다. 결과 : 폐포대식세포를 PMA로 자극시 기저상태에 비해 3.15배의 superoxide가 생산되었으며 이는 세포외 칼슘의 유무와 전혀 무관하였다. 그리고 내독소 (E. coli 055-B5)로 1시간 전처치후 PMA로 자극시 superoxide의 생산은 0.1 ug/ml 에서 최대로 43% 증가하였다. 또한 verapamil은 대식세포에서 PMA 자극에 의한 superoxide의 생산을 억제하였으며 세포외 칼슘이 없는 상태에서도 억제효과는 나타나 verapamil의 억제효과가 칼슘의 세포내 이동을 차단하는 기전에 의한 것이 아님을 관찰하였다. 내독소에 의한 대식세포에서의 superoxide의 생산의 증가는 verapamil이 없는 경우 30%의 증가에서 verapamil을 같이 투여한 경우 13%의 증가로 유의하게 감소하였다. 이는 내독소에 의한 대식세포의 priming에 칼슘이 영향을 미친다는 간접증거가 된다고 사료된다. 결론 : 이상의 결과로 verapamil은 PMA 자극에 의한 대식세포의 superoxide의 생산을 억제하며 폐포대식세포에 대한 내독소의 priming 효과도 억제하여 이는 내독소에 의한 폐손상시 verapamil의 효과의 한 기전이 되리라 사료된다.
연구배경 : 결핵균은 facultative intracellular pathogen으로 대식세포에서 생존 번식할 수 있으며, 결핵균이 체내에서 제거되려면 대식세포와 T 임파구에 의한 효과적인 세포매개성 면역반응이 필요하다. 폐포대식세포에 의한 결핵균 살균은 크게 산소의존성 과정과 산소비의존성 과정으로 구분되는데 산소의존성과정은 NADPH oxidase에 의해 산소가 환원반응으로 과산화음이온을 생성하는 과정으로 시작된다. 저자들은 폐결핵환자의 경우 폐포대식세포의 산소유리기 생성의 이상으로 결핵균이 세포내 오래 생존 번식할 것으로 추정하여 폐결핵환자와 대조군에서 폐포대식세포와 말초혈액 단구세포를 분리하여 분비되는 과산화음이온의 양을 비교하여 보았다. 방법 : 대조군과 폐결핵환자에서 폐포대식세포와 말초혈액내 단구세포를 분리하여 기저상태 및 PMA로 자극한 후 분비되는 과산화음이온의 양을 ferricytochrome-C를 환원시켜 나타나는 발색반응을 이용하여 측정하였고, 단구세포의 경우 결핵환자의 혈청에 의해 어떤 변화를 보이는지 관찰하였다. 결과 : 1) 폐포대식세포에서 분비하는 과산화음이온은 폐결핵환자군와 대조군 사이에 차이가 없었고, PMA로 자극을 했을 때도 두군 사이에 차이가 없이 모두 유의한 증가를 보였다. 2) 말초혈액 단구세포에서 분비하는 과산화음이온은 폐결핵환자군과 대조군 사이에 차이가 없었지만, PMA로 자극을 했을 때 두군에서 모두 유의한 증가를 보였고 폐결핵환자군이 대조군에 비해 높았다. 한편 결핵환자 혈청으로 폐결핵환자군과 대조군의 말초혈액 단구세포를 자극했을 때도 두군에서 모두 유의하게 증가되었다. 결론 : 폐포대식세포와 말초혈액 단구세포에서 분비하는 과산화음이온의 양은 정상인과 폐결핵환자에서 차이가 없었다. 따라서 폐포대식세포에서의 과산화음이온 분비가 부족하여 결핵균이 폐포대식세포내에서 장기간 생존하는 것으로 생각되지 않으며, 오히려 결핵환자의 혈청내에는 말초혈액 단핵구의 과산화음이온 분비를 자극하는 물질이 있을 것으로 생각되나, 정상인 혈청이 과산화음이온 생성에 미치는 효과에 대한 비교 연구가 필요할 것으로 사료된다.
탄저 치사독소는 생쥐 대식세포 (RAW 264.7)의 유전자 발현에 많은 변화를 초래한다. 이들 변화를 초래하는 치사독소의 역할은 아직 확실하게 밝혀지지 ???았다. 본 연구에서는, 치사독소가 처리된 생쥐 대식세포의 단백질 프로파일을 이차원 전기영동으로 분석하였고, MALDI-TOF 질량분석기를 사용하여 해당 단백질의 질량을 측정하였다. 펩타이드 질량 분석 데이터는 ProFound 데이터베이스를 이용하여 동정하였다. 차별화되어 발현된 단백질 중에서 절단된 mitogen-activated protein kinase kinase (Mek1)와 glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD)가 치사독소 처리된 대식세포에서 각각 증가하였다. 치사독소를 처리하였을 경우, Mek1의 절단은 신호전달과정을 방해하고, 증가된 G6PD는 생성된 활성산소로부터 세포를 보호하는 역할을 하는 것으로 보인다. 단백질체 분석기술은 치사독소처리에 의한 생쥐 대식세포의 세포사멸 관련 단백질을 동정하는데 도움을 주어, 치사독소의 잠정적인 기질을 찾는데 유용할 것이다.
본 연구의 목적은 LPS로 자극된 RAW264.7 대식세포에서 Sapindus mukorossi 열매 추출물(SME)의 항산화 효능을 확인하는 것이다. 그 결과, SME가 LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 ROS 생성을 현저하게 감소시켰고 전염증성 단백질인 COX-2 및 iNOS의 발현을 억제하였다. 또한 SME는 HO-1 및 Nrf2 발현을 상향 조절하였고 Akt 및 GSK-3β의 인산화를 증가시켰다. 이러한 결과는 SME가 Nrf2/HO-1 신호전달 경로의 활성화를 통하여 산화적 스트레스를 완화시킬 수 있음을 시사한다.
본 연구에서는 우리밀로부터 대식세포 식작용 활성화시키는 물질을 탐색하는 과정에서 고분밀의 EA 추출물이 가장 높은 식작용 활성 증강효과를 보임을 알았고, EA 추출물을 정성한 후 순수 분리 정제하여 대식세포 활성 증강효과를 나타내는 단일 물질을 찾고자 하였다. TLC 방법을 이용하여 ASW와 고분밀의 EA 추출물을 정성한 결과 약 5개 정도의 band를 확인한 후, column chromatography를 이용하여 EA 추출물을 분획하였다. 1차 column chromatography만으로는 single fractionation이 어려워 분획물을 fraction A, B, C, D로 분류하여 식작용 활성 증강효과를 측정하였다. 대분류된 각 fraction의 식작용 활성 증강효과를 측정한 결과 고분밀의 fraction b가 대부분의 활성을 가진 분획으로 사료되었다. 2차 column chromatography를 통해 fraction b만응 분리 하였으며, 구조결정 실험과 동물실험을 추가로 시행하여 fraction b의 효과를 입증할 것이다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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