현미경을 이용한 자동화된 검사 공정에 있어서 무엇보다 중요한 과정은 초점조절이며, 피 측정물의 선명한 현미경 영상을 얻기 위한 빠르고 신뢰도가 높은 자동초점조절 방법들은 일련의 검사공정에 있어서 필수 불가결한 요소로 자리매김 하고 있다. 일반적으로 널리 사용되고 있는 수동형 자동초점조절 방법들은 측정물체 표면의 영상대비 정보를 이용하는 방법으로 구성이 비교적 간단하지만, 최대대비 위치를 찾기 위한 주사과정이 필요하므로 시간 소요가 크고, 시편에 대한 의존도가 높다는 단점이 있다.(중략)
공초점 자가 간섭 현미경은 측정 광학계에 복굴절 물질을 사용하여 반사된 빛에 대해 간섭 현상을 일으키는 것을 특징으로 한다. 이 간섭을 자가 간섭이라고 부르는데, 이는 시편의 한 점에서 반사되어 나온 빛이 간섭을 일으키기 때문에 붙여진 이름이다. 공초점 자가 간섭 현미경의 점 확산 함수는 종래의 공초점 현미경의 점 확산 함수와 자가 간섭의 곱으로 나타나며, 자가 간섭의 주기가 종래의 공초점 현미경의 점 확산 함수의 중심폭보다 작은 경우 점 확산 함수의 중심폭이 작아져서 수평 방향으로의 분해능이 향상되게 된다. 이러한 분해능 향상 정도를 측정하기 위하여 지름이 100nm 인 금으로 된 비드를 사용하였다. 측정된 결과는 전산모사한 결과와 잘 일치하며 공초점 자가 간섭 현미경에서 2배의 분해능 향상을 보여준다.
편광 방향이 단일 모드의 유지되는 광섬유와 파장이 780nm인 반도체 레이저를 사용하여 간결한 구조의 beam scanning 타입의 공초점 현미경을 구성하였다. 공초점 현미경은 세포내의 생명 현상을 보다 잘 이해 할 수 있는 장비이기 때문에 기존의 현미경으로는 연구할 수 없던 생명현상을 연구할 수 있도록 여러 가지 강력한 연구수단을 제공하고 있다 살아 움직이는 생명체를 관찰할 수 있는 공초점 현미경에서 중요한 것은 속도와 투과 깊이이고, 장기의 표면을 관찰하기 위해서는 크기가 작아야 한다. (중략)
편광 방향이 단일 모드로 유지되는 광섬유와 파장이 780nm인 반도체 레이저를 사용하여 간결한 구조의 beam scanning 타입의 비편광 공초점 현미경을 구성하였다. 일반적인 공초점 현미경은 세포내의 생명 현상을 보다 잘 이해 할 수 있는 장비이기 때문에 기존의 현미경으로는 연구할 수 없던 생명현상을 연구할 수 있도록 여러 가지 강력한 연구수단을 제공하고 있다. 살아 움직이는 생명체를 관찰할 수 있는 공초점 현미경에서 중요한 것은 속도와 투과 깊이이고, 장기의 표면을 관찰하기 위해서는 크기가 작아야 한다. (중략)
광 검출기 앞에 미세한 구멍을 대물렌즈의 켤레 초점면에 놓음으로써 초점에 정확하게 일치하는 빛만 검출하는 공초점 광학 현미경은 마이크로미터 이하의 불투명한 샘플 표면, 구조뿐만 아니라 투명한 샘플인 경우 절단 없이 선택적으로 단면을 관찰하는데 사용된다. 이런 장점 때문에 특정 원자나 분자에 인위적으로 염색 시킬 수 있는 형광물질을 사용하여 세포의 기관 구조나 세포 기관간의 활동을 3차원적으로 관찰하는 생물학연구에서도 공초점 광학 현미경이 사용된다. 본 논문에서는 공진 스캔 미러를 이용하여 공초점 광학 현미경을 구현 하고자 한다.
CD-Player에서 사용되고 있는 4분할 광검출기를 이용하여 작고 간단하며 표면 추적 효과를 가지는 공초점 현미경을 구성하였다. 구성한 공초점 현미경은 4분할 광검출기에서 검출되는 오차 신호의 거리에 따른 변화를 이용하였다. 초점 근처에서 민감하게 변하며 양극성인 성질을 가지는 오차 신호를 이용하여 표면 추적을 하지 않아도 정확한 높이 변화를 알 수 있는 표면 추적 효과를 얻었다. 또한 시료의 높이 차이가 크지 않을 경우 반사 신호를 통하여 재질의 차이까지 알 수가 있다. 구성한 공초점 현미경은 간단한 조작으로 반사 신호를 이용하여 영상을 구현할 수도 있어 두 방식으로 얻은 결과를 비교, 분석하였다.
공초점 현미경(confocal microscopy) 기술의 적용은 살아있는 세포를 고배율로 관찰하는 것을 가능하게 하였다. 알츠하이머나 파킨슨 질환 같은 퇴행성 뇌질환의 경우 뇌세포의 수상돌기의 형태학적 변화가 연관되어 있음이 알려져 있다. 따라서 공초점 현미경 영상으로부터 이러한 정보를 추출하는 방법에 대한 연구가 필요하다. 그러나 공초점 현미경 영상은 명암도 분포가 고르지 않고, 구조의 경계 부분의 번짐 현상 등으로 인해 구조 추출에 어려움을 겪고 있는 실정이다. 따라서 이러한 문제를 극복하고 관심 구조에 대한 특성을 추출할 수 있는 영상처리 기법이 필요하다. 본 논문에서는 뇌세포의 수상돌기 공초점 현미경 사진으로부터 구조정보를 추출하는 새로운 방법을 제안한다. 첫째, 미세 분기 구조의 경계를 향상시키는 비선형 확산 필터링을 적용한다. 둘째, 관심구조를 반복적 역치 선택 방법을 이용해 분할한다. 셋째, 분할된 구조의 분석을 위해 구조의 중심축과 경계선을 추출하기 위한 패스트 마칭 방법(Fast Marching Method)에 기반을 둔 골격화를 수행한다. 본 논문에서 제안된 방법은 기존의 방법들과는 달리 주변 잡음에 덜 민감하였으며 거친 경계선에 영향을 훨씬 적게 받음으로써 보다 정확하고 사실적인 중심축 추출 결과를 보였다.
본 연구에서는 레버 증폭 구조를 이용한 플렉서 기반의 나노 스테이지를 설계, 제작하였다. 제작된 나노 스테이지를 샘플 스테이지로 채용한 공초점현미경을 개발하였다. 2차원 이미징의 구현을 위해서, 기존의 공초점현미경은 레이저를 이미징 평면상에 스캐닝하는 방식으로 구현된다. 본 연구에서는 백 나노미터의 구동정밀도를 가지는 나노 스테이지 위에 놓인 샘플을 2차원으로 스캐닝하면서 2차원 이미지를 구현할 수 있는 공초점현미경을 개발하였다. 플렉서 기반의 나노 스테이지는 이중 판스프링, 변위증폭 레버, PZT 엑추에이터 그리고 변위 센서로 구성 되어 있다. 스테이지의 구동 성능 해석을 위해 상용 유한요소 해석 프로그램을 이용하였다. 현미경에 사용되는 광원은 적색광 레이저이며, 레이저는 여러 광학요소를 거쳐 샘플스테이지의 샘플에 입사되고, 반사된 빛은 광센서인 PMT(Photo Multiplying Tube)로 계측되게 된다. 계측된 빛의 크기를 이용하여서 2차원 이미징을 구현하였다. 개발된 공초점 현미경으로 생쥐 귀의 피부조직을 관찰하여 현미경의 이미징 성능을 검증하였다. 설계된 샘플 스테이지는 기존의 공초점 현미경의 기계적인 Beam 스캐너를 대신함으로써 현미경의 광경로 및 전체시스템을 간소화 하였다.
We demonstrate the operation of an apparatus that we call the laser scanning confocal microscopy. It is valuable tool of the investigations for imaging process. We measured the thin metal structure through the SCM manufacture. Confocal microscopy offers several advantages including shallow depth of field, elimination of out-of-focus glare, and the ability to collect serial optical sections from thick specimens than conventional optical microscope. This research is manufactured of scanning confocal microscopy and after measured of metal materials structure.
최근 3차원 세포 배양이 가능해 지면서 세포의 부피, 3차원 형태 등을 보다 정확하게 확인할 수 있게 되었다. 일반적으로 세포의 3차원 단층 정보는 공초점 현미경 또는 전자 현미경과 같은 특수한 현미경을 이용하여 관찰 해야 한다. 그러나 공초점 현미경은 일반 현미경에 비해 비용이 비싸며, 촬영 시간이 오래 걸린다. 따라서 일반적으로 사용되는 광학 현미경으로 세포의 3차원 형태복원을 하는 방법이 필요하다. 본 논문에서는 다초점 형광 영상을 기반으로 영상의 추정된 초점 값(focus estimator value)을 이용해 세포를 3차원으로 형태 복원하는 방법을 제안한다. 먼저 3차원으로 배양된 세포를 광학 현미경으로 초점을 변경 하면서 다초점 영상들을 촬영한다. 이후 영상에서 circular Hough transform을 이용하여 세포 군집의 대략적인 위치를 ROI(Region Of Interest)로 정한다. 획득한 ROI에 MSBF(Modified Sliding Band Filter)를 적용하여 ROI 내에 세포 군집의 외곽선을 추출하고, 추출된 외곽선을 기준으로 추정 초점 값을 구한다. 계산된 초점 값과 현미경의 NA(Numerical Aperture)을 이용하여 깊이를 고려한 세포 군집의 외곽선을 추출하고 추출된 외곽선을 통해 세포들을 3차원으로 형태 복원한다. 복원 결과는 세포 영상의 in-focus가 된 부분들을 하나로 합친 영상과 비교하여 검증한다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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