조직공학 기술은 in vitro와 in vivo에서 초기 세포 부착과 차후의 조직형성을 위해 3차원적인 지지체로서 다공성의 생분해성 담체의 사용이 필수적이다. 소장점막하조직(small intestinal submucosa, SIS)은 고유의 인장력과 생체적합성 때문에 생체물질로서 사용될 잠재력을 가지고 있는 콜라겐 조직이다. 근육유래 줄기세포는 배양조건에 따라 골세포, 연골세포, 및 근육세포 등으로 분화가 가능하다고 알려져 있다. 본 연구에서는 SIS를 함유한 락타이드-글리콜라이드 공중합체(PLGA) 다공성 지지체를 용매캐스팅/염추출법으로 제조하였고, 전자주사현미경 및 수은다공측정계를 이용하여 특성을 결정하였다 세포의 생존율과 성장률은 MTT(3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium-bromide) 분석 방법을 이용하였고 골로 분화된 세포를 알칼라인 포스파테이즈(ALP) 활성을 측정하여 확인하였다. SIS가 함유된 지지체와 SIS가 함유되지 않은 지지체를 면역결핍 쥐의 피하에 삽입하여 이들의 골형성 정도를 비교하여 보았다. 조직을 파라핀으로 고정시켜 슬라이드를 제조한 후 hematoxylin과 eosin, 트라이크롬 및 본쿠사 염색을 실시하였다. 천연/합성 하이브리드 담체로서의 SIS/PLGA 담체가 PLGA 단독으로 사용하였을 때와 비교하여 볼 때 골형성이 우수하였는데 이는 SIS 내에 함유하고 있는 여러 생체활성분자에 기인한 것으로 추측되었다.
조직공학적 지지체에서의 골수유래 간엽줄기세포의 점착과 성장에 있어서 세포 점착성 단백질과 폴리펩타이드와의 상호작용을 조사하였다. 세포 점착성 물질로 알려진 단백질이나 폴리펩타이드는 락타이드-글리콜라이드 공중합체인 PLGA 필름과 지지체에 흡착하여 코팅되었으며, 이에 골수유래 간엽줄기 세포의 점착과 성장 거동을 비교하였다. 이들 단백질과 폴리펩타이드는 콜라겐 IV형과 피브리노겐, 라미닌, 젤라틴, 피브로넥틴, 폴리(L-라이신)이 사용되었다. 이중 폴리(L-라이신)을 제외한 단백질과 폴리펩타이드는 PLGA 필름 표면에 거의 단층으로 덮어져 흡착되었으며, PLGA 필름과 지지체에서 골수유래 간엽줄기세포가 1일과 2일, 4일간 배양되었다. 세포의 점착과 성장 거동은 sulforhodamine B법으로 평가하였다. PLGA 필름과 지지체에 단백질이나 폴리펩타이드가 흡착되지 않은 표면보다는 흡착된 표면에서의 세포의 점착과 성장이 우수하였다.
국내 토양시료로부터 점액성 고분자물질을 생산하는 효모 균주를 분리 및 동정하여 Aureobasidium pullulans IMS-822라 명명하였다. A. pullulans IMS-822가 생산하는 외분비성 폴리머를 정제 및 동결 건조하여 구조분석을 수행하였다. HPLC를 이용한 구성당 성분분석에서 포도당 단일성분으로 구성되어 있음을 확인하였다. FT-IR을 이용한 구조분석에서는 890 $cm^{-1}$ 부근에서의 ${\beta}-configuration$을 확인하였으며, 3300 $cm^{-1}$ 부근으로 shift 된 완만한 -OH stretching은 폴리머를 구성하고 있는 분자 사이에 강한 수소결합이 작용하고 있는 것으로 추측되었다. $^{13}C-NMR$ 분석결과는 A. pullulans IMS-822가 생산하는 외분비형 다당류인 (1,3)-linked ${\beta}-D-glucosyl$ unit의 6개의 탄소, ${\delta}$ 105.05 ppm (C1), 75.82 ppm (C2), 86.62 ppm (C3), 70.61 ppm (C4), 78.13 ppm (C5), 63.22 ppm (C6) 및 ${\beta}-(1,3)D-glucosyl$ 잔기에 분기사슬 되어 있는 ${\delta}$ 72.11 ppm의 C-6의 signal을 확인할 수 있었다. A. pullulans IMS-822가 생산하는 ${\beta}-(1{\to}3)(1{\to}6)-glucan$의 알칼리 수용액(0.5%, w/v)에 24.0 ${\mu}M$의 Congo red 첨가하여 30분간 반응시킨 후 $400{\sim}700$ nm의 범위에서 최대흡수파장의 변화를 조사한 결과 NaOH의 농도가 증가함에 따라 최대흡수파장은 장파장으로 이동하여 498 nm에서 515 nm까지 이동하였다. 최대흡수파장은 0.4 M NaOH 농도에서 점차로 감소하여 506 nm 부근에서 안정화되는 것으로 나타남으로써 순차적 구조를 가지는 것으로 확인되었다.
적정 배양액의 선정, ITS의 첨가와 BSA의 농도조절 및 NaCl 농도의 조절을 통해 소 수정란의 무혈청, 체세포배제 배양체계를 확립하기 위하여 수행한 실험에서 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. 배양액으로 CRlaa, TALP 및 SOF를 사용하여 발육률을 검토한 결과, 발육률의 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 2. 배양액내의 고분자물질원으로 BSA, FBS 및 PVA를 첨가하여 사용한 결과 BSA 및 FBS 첨가군이 PVA 첨가군보다 유의적으로 높은 발육률을 나타내었다(p〈0.01). 3. 배양액내의 BSA 농도를 달리 하면서(1, 3, 8 mg/ml) 1% ITS를 첨가하여 실험한 결과 BSA의 농도가 증가할수록 후기배로의 발육률이 높았으며 모든 군에서 ITS 첨가군이 후기배로의 발육률이 높았으나 BSA가 1 mg/ml로 첨가된 군에서만 ITS 첨가에 따른 유의적인 차이가 인정되었다(p〈0.05). 4. 배양액내의 N3Cl 농도를 114 mM과 90 mM 로 나누어 소 수정란을 배양한 결과 90 mM 군의 후기배로의 발육률이 114 mM 군에 비해 유의적으로 높게 나타났다(p〈0.05).
폐수를 재이용하기 위한 고도처리 시스템으로서 분리막 생물반응조(Membrane Bioreactor, MBR)는 기존의 활성슬러지 공정(Activated Sludge Process, ASP)에 비하여 많은 장점을 가지고 있다. 도시 하수 중에 포함된 유기물과 영양염류를 동시에 제거하기 위하여 침지형 정밀여과(Microfiltration, MF) 막을 이용한 무산소/호기(Anoxic/Oxic, A/O)형 MBR에서 투과플럭스를 $10.2L/m^2{\cdot}h$로 일정하게 유지하면서 고형물 체류시간(Solids Retention Time, SRT) 변화에 따른 막 여과 특성을 조사하였다. 실험 결과, SRT를 증가시킬수록 체외고분자물질(Extracellular Polymeric Substances, EPS)내 단백질/탄수화물(Protein/Carbohydrate, P/C) 비가 높아져서 막 오염이 빠르게 진행되었다. A/O MBR에 RO막을 결합한 A/O MBR-RO 공정을 폐수의 고도처리에 적용하고자 하였으며, 성능평가를 위해 A/O MBR-RO 공정과 기존의 활성슬러지 공정에 MF와 RO막을 결합한 ASP-MF-RO 공정의 유기물 및 영양염류 제거율을 비교하였다. 실험 결과 A/O MBR-RO 공정이 ASP-MF-RO 공정보다 더 우수한 처리효율을 나타내었다.
약 60-$130^{\circ}C$의 온도범위에서 cholesteric 반사색깔을 나타내는 새로운 히드록시프로필셀룰로오스 (HPC)와 에스테르화도 (DE)가 1-3 범위의 값을 갖는 HPC의 아크릴산 에스테르들 (ESs)을 제조하였다. 또한 DE가 2 이상인 ESs가 $50^{\circ}C$에서 나타내는 열방성 cholesteric 상에 UV광을 조사시킴에 의해 광학 pitch ($\lambda_m$)가 전 가시광 파장영역에 존재하는 ES 가교필름들을 제조하였다. 미가교와 가교시료들에 대한 열 및 광학 특성과 아세톤 중에서의 가교필름의 팽윤거동을 검토 하였다. HPC 자체와 동일하게 ESs의 $\lambda_m$은 온도가 증가함에 따라 증가하였다. 그러나 동일한 온도에서 나타내는 $\lambda_m$은 ES가 HPC에 비해 크며 ES의 $\lambda_m$은 DE가 증가함에 따라 감소하였다. 가교시료들의 $\lambda_m$의 온도의존성은 ESs에 비해 대단히 약하였다. 또한, ESs는 DE가 증가함에 따라 낮은 액정상에서 등방상의 액체로의 전이온도를 나타내는 것과는 판이하게, 가교물질들은 액체상으로의 전이를 일으키지 않으며 약 $210^{\circ}C$에서 분해가 일어나는 것으로 나타났다. 가교필름들은 이방성 팽윤을 나타내었으며, 이러한 사실은 ES분자들간에 2차원적인 가교가 우선적으로 일어남을 시사한다.
소장점막하조직은 콜라젠과 글리코스아미노글리칸 및 세포활성을 촉진하는 성장인자들로 구성되어 있다. 최근에는 이종이식의 면역 거부반응이 없는 생체물질로서 응용되고 있고 SIS에 함유되어 있는 성장인자는 전층 피부손상층을 치료하는데 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 우리는 본래의 SIS 쉬트와 아세트산으로 처리하여 팽윤시킨 SIS 쉬트를 제조하였고, 각각에 대해 1겹과 5겹의 SIS 쉬트를 제조하였다. 이를 SEM을 통해 표면 및 단면의 형태를 확인하였고, 증류수, 인산염 완충액, HBSS (Hank's balanced salt solution)완충액, 트리스 완충액, HEPES (N-[2-hydroxyethyl) piperazine-N'-(2-ethanesulfonic acid]) 완충액에서의 물 흡수성, pH에 따른 물 흡수성 그리고 시간에 따른 물 흡수성을 비교 실험하였다. 본래의 SIS 쉬트보다 산 처리된 SIS 쉬트가, 증류수보다는 완충액에서의 물 흡수성이 높음을 확인하였다. 중성 용액보다 산성과 염기성 용액에서 SIS 쉬트는 팽윤되어 더 많은 물을 흡수하였다. 또한, 증류수와 HEPES 완충액에서 시간에 따른 물 흡수성 실험을 한 결과 1일 이후부터 10일 동안 약 200%물을 지속적으로 흡수하였다. 이로써 SIS 쉬트와 산 처리된 SIS 쉬트가 창상 치료를 위한 드레싱제와 생분해성이식 재료로서 사용가능하리라 판단된다.
슈반세포는 강력한 말초신경 재생 효과를 가지고 있다. 그리고 신경 유도관으로 사용된 소장점막하조직(small intestinal submucosa, SIS)은 세포활성을 촉진하는 여러 가지 성장인자를 다량 함유하고 있고 이종이식의 면역 거부반응이 없는 생체물질로서 널리 사용되고 있다. 슈반세포는 Fischer 쥐의 좌골신경으로부터 분리하였고, 순수 배양된 슈반세포를 $2{\times}10^6$ 세포로 계산하여 SIS 스폰지에 파종하였다. 그리고 Fischer 쥐의 좌골신경 5 mm를 제거하여 신경과 제조된 스폰지를 연결하는 신경 외막 봉합을 실시하였다. 그런 후 1, 2주 및 4주 후 재생된 신경을 적출 한 후, H &E 염색과 S-100, GFAP 및 NF 면역조직화학염색을 실시하였다. 그 결과, SIS 스폰지와 슈반세포를 함께 이식한 군(Group II)은 아무것도 이식하지 않은 군(Control II)과 SIS 스폰지만 이식한 군(Group I) 보다 뚜렷한 양성반응을 보였고 손상을 받지 않은 군(Control I)과 별차이가 없는 양상을 보여주었다. 이는 SIS 스폰지와 슈반세포를 함께 이식했을 때 손상된 조직공학적 말초 신경 재생에 중요한 역할을 한 것으로 사료된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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