고등어 (Scomber japonicus Houttuyn)는 농어목 고등어과에 속하는 어류로 우리나라 전 연근해와 일본, 중국연해 및 미국 캘리포니아 연안 등의 태평양에 주로 분포한다 (Yamada et al., 1986). 우리나라에서의 고등어는 주로 대형선망어업에 의하여 주로 어획되고 있으며, 1970년대부터 1995년까지 연간 10∼20만톤이 어획되던 고등어는 1996년에 약 42만톤까지 어획되었다가 1998년과 1999년에는 다시 17,18만톤 수준으로 감소되었다. 따라서 본 연구에서는 고등어의 자원생물학 기초자료를 제시하기 위해 재생산에 관련된 내용을 분석하였다. (중략)
전보(Pyeun 등, 1991)에 이어 복상어의 췌장에서 정제한 trypsin과 고등어 유문수에서 정제한 trypsin A 및 trypsin B에 대하여 그 효소적 특성을 비교 검토한 내용을 요약하면 다음과 같다. 1. $30^{\circ}C,\;45^{\circ}C,\;45^{\circ}C$ 및 $60^{\circ}C$의 각 온도 조건에서 효소의 안정성을 검토한 결과, 복상어의 trypsin이 고등어의 두 trypsin보다 안정하였으며, 고등어 trypsin A는 가장 불안정하였다. $55^{\circ}C$에서의 변성속도정수는 복상어 trypsin이 $10.68\times10^{-4}\;sec^{-1}$, 고등어 trypsin A는 $47.18\times10^{-4}\;sec^{-1}$, 그리고 고등어 trypsin B는 $34.06\times10^{-4}\;sec^{-1}$로서 고등어 trypsin A의 변성속도가 가장 빨랐다. 활성화에너지는 복상어 trypsin이 4.07 kcal/mole, 고등어 trypsin A는 11.61kcal/mole, 그리고 고등어 trypsin B는 8.43kcal/mole이었다. 2. Km정수는 복상어 trypsin이 248.59uM, 고등어 trypsin A는 53.7uM, 그리고 고등어 trypsin B는 $96.50\mu M$이었다. 3. Dixon식에서 구한 저해제 TLCK에 대한 저해제 정수는 복상어 trypsin이 $1.50\times10^{-6}M$,고등어 trypsin A는 2$2.86\times10^{-6}M$, 그리고 고등어 trypsin B는 $3.90\times10^{-6}M$였으며, 저해제 DFP에 대한 저해제 정수는 복상어 trypsin이 $9.28\times10^{-6}M$ 고등어 trypsin A는 $2.11\times10^{-4}M$, 그리고 고등어 trypsin B는 $1.60\times10^{-4}M$이었다. 4. 복상어와 고등어 trypsin의 효소적 특성의 두드러진 차이는 pH와 온도에 대해서 복상어의 trypsin은 고등어의 두 trypsin보다 알칼리성측과 고온에 대해 안정하였으며, 저해제에 의하여서는 복상어 trypsin이 보다 예민하게 나타났다. 또한 BA-p-NA 합성기질에 대한 친화성에 있어서는 고등어의 두 trypsin이 복상어의 trypsin보다 높은 것을 알 수 있었다. 5. 아미노산 조성은 세 효소 모두 비슷하였으나, 고등어 trypsin B의 경우 arginine의 함량이 높은 특징을 보였다. 산성아미노산과 염기성아미노산의 비는 복상어 trypsin이 3.57, 고등어 trypsin A는 3.36, 그리고 고등어 trypsin B는 2.23이었다.
본 연구에서는 수산가공품 중 고등어 어육을 신속하게 검출하기 위하여 고등어 어육 중 열 안정-수용성 단백질에 특이한 단클론성 항체(3A5-2)를 이용하여 indirect ELISA 법을 개발하였다. Indirect ELISA을 개발하기에 앞서 먼저 시료 전처리는 이전 연구의 결과를 바탕으로 진행되었다. 이전 연구에서는 3A5-2 항체가 37 kDa 부근의 열 안정-수용성 단백질과 반응하였고, 0.05 M carbonate buffer로 추출하였을 때 흡광도가 가장 두드러지게 증가한 것을 확인하였다. 따라서 indirect ELISA의 시료 전처리는 0.05 M carbonate buffer를 이용한 열처리 추출법으로 추출한 후 0.05 M PBS로 희석하는 것으로 확립하였고, indirect ELISA 법을 최적화하였다. 개발된 indirect ELISA법에 실험실에서 임의로 열처리한 고등어 샘플을 적용한 결과 indirect ELISA법은 0.001% (0% 흡광도 표준편차 양의 값: $0.0003{\times}3$)의 검출한계를 확인하였으며, 꽁치 중 고등어는 0.002%(0% 흡광도 표준편차 양의 값: $0.0006{\times}3$)까지 검출이 가능하였다. 또한 조리($100^{\circ}C$, 30분)와 멸균($121^{\circ}C$, 30분) 처리된 고등어의 검출이 가능한 것으로 확인되었고, 멸균된 제품에서도 고등어에 특이적으로 반응하여 고등어의 혼입여부 판별도 가능한 것으로 판단되었다. 시판되는 고등어 가공품에 대해서는 양성결과를 나타내었고 다른 수산물에서는 음성으로 판단되어 개발된 분석법은 가공품에 혼입될 수 있는 알레르겐인 고등어를 보다 신속하고 민감하게 분석할 수 있고, 점차 가격이 증가하고 있는 고등어의 혼입여부를 확인할 수 있는 분석 도구로서 활용이 가능할 것으로 판단된다.
기존에 생선 검출을 위한 ELISA 개발은 여러 편 보고된 바 있으나, 고등어만을 특이적으로 검출하는 방법에 관한 보고는 거의 없었다. 본 연구에서는 고등어 parvalbumin에 대한 토끼 항체를 이용하여 가공식품 중 고등어의 검출을 위한 ELISA를 개발 하였다. 암모늄침전법과 Sephadex G-50 column chromatography를 이용하여 열에 안정한 12 kDa의 고등어 parvalbumin을 분리, 정제하였다. 여기에서 얻어진 parvalbumin을 토끼에게 면역하여 생산한 항 parvalbumin 항체 및 특이항체-HRP 복합물을 이용하여 샌드위치 ELISA(sELISA)의 조건을 확립하였다. 이때 parvalbumin 의 검출한계는 3 ng/mL이고, 고등어(생살)의 검출범위는 5-5,000 ${mu}g/mL$이었다. 이어서. 광어, 우럭, 오징어, 꽃게, 꽁치, 대구, 새우, 연어, 바다가재, 고등어에 대한 교차반응을 조사한 결과 고등어에 대한 반응성은 월등히 높았으나 다른 수산식품에서는 반응성이 거의 없거나 매우 낮게 나타나 고등어에 대한 특이성이 매우 높은 항체임을 알 수 있었다. 또한 분석시 시료의 열 안정성은 $100^{\circ}C$까지 양호하였으며 크림스프, 이유식, 소시지, 소스에 대한 spike test(0.01-0.3%)에서 분석회수율은 각각 104, 101, 54, 0%로 나타났다. sELISA에 의하여 16점의 시판시료 중 고등어의 함유 유무를 조사한 결과, 정성적으로 표시와 일치하는 것은 75%이었다. 그러므로 본 연구에서 개발한 sELISA는 일부 한계가 있기는 하지만, 가공식품 중 고등어를 정성적으로 검출하는데는 효과적으로 활용할 수 있을 것이다.
거문도 해풍쑥 추출물을 처리한 고등어의 저장 기간 동안의 품질 특성을 조사하였다. 5% 해풍쑥 추출물에 고등어를 2시간, 3시간, 4시간 처리한 후 개별 포장하여 $-20^{\circ}C$에 저장하여 실험하였다. 해풍쑥 추출물을 처리하지 않은 고등어(control)와 해풍쑥에 2, 3, 4시간씩 처리한 고등어의 염도는 2시간 처리한 고등어가 0.07%로 가장 낮은 수치를 나타냈다. pH는 모두 5.90~6.23를 나타냈고 산도는 15일째 감소 후 증가하는 경향을 나타냈다. 또한, 저장기간이 길수록 인장강도는 control은 증가하고, 2, 3, 4시간씩 처리한 고등어는 감소하였다. Volatile basic nitrogen(VBN) 함량은 control은 4.2~50.7 mg%, 2시간 처리한 고등어는 5.6~15.4 mg%로 control보다 가장 낮은 수치를 나타냈다. 2시간 처리한 고등어 제품에서 total polyphenol, total flavonoid 함량은 286.3~497.0 mg GAE/100 g, 177.5~385.6 mg QE/100 g를 나타냈다. DPPH, ABTS radical scavenging activity은 2시간 처리한 고등어 제품에서 50.6%, 61.3%를 각각 나타냈다. 전반적으로, 고등어를 SWM으로 단시간 처리하면 염도, pH, 산도, 경도, 항산화 활성 및 저장기간 연장과 같은 품질특성이 크게 향상되었음을 알 수 있다.
영양생리적 기능이 우수하며, 식품위생적인 면으로도 안전하여 소비자들의 기호에 맞는 반염건고등어를 제조한 다음, 이의 효율적 이용을 위해 저온저장 중 품질안정성에 대하여 검토하였다. 제조직 후 반염건고등어의 수분함량은 $59.4{\sim}62.4%$의 범위였으나 저온저장 중 전제품이 약간씩 감소하였다. 저장 중 생균수는 저장 5일 초기의 경우 탈수방법의 차이에 관계없이 거의 변화가 없거나 약간 감소하였으나 저장 중기 이후에는 계속 증가를 하였고, 그 증가폭에 있어서는 거의 차이가 없었다. Histamine 함량의 경우 전제품 모두 제조직 후 $2.5{\sim}3.6mg/100g$의 범위였고, 저장 15일째에도 $3.6{\sim}4.1mg/100g$을 수준으로 histamine의 식중독 한계선인 100mg/100g에는 훨씬 못미치는 함량이었다. 저장 중 반염건고등어의 과산화물값, 혼합지방산 조성 및 갈변도 변화의 결과로 미루어 탈수시트로 탈수하여 제조한 반염건고등어가 재래식 건조법에 의하여 제조한 반염건고등어보다 저장 중 지질산화가 억제되었다. 저장일수가 경과할수록 염용성질소의 용해도는 감소하였고, 그 감소폭은 탈수시트로 제조한 반염건고등어가 전통적인 방법으로 제조한 것보다 적었다. 텍스튜어의 경우 제조방법에 관계없이 저장일수가 경과할수록 경도는 감소하는 경향을, 응집력은 거의 변화가 없거나 증가하는 경향을 나타내었고, 이등의 값은 탈수시트로 제조한 반염건고등어가 재래식건조법에 의하여 제조한 반염건고등어보다 높았다. 이화학적 검사 및 관능검사의 결과로 미루어 볼 때 탈수시트로 제조한 반염건고등어가 재래식방법으로 제조한 것보다 품질유지기간이 긴 것으로 판명되었다.
본 연구에서는 건조 고등어 추출물 및 분획물들에 의한 nitric oxide 생성에 미치는 영향을 살펴보았고 건조 고등어 85% aq. MeOH 분획물을 중심으로 면역과정의 생물학적 작용과 대사적 변화를 유도하는 IL-6, IFN-${\gamma}$ 및 TNF-${\alpha}$ 같은 pro-inflammatory 사이토카인의 생성을 측정하여 건조 고등어 추출물에 의한 항염증 효과에 대하여 검토하였다. 건조 고등어 추출물과 각 분획물은 control보다 낮은 nitric oxide 생성량을 나타내었으며, 특히 85% aq. MeOH 및 n-hexane 분획물에 의한 저해효과가 높았다. 건조 고등어 분획물은 Con-A 보다는 LPS에 의해 자극된 IL-6, TNF-${\alpha}$ 및 IFN-${\gamma}$의 생성을 감소시키는데 더 효과적이었다. IL-6 및 TNF-${\alpha}$의 생성은 배양시간 6시간 후 건조 고등어 85% aq. MeOH 분획물의 모든 첨가농도(1, 3 및 $10{\mu}g$)에서 감소되었다(p<0.05). IFN-${\gamma}$의 경우, 건조 고등어 85% aq. MeOH 분획물을 LPS와 함께 처리했을 때 특히 72시간 배양 시 IFN-${\gamma}$의 생성량이 농도 의존적으로 감소하였고 Con-A에 의해 자극된 IFN-${\gamma}$의 생성량은 6 및 24시간 배양 후 유의적으로 감소하였다(p<0.05). 이상의 결과로부터 건조 고등어 85% aq. MeOH 분획물은 nitric oxide 생성과 pro-inflammatory 사이토카인(IL-6, TNF-${\alpha}$, and IFN-${\gamma}$)을 감소시켜 염증반응을 예방할 것으로 기대된다.
혈합육어 중 연근해 온대산 멸치의 내장과 고등어의 유문수, 그리고 원양 열대산 황다랭이 및 날개다랭이의 유문수를 각각 시료로 하여 trypsin을 분리 정제하였으며, 그 분자량과 아미노산 조성 및 효소의 반응 최적조건에 관하여 비교 분석하였다. 실험결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 멸치의 내장과 고등어, 황다랭이 및 날개다랭이의 유문수에서 각각 황산암모늄염석, benzamidine-Sepharose 6B 친화성 크로마토그래피, DEAE-Sephadex A-50 크로마토그래피, Sephadex G-75 겔 여과 크로마토그래피 등의 방법을 혼용하여 고등어로부터는 2종의 trypsin (고등어 trypsin A와 고등어 trypsin B로 명명함)을, 그리고 다른 어류로부터는 각각 1종의 trypsin을 분리 정제하였다. 2. 멸치 trypsin과 고등어 trypsin B는 고등어 trypsin A와 황다랭이 trypsin 및 날개다랭이 trypsin에 비하여 그 고유활성이 월등히 높았다. 3. 이들 혈합육어 trypsin의 분자량은 22kDa-26kDa 범위였다. 4. 이들 trypsin은 공통적으로 glycine, serine, aspartic acid를 많이 함유하고 있었으며, tryptophan, methionine, lysine, tyrosine의 함유량은 적었다. 5. BA-$\rho$-NA기질에 대한 반응 최적조건은 멸치 trypsin은 pH 8.0에서 45$^{\circ}C$, 고등어 trypsin A와 B는 pH 8.0에서 5$0^{\circ}C$, 그리고 황다랭이 trypsin은 PH 9.0에서 55$^{\circ}C$, 날개다랭이 trypsin은 pH 9.0에서 5$0^{\circ}C$였다. 6. 위에 든 실험 결과들은 혈합육 어류의 서식온도가 이들 어류의 trypsin의 반응 최적 온도와는 어느 정도 관계가 있을 것으로 추측되었다.
본 연구에서는 고등어 어육을 고감도로 보다 신속하게 검출하기 위하여 고등어 어육 중 TSSP를 이용해 단클론성 항체를 개발하고 이를 이용하여 간접 효소면역분석법(iELISA)과 western blot의 검출한계를 확인하였다. 먼저 비 열처리와 열처리를 한 고등어 어육 중 존재하는 TSSP를 확인하고, 단백질 추출에 주로 사용되는 버퍼의 종류에 따른 추출법 효율을 확인하기 위하여 전기영동과 단백질 정량을 실시하였다. 그 결과 열처리한 추출물은 비 열처리한 추출물보다 TSSP가 2배 정도 많이 추출되었으며, TSSP로 추측되는 37 kDa 부근에 형성된 밴드의 선명함과 굵기를 육안으로 비교한 결과 carbonate buffer로 추출하였을 때 밴드가 가장 두드러지게 형성되었고, 단백질 정량 결과에서도 carbonate buffer를 이용한 추출물의 단백질 농도가 가장 높은 것을 확인하였다. 이후, 생 고등어 어육을 열처리법으로 추출하여 항원을 준비하고 6주령 BALB/c mouse에 면역한 후 세포융합 및 클로닝을 통해 3A5-1번, 2번, 9번 및 16번 4종의 hybridoma cell을 확보하였다. 이렇게 개발된 항체는 수산물, 축산물, 농산물과의 교차반응성확인을 통하여 고등어 단백질에만 특이성을 가지는 것을 확인하였다. iELISA와 western blot법의 검출한계를 확인한 결과 고등어가 1% 첨가된 수준까지 검출할 수 있으며, 특히 3A5-2와 3A5-9번 항체는 1%에서도 높은 흡광도를 나타내어 민감도가 매우 높은 항체로 확인되었다. 따라서, 개발된 고등어 TSSP 특이항체를 이용한 iELISA법과 western blot법은 가공품에 혼입될 수 있는 식품 알레르겐인 고등어를 보다 신속하고 민감하게 분석할 수 있는 분석 도구로서 활용이 가능할 것으로 판단되며, 개발된 항체는 고감도 바이오센서 개발에 충분히 활용이 가능한 바이오인자로 확인되었다.
본 연구는 고등어의 지질산패에 미치는 녹차 및 연잎의 항산화 효과를 알아보기 위하여 1%와 2%의 농도의 녹차 및 연잎 열수추출물에 처리하여 28일간 $4^{\circ}C$ 냉장보관하면서 염장고등어의 품질특성에 대해 알아보았다. 수분은 대조구의 경우 저장기간 동안 점점 감소하는 현상을 보였으나 처리구에서는 14일까지 감소하였으며 조단백질과 조회분은 저장기간 동안 큰 변화는 없었다. 조지방의 경우 대조구에서는 저장기간 동안 점차 증가하였으나 처리구에서는 오히려 감소하였다. pH는 저장기간이 경과함에 따라 부패가 진행되어 처리구, 대조구 모두 상승하는 경향을 보였으며 특히, 대조구의 경우 저장 7일째 6.35를 나타냄에 따라 부패가 시작되었음을 알 수 있었다. VBN은 저장초기 대조구를 포함한 모든 실험구에서 5.1~5.3 mg%로 매우 신선한 상태를 유지하였으며 저장기간 동안 처리구는 대조구보다 완만하게 증가하는 모습을 보였다. TMA-N의 경우 대조구와 비교하였을 때 1%의 농도처리 보다는 2%, 녹차 열수추출물보다는 연잎 열수추출물로 처리한 고등어에서 낮은 값을 보였다. TBA가, 과산화물가 및 산가를 측정한 결과 모두 비슷한 경향을 나타내었는데 저장기간에 따라 대조구에서는 급격히 증가하는 반면, 녹차 및 연잎 열수추출물을 농도별로 처리한 고등어에서는 증가폭이 완만하였으며 1% 농도에서 보다는 2%에서 처리한 고등어가 현저히 낮은 값을 보였다. 본 실험결과로 종합해 볼 때 염장고등어 제조시 녹차 및 연잎 열수 추출물 처리가 고등어의 지질산패 감소하는데 효과적이었으며 특히, 열수 추출물 고등어처리에 있어서 전반적으로 1%보다는 2% 농도 처리가 효과적인 것으로 판단되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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