배 경 : 결핵균의 성장 속도가 늦은 이유가 mammalian cell이나 대장균에 비해 결핵균 AK의 매우 낮은 활성도에 의한 것이라는 추측으로부터 AK1과 유사한 촉매능을 나타내는 AKmt 돌연변이 유전자와 human muscle-type AK 합성 유전자(AK1)를 각각 Mycobacterium/E.coli 발현벡터에 재조합(pMVAKmtDM, pEMAK1)하여 성장 속도가 매우 느린 BCG에 형질전환함으로써 이들 단백질들의 촉매능에 의한 성장 속도 변화가 일어나는지를 확인하고자 하였다. 방 법 : Human AK1의 촉매 활성도와 유사하도록 결핵균 AK (AKmt)유전자의 ATPbd와 LID domain을 돌연변이하여 제조한 유전자(AKmtDM)와 human muscle-type adenylate kinase 합성 유전자(AK1)를 Mycobacterium/E.coli 발현벡터에 클로닝하여 재조합 BCG를 제조하였고, 이들 재조합 BCG와 BCG Pasteur $1173P_2$ (wild-type)를 7H9 액체배지에 접종하여 2-3 일 간격으로 $A_{600}$ 값을 측정하였다. 결 과 : 재조합 BCG의 성장 속도는 Wild-type BCG의 성장 속도에 비해 변화가 없었다. 결 론 : 결핵균 adenylate kinase의 정확한 기능은 알 수 없으나, adenylate kinase의 촉매 활성도의 증가는 BCG의 성장 속도에는 영향을 주지 않는 것으로 판단된다.
Mycobacterium (M) bovis 를 인공감염시킨 개에 있어서 BCG의 전처치효과를 in vivo 및 in vitro에서 검토하였다. 개들은 BCG 전처치군, M bovis 단독처치군, 비감염대조군의 세군으로 나누었다. BCG는 M bovis 복강접종 3주일전에 0.2ml를 피내접종하였다. 결핵균 투여 4개월후에 전군을 도살하여 실험에 사용하였다. 도살시 모든 처치군에서 감염이 확인되었다. 병리조직학적으로 BCG전처치군의 폐장내에서는 경도의 macrophage의 침윤과 소상의 육아종 형성이 관찰되였으나 M bovis 단독처치군에 있어서는 보다 고도의 macrophage의 침윤, 중등도의 호중구의 침윤 및 중등도의 육아종의 형성이 확인되었다. 각 동물의 기관지폐포세정액을 분리하여 그 속의 총세포수와 각 세포의 분획을 검토하였다. 비감염 대조군의 기관지폐포세정액내의 총세포수는 두 처치군보다 훨씬 낮았으며 M bovis 단독처치군의 총세포수는 BCG 전처치군보다 1.8배 높았다. 이 세정액으로부터 폐포 macrophage를 분리배양하여 macrophage의 활성능과 결핵균의 증식능을 관찰하였다. BCG처치군은 M bovis 단독처치군에 비하여 높은 Fc receptor 활성(rosette 형성능, 탐식능)과 낮은 결핵균의 증식이 관찰되었다. 그러나 BCG의 전처치는 결핵균을 killing하지는 못하였다. 개에게 BCG를 전처치하면 폐내에 극소수의 결핵균이 지속적으로 잔존하지만 폐포 macrophage는 이미 항결핵성면역능을 지닌채로 계속 활성화된 상태로 존재하기 때문에 결핵에 대하여 예방효과를 갖는다고 사료된다.
연구배경: Mycobacteria 배양액 여과 단백질은 결핵에 대한 세포성 면역반응 및 진단 연구에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 새로운 결핵균 특이 유전자를 클로닝하여 약 14-kDa의 결핵균 재조합 단백질(TB-14)을 분리 정제 한 뒤 전혈 배양(whole blood culture)을 통해 재조합 단백질 항원의 자극에 따른 IFN-${\gamma}$ 분비 유도를 PPD와 비교 측정하여 TB-14 단백질이 결핵균에 대한 숙주의 세포성 면역반응 유도에 어떤 역할을 하는 지를 알아보고자 하였다. 방 법: M. avium 배양 여과액에서 항혈청과 강하게 반응하는 하나의 M. avium 특이 단백질을 확인하여 아미노산 서열을 규명한 뒤 이 단백질과 높은 상동성을 나타내는 M. tuberculosis 유전자를 클로닝하여 다량의 결핵균 재조합 단백질(TB-14)을 분리 정제하였다. 재조합 단백질 TB-14에 대한 세포성 면역 반응 유도를 알아보기 위해 결핵 환자(9명), PPD 양성 정상인(7명) 및 PPD 음성 정상인(7명)들로부터 얻은 전혈(whole blood)를 RPMI로 희석한 뒤 $10{\mu}g$의 PPD와 TB-14 단백질로 48 시간 동안 자극하여 상층액에 분비된 IFN-${\gamma}$ 농도를 ELISA로 측정하였다. 결 과: 1. M. avium LR114F 균주의 배양 여과액 내에서 M. intracellulare 항혈청에 강하게 반응하는 새로운 M. avium 특이 단백질을 규명하여 아미노산 서열을 확인하였다. 2. M. avium 특이 단백질과 상동성을 보이는 M. tuberculosis 특이 재조합 단백질인 TB-14은 148개의 아미노산으로 구성되어 있고 30개의 아미노산으로 이루어진 signal peptides를 가지며 M. avium과 78%의 상동성을 보였다. 3. PPD 양성인의 전혈 배양에서 TB-14 단백질 항원으로 자극된 군에서 PPD로 자극된 군보다 월등히 높은 IFN-${\gamma}$ 분비를 나타내었다. 반면 결핵환자에서는 질환의 양상이나 치료 정도에 따라 IFN-${\gamma}$의 분비 양상이 일정하지 않았다. 결 론: 새로운 결핵균 특이 재조합 단백질 TB-14는 결핵에 대한 인체 내 세포성 면역반응 유도에 중요한 역할을 할 수 있는 단백질이라 생각되며 특히 PPD 양성자에서 높은 IFN-${\gamma}$의 분비 양상을 보여 정상인과 결핵 감염자의 감별진단에도 활용될 수 있으리라 생각된다. 또한 TB-14 단백질에 대한 항혈청을 제작하여 환자의 가검물에 분비되는 결핵균 특이 단백질을 탐색하는 결핵의 진단 연구에도 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
연구배경 : Pyrazinamide(PZA)는 대식세포(macrophage)내의 결핵균에 주로 작용하는 항결핵약제로서 단기화학요법의 중요한 요소이다. 최근 서구에서 AIDS 발생의 증가와 함께 약제내성 결핵의 발생이 증가하면서 약제내성을 조기에 발견하려는 노력이 시도되고 있다. 현재 우리나라에서는 PZA 감수성 검사 대신에 pyrazinamidase(PZase) 활성도 유무로 PZA에 대한 내성여부를 판별하고 있다. 최근 결핵균의 PZase를 coding하는 pncA 유전자가 밝혀졌고 이 유전자의 돌연변이가 결핵균의 PZA 내성에 관여한다는 보고가 있었다. 이에 본 연구자는 결핵균의 pncA 유전자를 대상으로 한 PCR-SSCP 법으로 PZA 내성여부를 진단할 수 있는지 알아보기 위하여 본 연구를 시행하였다. 방 법 : 환자에서 추출되어 배양후 대한결핵연구원에서 PZase 활성도가 확인된 44예의 결핵균주와 대한결핵연구원에서 공여받은 BCG-French Strain, BCG-Tokyo strain, 그리고 1예의 우형결핵균 배양검체를 대상으로 하였다. 검체에서 bead beater 법으로 DNA를 추출하였으며 pncA 유전자를 포함하는 561bp 분절을 중합효소연쇄반응으로 증폭하였다. 이 증폭된 DNA를 BstB I 제한효소로 절단한 후 폴리아크릴아마이드젤에서 SSCP를 시행하여 그 결과를 표준균주 H37Rv와 비교하였다. 결 과 : 44예의 결핵균 중 22예는 PZase 활성도 양성이었고 22예는 PZase 활성도 음성이었다. 양성 22 예중 18예(82%)에서 표준균주인 H37Rv와 동일한 band의 이동성을 보였고 4예는 다른 band의 이동성을 보였다. 음성균주 22예중 19예(86%)에서 H37Rv와 다른 band의 이동성을 보였고 3예는 H37Rv와 동일한 band의 양상을 보여서 두 검사방법간의 관련성 검증 결과 통계적으로 유의하였다 (p<0.01). 근본적으로 PZA에 내성을 갖는 BCG strains과 1예의 우형결핵균 모두 H37Rv와 다른 band의 양상을 보여주었다. 결 론 : 결핵균의 PZase를 coding하는 pncA 유전자를 이용한 PCR-SSCP 법은 PZA 내성의 진단방법으로 기대된다.
- DOT하 결핵환자 치료 성공율을 90% 이상 달성 ${\rightarrow}$ 치료 완료후 2년이내 균양성 재발율을 3% 미만으로 달성 - 질병관리본부와 결핵연구원, 보건소 및 민간 병의원에서 치료받고 있는 결핵환자에 대한 WHO의 결핵조기퇴치 기본 전략인 직접복약확인체계(DOTS, Directly observed treatment short course)시범사업 본격 실시
결핵의 시작과 끝에 도말 배양검사를 빼놓고 이야기할 수 없다. X-ray로 판독이 불가능한 결핵균도 정확하게 판정해낸다. 그렇기에 한번 배양에 들어가면 8주간의 세심한 관찰아래 계속된 판정과 그에 따른 시약을 일일이 만들어내야 하는 어렵고도 힘든 시간의 연속이다. 이 어렵고도 고된 과정을 11년간 오직 한 분야에서 묵묵히 해내는 사람이 있다.
연구배경 : 결핵의 병리소견은 하나의 스펙트럼을 이루는데, 결핵균에 대한 면역기능이 정상이면 육아종의 형성이 좋고 결핵균이 거의 발견되지 않지만, 결핵균에 대한 면역 기능이 저하되어 있으면 육아종의 형성이 나쁘며 많은 결해균이 발견된다. 이에 저자들은 결핵성 경부 림프절염 환자의 림프절 조직에서 결핵균에 대한 면역기능의 정도를 알아보기 위해 병리소견과 항산균의 유무를 분석하고 임상적인 특징과 관련이 있는지 알아보고자 하였다. 방법 : 조직검사로 결핵성 경부 림프절염으로 진단받은 33명의 환자들의 병리소견을 분석하고 조직표본들을 탈파라핀화한 후 auramine-rhodamine 염색을 시행하여 조직에서의 항산균 유무를 검사한 후, 조직에서의 결핵균 검출 유무가 병리적인 특성(육아종의 형성정도, 건락성 과시의 유무, 중성구의 침윤) 또는 임상적인 특성(림프절의 크기, 림프절의 발견시점에서 조직검사까지의 기간, 림프절 부위의 통증이나 압통의 유무, 흉부방사선 소견상 결핵 소견의 유무)과 연관성이 있는지 알아보았다. 결과 : 1) 대상환자의 평균연령은 42.4세였고, 남녀비는 1:4.5였다. 2) 조직검사 소견 상 모든 예에서 육아종의 형성이 좋았고, 다양한 정도의 건락성 괴사가 관찰되었으며, 39%에서 육아종성 염증 주위로 다형백혈구의 침윤이 관찰되었다. 3) 52%의 예에서 조직표본에서 항산균이 검출되었고, 항산균은 세포 외에 존재하였고, 건락성괴사 부위의 가장자리에서 주로 발견되었다. 4) 조직에서의 항산균 검출 유무와 병리학적 특성 또는 임상적 특성과는 연관성이 없었다. 결론 : 결핵성 경부 림프절염의 경우 육아종의 형성이 좋았고, 조직에서의 항산균 검출 유무와 병리적 또는 임상적 특성과는 연관성이 없었다.
연구배경 : 최근 세계적으로 결핵의 증가와 함께 다제내성 결핵의 조절이 문제가 되고 있으며, 결핵 및 약제갑수성의 신속한 진단과 새로운 약제의 개발이 시급하다. Rifabutin (RBU)은 rifampicin (RFP)과 같은 rifamycin계통의 약제로, 일부 다제내성 결핵에서 효과가 있음이 보고되어 있다. 소수의 국외 연구에서 RFP내성과 관련된 rpoB 유전자의 돌연변이 양상에 따라 rifamycin계통 약제의 감수성여부가 결정된다고 보고 되었다. 아직도 내성율이 높은 국내 현실에서 다제내성 결핵균의 rpoB 유전자 돌연변이 양상을 파악하고, RBU감수성을 나타내는 돌연변이 양상을 확인하여 RBU감수성 다제내성 결핵을 신속하게 확인할 수 있는 진단법의 기초자료를 구하고자 하였다. 방법 : 1997년 7월에서 1999년 6월 사이에 서울중앙병원을 방문한 65명의 다제내성결핵환자에서 얻은 균주를 대상으로 RBU감수성검사와 rpoB 유전자 염기서열결정법을 시행하여 그 결과를 비교하였다. 결과 : 다제내성 결핵균 65균주중 52균주에서 RBU약제감수성검사를 시행하였고, 56균주에서 rpoB 유전자 염기서열이 확인되었다. 44균주에서 rpoB 유전자 염기서열분석과 RBU약제감수성검사가 동시에 시행되었다. 염기서열이 확인된 56균주중 53균주(95%)에서 rpoB 유전자 돌연변이가 발견되었다. 발견된 60개 돌연변이중 531 코돈 돌연변이가 26개(43%)로 가장 많았으며, 7예에서는 돌연변이가 2가지씩 존재하였다. RBU감수성 균주는 10% (5/53) 이었다. RBU감수성 균주가 채취된 5명중 1명에서 RBU를 복용하였으나 균음전에는 실패하였다. RBU감수성 다제내성 결핵균과 관련된 rpoB 유전자 돌연변이는 526 코돈의 CAC - > AAC, GCC, TGC, 516 코돈의 GAC - > TAC 또는 GAG, 그리고 509 코돈의 AGC - > AGA 점돌연변이 이었다. 결론 : 국내 다제내성 결핵균에서 rpoB 유전자 돌연변이의 빈도 및 양상은 결핵의 유병율이 낮은 국외의 보고와 비슷하였으며, 일부는 RBU에 감수성을 나타내었다. RBU감수성올 나타내는 rpoB 유전자 돌연변이 양상을 이용하여 다제내성 결핵균에서 RBU감수성인 균주를 신속히 진단할 수 있을 것으로 사료되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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