폐결핵이 발생한 환자가 기침할 때 나오는 결핵균들은 새로 태어난 사람들을 포함하여 결핵균에 감염되지 않았던 다른 사람들을 새롭게 감염시키면서 인류 사회에 깊숙이 침투해서 번창하여 왔다. 그러나 1940년대에 접어들면서 인류는 결핵균에게 치명적인 무기들을 하나씩 개발하고 결핵균의 전략을 파악하면서 대대적인 반격을 시작하였다. 세월이 흘러 결핵퇴치사업이 성과를 보이면서 선진국들을 중심으로 결핵균의 세력이 급격히 위축되면서 위기를 맞고 있다.
인류는 수많은 연구들을 통하여 결핵의 원인균(결핵균:M.tuberculosis)과 발병기전을 밝혔으며, 결핵퇴치사업을 범세계적으로 추진하였음에도 불구하고 결핵은 아직도 전 세계적으로 만연하고 있다. 결핵균이 현대의학의 발전에도 불구하고 우리나라를 포함하여 전 세계적으로 맹위를 떨치고 있는 것은 대부분의 미생물들과는 달리 결핵균만이 가지는 아주 독특한 생존전략을 가지고 있기 때문일 것이다.
결핵(Mycobacterium tuberculosis, MTB) 감염은 아직까지 전 세계에서 높은 유병률과 사망의 주요 원인이 되고 있으며 비정형 결핵(nontuberculous mycobacteria, NTM)은 최근 후천성 면역결핍증(AIDS)이나, 종양, 이식 등으로 면역력이 저하된 환자들의 임상 검체에서 분리빈도가 증가함에 따라 분리 균주의 임상적 의의가 중요시 되고 있다. 이에 항산균 염색을 이용한 객담 도말검사는 결핵균과 비정형 결핵균을 구별할 수 없다는 제한점이 있고, 균 분리배양검사는 시간이 오래 걸린다는 단점이 있어, 본 연구에서는 이러한 제한점을 가진 기존의 검사법을 대신하여 분자생물학적 방법인 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 균 분리배양 검사와 비교하여 보았다. Mycobacteria를 동정하는데 항산균 염색과 3% ogawa 배지를 이용하였고, 균 분리배양 후 M. tuberculosis를 확인하기 위해서 niacin test를 실시한 결과 집락의 DNA를 추출하여 PCR후 동정된 M. tuberculosis와 niacin 양성이 일치함을 확인할 수 있었다. 또, 이 실험에서 항산성균 염색이 2+ 이상인 객담검체와 집락검체 각각에서 DNA를 추출하여 결핵균을 동정하는 방법으로 M. tuberculosis complex에 특징적으로 존재하는 insertion sequence (IS) 6110의 특정부위인 547 bp와 285 bp 부분을 증폭한 two-tube nested polymerase chain reaction을 시행하였고, 비정형 결핵균 동정법으로는 mycobacteria에 공통적으로 존재하는 rpoB 유전자 중 일부인 360 bp 부분을 증폭한 후, 제한효소 Msp I을 첨가 PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP)을 시행하였으며, 결핵균과 비정형 결핵균 모두 동정율에 거의 차이가 없었다. 1+인 경우는 객담검체에서 PCR한 결과가 31.2%에서 집락검체의 PCR한 결과 93.7%까지 결핵균과 비정형결핵균의 동정율이 높아졌고, trace인 경우 객담검체에서 PCR 결과가 2%에서 집락검체에서 PCR한 결과가 97.9%까지 결핵균과 비정형 결핵균의 동정율을 높일 수 있었다. 이 실험에서 항산성균 염색 1+이하 일때 객담검체와 집락검체로 PCR을 실시하면 결핵균과 비정형 결핵균의 동정율에 차이가 있고, 배양만으로는 결핵균의 동정은 가능하지만 비정형 결핵균의 동정이 가능하지 않으므로 배양검사와 PCR 검사 모두를 병행하므로써 보다 신속하고 정확한 검사결과를 내는데 도움 될 것이다.
연구배경 : 세포내 병원균(intracellular pathogen)으로 감염초기에 단핵식세포(mononuclear phagocytes)에 탐식되는데, 독성(virulent) 결핵균주(Erdman, H37Rv)가 약독화(attenuated) 균주(H37Ra)보다 탐식이 더 잘 되며, 이러한 현상으로부터 결핵균의 입장에서 보면 단핵식세포에 탐식이 잘되는 것이 생존 및 증식에 유리할 것이라는 의견이 제시되어 왔다. 그리고 난치성 결핵환자에서 분리한 결핵균은 임상적으로 독성이 강하며 대부분에서 다제내성을 보이므로, 약제내성 결핵균여 감수성균에 비해 독성이 강하다는 가정하에 약제내성 결핵균이 감수성균에 비해 단핵식세포에 탐식이 더 잘 되는지, 그리고 난치성 결핵환자에서 분리한 단핵식세포가 정상인에 비해 결핵균을 더 잘 탐식하는지 알아보고자 하였다. 방 법 : 약제내성의 정도에 따라 모든약제에 감수성인 결핵균, Isoniazid와 Rifampicin을 포함한 일부 약제에 내성인 결핵균, 모든 약제에 내성인 결핵균을 각각 $70^{\circ}C$에서 1시간 가열하여 사멸시킨 뒤 부유액을 만들어 10명의 난치성 결핵환자와 12명의 정상인에서 분리한 말초혈액탄핵구 배양액에 첨가하여 탐식시킨 뒤 단핵구의 결핵균을 탐식율을 관찰하였다. 결 과 : 약제내성 결핵균이 감수성균에 비하여 말초혈액단핵구에 탐식이 더 잘되었으며(정상 대조군에서 분리한 말초혈액단핵구의 결핵균 탐식율 : 모든약제 감수성균 : $32.3{\pm}2.9%$, 모든약제 내성균 : $49.6{\pm}3.4%$, p = 0.0022, 난치성 결핵환자군에서 분리한 말초혈액단핵구의 결핵균 탐식율 : 모든약제 감수성균 : $34.9{\pm}3.6%$, 모든약제 내성균 : $50.7{\pm}4.5%$, p = 0.0069), 난치성 결핵환자와 정상인에서 분리한 말초혈액단핵구 사이의 결핵균의 탐식능에는 차이가 없었다. 결 론 : 약제 내성균이 감수성균보다 단핵식세포에 탐식이 더 잘 되며, 숙주 요인은 결핵균의 탐식의 차이에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다.
결핵균은 공기를 매개로 전파되고 결핵균에 노출된 시간과 최초의 노출 정도가 전파의 위험을 증가 시키는 중요한 인자로 알려져 있다. 활동성 폐결핵 환자와 함께 생활하는 가족 내에서 감염이 현저히 증가하는데 이는 결핵균에 노출되는 기회 및 시간이 증가하기 때문이다. 하지만 고식적인 접촉자 조사만으로는 흔히 결핵 발생률을 과소평가할 수 있기 때문에 접촉자 조사와 결핵균의 유전형 조사를 병행하는 것이 감염의 위험이 높은 집단을 선별해내고 발생빈도 및 전염경로를 밝히는 데 보다 효과적인 것으로 보고되고 있다. 이에 접촉자 조사와 결핵균의 유전형 조사를 통해 가족 내 결핵균 전파를 증명한 1예를 보고하는 바이다.
전 세계 인구의 1/3을 감염시키고 있는 결핵균은 21세기에도 인류를 위협하는 병원균이다. 결핵균에 대항하는 Th1 면역 반응은 결핵균의 세포 내 성장을 제어하는 것으로 알려져 있으나, 이는 결핵균 감염을 자연 치유하는 수준에는 미치지 못한다. 본 연구에서는 C57BL/6 마우스에 병원성 결핵균인 H37Rv를 감염시켰을 때 숙주의 면역 반응에 대항하여 결핵균이 자신의 유전자 발현을 변화시킨다는 사실을 규명하기 위하여, 결핵균 유전자 중 16S rRNA, acr, fbpA, aceA, ahpC 등의 발현을 real-time RT-PCR을 이용하여 연구하였다. 16S rRNA의 copy number는 감염 후 30일까지 급격하게 증가하였는데 이는 CFU 측정 결과와 일치하고 있다. 결핵균 유전자 중 주된 항원으로 작용하는 유전자인 fbpA의 copy number를 CFU로 나눈 값으로 표현한 발현 양상은 감염 후 10일까지 증가하다가 감소되었다. Heat shock protein인 ${\alpha}$-crystallin을 coding하는 acr은 감염 후 지속적으로 높아졌으나, 산화적 스트레스 환경에서 발현되는 효소들인 ahpC와 aceA의 발현은 감염 후 20일 동안 높아졌다가 30일에는 약간 감소하였으나 비교적 높은 수준을 유지하였다. 이상의 결과는 결핵균이 숙주의 면역 반응이 개시되면 결핵균의 주된 항원 중 하나인 Ag85A를 코딩하는 유전자인 fbpA의 발현 수준을 낮춰 숙주의 Th1 먼역 반응이 낮아지도록 유도한다는 증거로 볼 수 있으며, 면역 반응이 활발해 짐에 따라 큰포식세포 내에서 산화적 스트레스로부터 균을 보호하기 위하여 ahpC와 aceA의 발현이 높아진 것으로 해석된다. 따라서 본 연구는 결핵균이 유전자 발현을 숙주의 면역 반응에 대항하여 스스로 변화시켜 적대적인 숙주 세포 내에서 살아 남을 수 있는 생존 전략을 구사한다는 가능성을 제시한다.
결핵(TB)은 Mycobacterium tuberculosis (MTB) 복합체의 구성원에 의한 세균 감염 질병이다. 결핵은 전 세계 인구의 1/3이 감염된 것으로 알려져 있으며, 한국에서는 매년 약 4만 명의 새로운 결핵환자가 발생한다. 또한, 비결핵 항상균 감염이 증가하고 있는 추세이다. 전통적인 결핵 및 비결핵 항상균 진단방법은 세균 배양으로 3~4주 이상이 소요된다. 따라서, 신속하고 정확한 결핵균(TB) 및 비결핵 항상균(NTM) 진단법의 필요성이 요구되고 있다. 결핵균 및 비결핵 항상균을 구분하기 위하여, 전 세계적으로 다양한 진단 방법이 개발되고 있다. 특히, 결핵균과 비결핵 항상균을 신속하고 정확한 동정의 요구가 증가함에 따라, 정확하고 신속하게 진단하기 위한 체외 진단 방법이 개발 되고 있다. 그러나 현재 결핵과 비결핵 항상균에 대한 체외 진단 시약의 성능 평가는 부족한 실정이다. 최근 식약청은 결핵균 및 비결핵 항상균 체외 진단 시약에 대한 가이드 라인을 발표했다. 본 연구에서는, 미국 FDA에 승인을 받은 결핵균 및 비결핵 항산균에 대한 체외 진단 시약의 성능을 검토하였다. 이 검토는 결핵균 및 비결핵 항상균 체외 진단 시약 평가에 유용한 참고 자료가 될것으로 사료된다.
연구배경 : 결핵치료에서 어려움을 주는 가장 중요한 요인의 하나가 약제 내성균에 감염된 경우이다. 근래 다제내성 결핵균의 증가는 신속한 결핵균 감수성검사방법 개발에 대한 필요성을 더욱 증가시키고 있다. 활발하게 개발이 진행되고 있는 분자생물학적 기법들도 신속한 내성여부의 구분에 많은 도움을 주고 있지만, 아직까지는 검사약제가 제한되어 있고 보완할 점들이 많이 남아있다. 따라서 저자들은 결핵균 세포 염색 방법에 의해 생균과 사균을 구분할 수 있는 신속하고도 정확한 결핵균 약제 감수성 검사 방법을 검토하여 보았다. 방 법 : 본 연구의 대상으로 대표적인 4가지 항결핵 약제(Isoniazid, Rifampicin, Streptomycin, Ethambutol)에 모두 내성인 임상분리 결핵균 20 균주와 모든 약제에 감수성인 임상분리 결핵균 20 균주를 사용하였다. 약제감수성검사시의 최소 희석배수였던 MacFarland #1 탁도로부터 10배 희석한 결핵균액을 7H9 배양액 $30m{\ell}$에 접종한 후 $37^{\circ}C$에서 24시간 배양한 다음, 핵산 염색액인 Syto 9 (MolecularProbes, USA)과 세포질 염색액인 프로피디움(propidium iodide, $C_{27}H_{34}I_2N_4$)을 결핵균과 잘 섞은 후 실온의 암소에서 15 분간 방치한 후 슬라이드에 $5{\mu}{\ell}$씩 점적하여 형광 현미경으로 관찰하였다. 결 과 : 실험에 사용한 약제내성 결핵균은 4가지의 항결핵약제의 각 농도가 함유된 7H9 배양액에서 사멸하지 않고 생존하고 있음을 형광 현미경상에서 확인 할 수 있었다. 프로피디움(propidium iodide)은 살아있는 세균의 경우 세포핵은 염색시키지 못하고 세포질만 염색함으로써 살아있는 결핵균은 형광현미경 시야에서 녹색을 띄게 되고, 세포의 핵산을 염색시키는 Syto 9 은 사멸한 세포의 세포질을 통과하여 결핵 약제에 감수성인 결핵균의 세포핵을 염색시켜 형광 현미경 시야에서 붉은 색으로 관찰 되었다. 결 론 : Acridin (Syto9)과 propidium 성분을 이용하여 세포를 형광 염색시켜 세포의 사멸 및 생육을 판단하는 방법을 결핵균 약제감수성검사에 적용한 결과, 간편하고도 신속하게 24시간 이내에 내성균과 감수성균을 구분할 수 있었다. 생균과 사균 세포의 판별법으로 기존의 결핵균 감수성 방법을 대체하기 위해서는 형광현미경을 비롯한 실험실 장비와 숙련된 검사자가 필요하지만, 배양된 균으로 검사하는 데만 4주 이상 소요되는 기존의 결핵균 감수성 검사 방법을 대체할 수 있는 매우 저렴하고도 간편한 검사방법으로 판단되었다.
연구배경: 폐결핵을 확진하는 방법은 결핵균의 증명이며 결핵균 동정을 하는 고전적인 방법인 항산균 도말 검사와 결핵균 배양 검사에 대해 상호 보완적으로 폐결핵의 보다 신속한 진단을 하는데 있어서 MTD의 유용성을 알아보고자 하였다. 방 법: 1997년 11월부터 1998년 5월까지 부산대학교 병원에 내원하여 폐결핵이 의심된 187명의 환자로부터 얻은 호흡기검체 267건(객담 187건, 기관지 세척액 94건)에 대해 각각 항산균 도말, 결핵균 배양 검사, MTD를 시행한 결과를 임상 소견과 연관지어 비교 분석하였다. 결 과: 1) 객담 검체에서 항산균 도말 검사, 결핵균 배양 결과와 비교하였을 때 항산균 도말 양성인 경우 결핵균 배양 검사와 비교한 MTD의 민감도는 75.6%, 도말 음성인 경우 결핵균 배양 검사와 비교한 MTD의 민감도는 61.9%, 특이도는 85.6%였다. 2) 기관지 세척액에서 항산균 도말 검사, 결핵균 배양 결과와 비교하였을 때 항산균 도말 양성인 경우 결핵균 배양 검사와 비교한 MTD의 민감도는 89.5%, 특이도는 28.6%, 도말 음성인 경우 결핵균 배양 검사와 비교한 MTD의 민감도는 89.5%, 특이도는 67.3%였다. 3) 객담과 기관지 세척액을 합한 경우 항산균 도말검사, 결핵균 배양 결과와 비교하였을 때 항산균 도말 양성인 경우에서 결핵균 배양 검사와 비교한 MTD의 민감도는 79.7%, 특이도는 20.0%를 보였으며, 항산균 도말 음성인 경우 결핵균 배양 검 사와 비교한 MTD의 민감도는 75.0%, 특이도는 80.3%를 보였다. 4) 결핵균 배양 결과와 비하여 MTD의 결과가 일치하지 않는 경우 MTD의 민감도는 67.5%, 특이도는 84.3%였으나 불일치 해결후에 MTD의 민감도는 79.2%, 특이 도는 84.4%를 보여 향상된 결과를 보였다. 5) 항산균 도말 음성, 결핵균 배양 음성이며 MTD만 양성인 31예에서 임상 경과 추적 및 항결핵제 치료 반응 웅의 분석에서 14예에서만 최종 폐결핵으로 진단되었으며 이 경우 MTD의 민감도는 45.2%였으며 진성 양성을 확인할 수 있었다. 6) 항산균 도말 음성, MTD 음성에서 mycobacterium species로 자란 13 건의 검체에서 Mycobacterium tuberculosis와 nontuberculous mycobacteria를 분리하기 위해 accuprobe M.tuberculosis complex culture kit를 이용하여 11건에서 M.tuberculosis로 배양되었으며 2건(17.3%)에서 비결핵 항산균이 배양되었다. 결 론: 이상의 결과로 볼 때 MTD는 빠르고 정확한 결핵균 진단에 유용한 것으로 생각되며, 폐결핵 진단에 있어서 MTD는 항산균 도말 검사 및 배양 검사와 병행함으로써 유용성이 높으며, 고전적인 진단 방법을 대체하기 보다는 상호 보완적인 방법으로 판단된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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