Aspergillus sp. HCLF-4가 생성하는 세균 세포벽 분해효소의 특성을 규명하였다. 본 세포벽 분해 효소는 Anabaena cylindrica 세포벽 분해능을 보였다. 이 세포벽 분해 효소는 Aspergillus sp. HCLF-4를 기질성분으로 0.05% heat killed Micrococcus luteus가 포함된 PDB 배지에 키웠을 때 생성되는 inducible enzyme으로 분자량은 약 14.3 kDa 이었다. 본 세포벽 분해효소는 pH 3.0-4.0, 온도 $30^{\circ}C$ 조건에서 최고의 활성을 보였고 $Mg^{2+}$와, $Mn^{2+}$의 2가 이온에서 분해 효소의 활성이 촉진되었다. 반면, 1가 양이온 $Na^{+}$와 $Li^{+}$, 2강 양이온 $Ca^{2+}$와 $Cu^{2+}$, 3가 양이온 $Fe^{3+}$에서는 활성이 억제되었으며 EDTA와 PMSF 또한 분해 효소의 활성을 억제 시켰다. 이 효소는 N-acetylmuramyl-L-amidase 또는 endopeptidase와 같은 활성을 보였다.
Amberite IR 120+양이온 교환수지를 사용하고, 용리액으로 EDTA 용액을 사용하였을 때, 란탄계열원소들($Pr^{3+},\;Nd^{3+},\;Sm^{3+},\;Er^{3+}$)의 분배비와 분리인자에 미치는 온도의 영향과 수지상의 보유이온의 종류에 따르는 영향을 연구하였다. 보유이온들에 있어서는, ${NH_4}^+,\;Na^+,\;K^+,\;Mg^{2+},\;Ca^{2+},\;Zn^{2+}$ 및 $Ce^{3+}$들 중, $Ce^{3+}$이 Nd/Pr의 분리인자를 개선하는데 가장 좋은 효과를 주었으며, $Zn^{2+}$이 Sm/Nd와 Er/Sm이 분리인자를 개선하는데 가장 적당한 보유이온임을 규명하였다. 용리시킬 때 온도의 영향은, 보유이온에 따라 매우 다양하였으며, 온도를 상승시킬 때 분배비는 감소하였다. 그러나 분리인자는 항상 증가하지 않았으며 보유이온이$Ce^{3+}$일 때 온도를 상승시켜 보니, Nd/Pr, Sm/Nd의 분리인자가 증가하였고, 보유이온이 $Zn^{2+}$일 때 온도를 상승시켜 보니 Er/Sm의 분리인자가 증가함을 확인하였다.
Penicillium oxalicum 으로부터 세포외로 분비되는 Anabaena cylindrica 분해효소의 분자량은 renaturation SDS-PAGE에서 약 22kDa 으로 확인되었으며, 분해 효소의 농축은 ultrafiltration cut off fraction 중 30-10 kDa 구간에서 수획하였다. 최적 활성조건의 측정 결과 적정 pH는 3.5-4.0, 적정반응 온도는 $20^{\circ}C$, 그리고 온도 안정성은 $4^{\circ}C$ 이하에서 100% 이상, 20-$90^{\circ}C$ 범위에서는 50% 이상의 활성을 나타내었다. 금속이온 및 효소안정제의 영향에서는 $Na^+$,$K^+$, $Ba^(2+)$, $Mg^(2+)$, $Mn^(2+)$의 양이온과 BSA는 효소의 활성을 촉진시키는 반면, $Ca^(2+)$, $Cu^(2+)$의 양이온과 EDTA, PMSF 는 효소의 활성을 억제하는 작용을 하였다. 이러한 금속이온과 안정제의 영향에서 1가, 2가 양이온에 의해 활성이 증가하고, $Fe^(3+)$, $Ca^(2+)$, $Cu^(2+)$의 양이온에 의해서는 활성이 감소하는 결과는 대부분의 세포벽 분해효소가 갖는 특성과 유사한 결과였다. 분해효소는 A. cylindrica 과 Micrococcus. luteus 의 세포벽을 기질로 사용한 효소의 활성 반응에서 반응 시작 후 1시간에서 5시간 사이에 반응 산물로 환원당의 양이 급격히 증가하였다.
토양으로부터 탈지대두박을 잘 분해하는 단백질 가수분해효소를 생산하는 미생물을 분리하여 형태적, 생화학적 특성과 세포벽 지방산조성을 조사한 결과, 분리된 세균은 Aeromonas hydrophila로 동정되었다. 분리된 세균은 glycerol을 탄소원으로, tryptone 및 $(NH_4)_2HPO_4$을 진소원으로, $CaCl_2$를 무기원으로 사용한 배지에서 효소를 가장 많이 생산하였으며, 생산된 효소의 반응최적 pH는 8.0이고, 반응최적온도는 $65^{\circ}C$였다. 이 효소는 $55^{\circ}C$ 이하의 온도에서, pH 7.0에서 13.0의 범위에서 비교적 안정한 것으로 나타났다. 또한 이 효소는 금속이온 $Cu^{2+},\;Hg^{2+}.\;Mn^{2+}$ 및 $Zn^{2+}$에 의해서 효소활성이 저해를 받고, 효소저해제 phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)와 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)에 의해서 효소활성이 강력히 저해되는 성질로부터 효소활성부위에 serine기와 금속이온을 갖고 있는 것으로 밝혀졌다.
The novel $\alpha$-amylase purified from locally isolated strain, Bacillus sp. KR-8104, (KRA) (Enzyme Microb Technol; 2005; 36: 666-671) is active in a wide range of pH. The enzyme maximum activity is at pH 4.0 and it retains 90% of activity at pH 3.5. The irreversible thermoinactivation patterns of KRA and the enzyme activity are not changed in the presence and absence of $Ca^{2+}$ and EDTA. Therefore, KRA acts as a $Ca^{2+}$-independent enzyme. Based on circular dichroism (CD) data from thermal unfolding of the enzyme recorded at 222 nm, addition of $Ca^{2+}$ and EDTA similar to its irreversible thermoinactivation, does not influence the thermal denaturation of the enzyme and its Tm. The amino acid sequence of KRA was obtained from the nucleotide sequencing of PCR products of encoding gene. The deduced amino acid sequence of the enzyme revealed a very high sequence homology to Bacillus amyloliquefaciens (BAA) (85% identity, 90% similarity) and Bacillus licheniformis $\alpha$-amylases (BLA) (81% identity, 88% similarity). To elucidate and understand these characteristics of the $\alpha$-amylase, a model of 3D structure of KRA was constructed using the crystal structure of the mutant of BLA as the platform and refined with a molecular dynamics (MD) simulation program. Interestingly enough, there is only one amino acid substitution for KRA in comparison with BLA and BAA in the region involved in the calcium-binding sites. On the other hand, there are many amino acid differences between BLA and KRA at the interface of A and B domains and around the metal triad and active site area. These alterations could have a role in stabilizing the native structure of the loop in the active site cleft and maintenance and stabilization of the putative metal triad-binding site. The amino acid differences at the active site cleft and around the catalytic residues might affect their pKa values and consequently shift its pH profile. In addition, the intrinsic fluorescence intensity of the enzyme at 350 nm does not show considerable change at pH 3.5-7.0.
The influence of phenylalanine (Phe) in the medium on protein synthesis of chicken embryo fibroblasts (CEF) was examined. CEF was derived from 9-d-old embryos by trypsin-EDTA digestion. To examine the deficiency of Phe in the medium, CEF was cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) with or without Phe. CEF was also cultured in Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS ($Ca^{2+}$, $Mg^{2+}$)) with or without $400{\mu}m$ Phe in order to examine the effect of Phe supplementation. All media were supplemented with 10% (v/v) fetal calf serum. After incubation for 6, 30 and 54 h, protein synthesis was measured by the incorporation of L-[2, $6-^{3}H$] Phe into CEF for further 18 h. Protein synthesis of CEF cultured in DMEM was higher than that in PBS ($Ca^{2+}$, $Mg^{2+}$). High specific radioactivity of Phe due to the low concentration of Phe in the medium resulted in the apparent increase in protein synthesis of CEF. Protein synthesis cultured in PBS ($Ca^{2+}$, $Mg^{2+}$) with Phe did not increase during 72 h of cell culture.
섬유소분해능이 우수한 L. roseoalbus로부터 분리 정제한 CMCase의 활용에 대한 기초적인 자료를 제공하고자 실험하여 L. roseoalbus의 배양액으로부터 4단계를 거쳐 분자량이 28.5 kDa인 CMCase를 분리 정제하였다. 이 효소는 pH 4.0에서 최적의 활성을 보여주는 acidic CMCase로 $30^{\circ}C$에서 최대 활성을 나타냈다. EDTA에 의해 활성이 저해되는 것으로 보아 metalloenzyme으로 추정되며, PMSF에 의해 저해되는 것으로 보아 serine 잔기를 갖고 있는 효소로 판단된다. $Al_{2}(SO_{4})_{3}$와 $FeSO_{4}$에서는 효소활성이 높았으나 $CaCl_{2}$와 $Na_{2}MoO_{4}$에서는 효소 활성이 낮았다.
Calcium (Ca) and potassium (K) were introduced to remove Sr and Cs in soil, respectively. Four factor and three level Box-Bhenken design was employed to determine the optimal washing condition of Ca- and K-based solutions, and the ranges tested were 0.1 to 1 M of Ca or K, L/S ratio of 5 to 20, washing time of 0.5 to 2 h, and pH of 2 to 7. The optimal washing condition determined was 1 M of Ca or K, L/S ratio of 20, washing time of 1 h, and pH of 2, and Ca-based and K-based solutions showed 68 and 81% removal efficiency for Sr and Cs, respectively in soil. For comparison, widely used conventional washing agents such as 0.075 M EDTA, 0.01 M citric acid, 0.01 M oxalic acid, and 0.05 M phosphoric acid were tested, and they showed 25 to 30% of Sr and Cs removal efficiency. Tessier sequential extraction was employed to identify the changes in chemical forms of Sr and Cs during the washing. In contrast to the conventional washing agents, Ca-based and K-based solutions were able to release relatively strongly bound forms of Sr and Cs such as Fe/Mn-oxide and organic matter bound forms, suggesting the involvement of direct substitution mechanism, probably due to the physicochemical similarities between Sr-Ca and Cs-K.
김치를 장기간 저장할 수 있는 방법을 찾고저 인산나트륨과 칼륨, 구연산염, 그리고 인산염 혼합물(CA-A), 인산염에 $NaNO_2$, BHA를 첨가한 혼합물(CA-B), CA-B의 BHA를 구연산염으로 대치한 혼합물(CA-C) 등 3가지 염의 혼합물을 김치발효 중반기에 첨가하여 이들의 발효 억제 효과를 조사하였다. 이들 염의 첨가농도는 $0.001{\sim}0.01\;M$ 범위였으며 김치의 발효는 $4{\sim}35^{\circ}C$에서 하였다. 그 결과 인산나트륨과 구연산염은 발효억제 효과가 뚜렷하였으나 인산칼륨은 별로 없었으며, 발효억제 효과의 순위는 $Na_3PO_4-Na_2HPO_4-sodium\;citrate-NaH_2PO_4-K_2HPO_4-KH_2PO_4$이었다. 한편, 염혼합물들의 효과는 CA-B-CA-C-CA-A의 순으로 CA-B가 가장 높았다. 항산화제를 제외 시켰던 CA-C는 김치의 pH $4.2{\sim}4.4$ 범위를 유지할 수 있었던 시간은$4{\sim}25^{\circ}C$ 온도범위에서 대조구에 비하여 약 6배의 연장효과가 있었다. 미생물 성장실험에서 총균수와 Leuconostoc mesenteroides의 번식이 현저히 감소함을 보여주었다.
A novel type of extracellular phospholipase $A_1$ was isolated from Serratia sp. MK1 and purified to homogeneity by ammonium sulfate precipitation, anion exchange and gel filtration chromatography. The purified enzyme was a monomer with a molecular mass of about 43, 000 Da. This enzyme showed the highest lipolytic activity toward phosphatidylserine among the phosphoglycerides tested, and preferentially catalyzed the hydrolysis of the ester bond in phosphatidic acid to lyso-phosphatidic acid. Enzyme activity was completely inhibited by the addition of a chelating agent such as EDTA, and inhibited enzyme activity was fully recovered by the presence of $Ca^{2+}$. This implies that the enzyme requires $Ca^{2+}$ for activity. The enzyme was stable up to $70^{\circ}C$ when incubated for 1 h at pH 8.5, and the optimal pH and temperature were 8.5 and $50^{\circ}C$, respectively.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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