한국어류학회지 (Korean Journal of Ichthyology)

  • 제36권2호
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  • Pages.139-155
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  • 2024
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  • 1225-8598(pISSN)
  • /
  • 2288-3371(eISSN)
한국어류학회 (The Ichthyological Society of Korea)
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한국산 중고기속(Sarcocheilichthys) 어류의 유전적 다양성과 분자계통학적 유연관계

Genetic Diversity and Molecular Phylogenetic Relationships of the Genus Sarcocheilichthys Fish in Korea

  • 장지왕 (자연환경복원연구원) ;
  • 김재구 (알파생태연구원) ;
  • 고재근 (자연환경복원연구원) ;
  • 윤봉한 (한국생태네트워크) ;
  • 배양섭 (인천대학교 생물과학과)
  • Ji-Wang Jang (Natural Environmental Restoration Institute) ;
  • Jae-Goo Kim (Alpha Research Ecology Institute) ;
  • Jae-Geun Ko (Natural Environmental Restoration Institute) ;
  • Bong-Han Yun (Institute of Korea Eco-Network) ;
  • Yang-Seop Bae (Division of Life Sciences, College of Life Sciences and Bioengineering, Incheon National University)
  • 투고 : 2024.03.08
  • 심사 : 2024.04.21
  • 발행 : 2024.05.31
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초록

한국산 중고기속(genus Sarcocheilichthys)에 속하는 중고기(S. nigripinnis morii) 8개 집단과 참중고기(S. variegatus wakiyae) 5개 집단의 미토콘드리아 DNA의 cytb 유전자를 이용하여 각 집단의 유전적 다양성 및 분자계통학적 유연관계를 검토하였다. 참중고기 집단이 중고기 집단보다 유전적 다양성이 높은 것으로 확인되었다. cytb 유전자를 기반으로 한 한국산 중 고기속 어류의 분자계통도상에서 참중고기의 영산강(YSR) 집단은 중고기의 탐진강(TJR), 영산강(YSR), 섬진강(SJR) 집단과 clade를 이루며 현재의 분류체계와 일치하지 않는 유전적 유역관계가 나타났다. 한편, 핵 DNA 분자계통도상에서는 참중고기와 중고기로 뚜렷하게 구분이 가능하여 미토콘드리아 및 핵 DNA가 분자계통도상에서 상충하는 mitonuclear 불일치 현상이 나타냈다. 중고기의 섬진강(SJR) 집단이 동진강(DJR) 집단에 이입되어 교배가 일어난 것으로 추정되는 유전자형이 확인되었다. 동해로 유입되는 하천 중 유일하게 형산강(HSR)에만 이입되어 서식하는 것으로 알려진 중고기 집단은 한강(HR) 집단으로부터 이입되어 형성된 집단으로 추정되었지만, 고유한 유전적 그룹을 나타내는 유전자형도 확인되었다. 중고기의 한강(HR), 금강(GR), 만경강(MGR) 집단은 압록강 이북에 분포하는 북방중고기(S. czerskii), S. soldatovi와 유전적으로 동일 집단을 형성하였으며, 이에 다양한 표본을 확보하여 형태학적 및 분자계통학적 연구를 통한 분류학적 재검토가 요구되었다.

Using the cytb gene region of the mitochondrial DNA of eight populations of Sarcocheilichthys nigripinnis morii and five populations of S. variegatus wakiyae, which belong to the genus Sarcocheilichthys from Korea, the genetic diversity and molecular phylogenetic relationships of each population were examined. As a result of the analysis, it was confirmed that the S. variegatus wakiyae population had higher genetic diversity than the S. nigripinnis morii population. In the phylogenetic tree of genus Sarcocheilichthys fish in Korea based on the cytb gene, the Yeongsan River (YSR) population of S. variegatus wakiyae forms a clade with the Tamjin River (TJR), Yeongsan River (YSR), and Seomjin River (SJR) population of S. nigripinnis morii, and genetic relationships that do not align with the current classification system were observed. Meanwhile, on the nuclear DNA phylogenetic tree, S. variegatus wakiyae and S. nigripinnis morii could be clearly distinguished, showing mitonuclear inconsistency where mitochondrial and nuclear DNA conflicted on the phylogenetic tree. The Seomjin River (SJR) population of S. nigripinnis morii was translocated to the Dongjin River (DJR) population, haplotype from which crossbreeding was presumed to have occurred was confirmed. Among the rivers flowing into the East Sea, the S. nigripinnis morii population is known to have been introduced and inhabit only the Hyeongsan River (HSR), and it is presumed to be a population formed by translocation from the Han River (HR) population, with a haplotype representing a unique genetic group also confirmed. The Han River (HR), Geum River (GR), and Mangyeong River (MGR) populations of S. nigripinnis morii formed a genetically identical population with S. czerskii and S. soldatovi distributed north of the Yalu River, and accordingly, a taxonomic reexamination was required through morphological and molecular phylogenetic studies by securing various specimens.

키워드

서론

종(species)은 고유한 특징의 원천인 유전자를 소유한 개체로 구성되며, 개별 개체는 유전적으로 동일하지 않은 DNA의 염기서열에 따라 유전적 다양성을 형성한다(Ellegren and Galtier, 2016: Nonić and Šijačić-Nikolić, 2021). 유전적 다양성은 개체, 개체군 또는 종 내에서 다양한 대립유전자의 풍부함으로 정의될 수 있다. 이 다양성은 돌연변이, 교배, 자연선택 등에 의해 생성되거나 이동에 의해 도입되며, 대립유전자의 빈도는 선택, 이동 및 유전적 부동으로 인해 변경된다(Thormann and Engels, 2015; Nonić and Šijačić-Nikolić, 2021). 유전적 다양성은 생물 다양성의 기초이자 진화의 토대를 제공하므로, 종과 개체군이 환경 변화나 질병 등에 대응할 수 있도록 새로운 형질을 발전시켜는 데 중요한 역할을 하며, 장기적인 생존과 적응 및 회복력 강화하는 데 필수적이다(Barrett and Schluter, 2008; Allendorf et al., 2012; Des Roches et al., 2021; Hvilsom et al., 2022). 또한, 장기적인 진화 과정에서 유전적 다양성을 유지하는 것이, 유전자 내에 숨겨진 다양한 변이를 보존함으로써 현재 같은 종으로 분류되는 개체들이 시간이 지나면서 별도의 종으로 분화될 수 있는 기반을 제공하기 때문이다(NIBR, 2021; Nonić and Šijačić-Nikolić, 2021). 하지만, 전 세계적으로 야생 개체군의 유전적 다양성 감소와 위협이 증가함에 따라, 국제 사회는 종 내 유전적 변이를 포함하여 모든 수준에서 생물다양성을 보존하기 위해 유전적 다양성의 유지를 가장 중요한 목표로 설정하고 많은 노력을 기울이고 있다(White et al., 2007; FAO, 2019; Leigh et al., 2019). 우리나라 또한 국가기관의 주도하에 어류를 포함한 야생 동물자원의 유전자 다양성 연구를 지속적으로 실시하여 결과를 축적하고 있다(NNIBR, 2019; NIBR, 2021; NIE, 2022). 이러한 국내외 상황에 발맞춰 담수어류에 관한 연구도 멸종위기종과 한반도 고유종을 중심으로 유전적 다양성을 분석하고, 분자계통학적 방법을 사용하여 그들의 진화적 관계와 생물지리학적 정착 역사를 규명하려는 연구가 진행되고 있다(Jeon, 2018; Kim, 2020; Kim and Suk, 2020; An et al., 2021; Hong et al., 2023; Jeon and Suk, 2023; Kim et al., 2023, 2024).

우리나라에 분포하는 크고 작은 산맥은 담수어류의 종분화에 중요한 역할을 한 것으로 알려져 있으며, 이러한 지형적 특성은 각 하천수계 간에 유전적 교류를 단절시켜 종 간뿐만 아니라 동일 종 내에서도 서식 수계에 따라 집단 간 사이에 상당한 유전적 차이를 나타낼 수 있다(Kim, 1997; Kim et al., 2003; Kim et al., 2006; Song and Park, 2006; Kim and Song, 2011). 또한 한반도 담수어류의 지리적 분포는 고황하강(Paleo-Hwanghe River), 고아무르강(Paleo-Hwanghe River) 수계의 영향과 고유종의 미세 분포 및 생태적 분포, 산맥의 분수령을 근거로 압록강부터 동진강까지 서해로 흐르는 하천을 포함한 서한아지역, 영산강부터 낙동강까지 서남해로 흐르는 하천과 태화강에서 주수천까지 동해 중·남부로 흐르는 하천을 포함한 남한아지역, 강릉남대천부터 두만강까지 동해 북부로 흐르는 하천을 포함하는 동북한아지역 등 3개의 구역으로 구분하였다(Mori, 1936; Choi, 1973; Jeon, 1980; Kim, 1997). 이러한 지리적 분단 역사와 관련된 지역 간 담수어류의 유전적 차이와 분화에 따른 계통발생학적 관계는 여러 연구자들에 의해 설명되어 왔다(Lee, 1988; Kim et al., 2005; Kim et al., 2012; Kim and Bang, 2012; Kim et al., 2015c; Song, 2015; Kim et al., 2022).

잉어목 Cypriniformes 잉어과 Cyprinidae 모래무지아과 Gobioninae 중고기속 genus Sarcocheilichthys 어류는 한반도에 3종이 서식하고 있다. 압록강에서 섬진강까지 분포하며 형산강에는 이입되어 서식하는 중고기(S. nigripinnis morii)와 임진강에서 낙동강까지 분포하는 참중고기(S. variegatus wakiyae), 그리고 압록강과 만주, 아무르강 수계에도 서식하는 북방중고기(S. czerskii)가 있으며, 중고기와 참중고기는 한반도 고유아종이다(Kim and Lee, 1984a; Kim, 1997; Chae et al., 2019). 중고기속 어류는 전 세계적으로 한반도, 일본, 중국 및 베트남 등의 동아시아에만 서식하며, 최근까지도 분류학적 연구가 진행되어 종 및 아종을 포함하여 16종 내외가 알려져 있다(Nakabo, 2002; Kim et al., 2005; An et al., 2020; Zhang et al., 2020; Li et al., 2022). 중고기속 어류는 다양한 종이 동아시아에만 분포하는 특성상 동아시아 담수어류의 종분화를 이해하는 데 중요한 분류군으로 여겨지며(Zhang et al., 2008), 인접한 중국과 일본은 생물 지리학적 또는 분자계통학적 연구를 통해 분류학적 실체를 규명하기 위한 연구들이 이루어지고 있다(Komiya et al., 2014; Suzuki et al., 2016; An et al., 2020; Ding et al., 2020; Gong et al., 2020; Li et al., 2022). 한국산 중고기속에 관한 연구는 초기 생활사, 산란생태에 관한 연구가 있으며(Kang et al., 2007; Kim et al., 2014a; Yoon, 2016; Jang and Byun, 2018; Park and Han, 2022), 핵형 분석 연구, 미토콘드리아 게놈(genome) 특성화 및 계통발생 분석 연구, 계통과 분자진화 연구가 수행되었다(Lee, 1984; Lee and Song, 2016; Kim, 2020). 하지만, 수계별 집단을 대상으로 한 포괄적인 유전적 다양성에 관한 연구는 아직 이루어지지 않았다.

본 연구에서는 어류의 유전적 다양성과 분자계통학적 연구에 일반적으로 사용되는 미토콘드리아 DNA의 Cytochrome b (cytb) 유전자 영역과 핵 DNA의 Recombination-activating gene 1 (rag1) 유전자 영역을 사용하여(Sonnenberg et al., 2007; Tang et al., 2012; Kim and Bang, 2010; Kim et al., 2012; Bae and Suk, 2015; Li, 2020), 한국산 중고기속 어류의 유전적 다양성을 파악하고 기존에 분자계통학적 연구에서 확인되지 않은 유연관계 분석을 통해 한국산 중고기속 어류의 보전 및 효율적 관리를 위한 기초자료를 제공하고자 하였다.

재료 및 방법

1. 시료확보

한국산 중고기속 어류는 2021년 5월부터 2023년 1월까지 투망(망목 7×7 mm)과 족대(망목 5×5 mm)를 사용하여 채집하였다(Fig. 1, Table 1). 채집한 어류는 Genomic DNA(gDNA) 추출을 위해 어체의 한쪽 가슴지느러미와 배지느러미 1개씩을 절단하여 99.9% 에탄올에 담아 보관하였고, 나머지 어체는 확증표본으로서 10% 포르말린 수용액에 고정하였다.

Fig. 1. Sampling sites and haplotype (Hap) distribution of the Korean Sarcocheilichthys populations(●; S. nigripinis morii, ●; S. variegatus wakiyae). Population ID as Table 1.

Table 1. Sampling localities of the Korean Sarcocheilichthys populations used in this study

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R., River; S., Stream

2. Genomic DNA 분리 및 sequencing

gDNA의 추출은 DNeasy® Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용하여 추출하였다. 추출된 gDNA의 미토콘드리아 DNA의 cytb 유전자 영역(L14724: 5ʹ-GACTTGAARAACCAYCGTTG-3ʹ, H15915: 5ʹ-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3ʹ)과 핵 DNA의 rag1 유전자 영역(1495f3: 5ʹ-CAGTAYCAYAAGATGTACCG-3ʹ, 3067r: 5ʹ-TTGTGAGCYTCCATRAACTT-3ʹ)에 대한 염기서열을 증폭하기 위해 Irwin et al. (1991)과 Kim and Bang (2010)이 보고한 프라이머를 각각 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 초기변성(initial denaturation) 후, 95℃에서 40초간 변성(denaturation), 54℃(rag1, 55℃)에서 40초간 결합(annealing), 72℃에서 1분간 신장(extension)을 35회 반복하였으며, 마지막으로 72℃에서 10분간 최종신장 (elongation)을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 정제(AccuPrep® PCR Purification Kit, BIONEER Corp.) 후 ABI 3730XL DNA Analyzer (Applied Biosystems Inc., Waltham, MA, USA)로 sequencing을 통해 염기서열을 생산하였다.

3. 염기서열 및 집단유전학적 분석

생산된 염기서열은 BioEdit ver. 7.2.5 (Hall, 1999)를 사용하여 다중염기서열정리를 수행하였으며, 최종적으로 결정된 염기서열들은 DnaSP ver. 6.12.03 (Rozas et al., 2017)을 사용하여 유전자형(haplotype, Hap)을 선별하였다. Arlequin ver. 3.5.2.2 (Excoffier and Lischer, 2010)를 이용하여 미토콘드리아 DNA의 cytb 유전자 영역에 대한 각 집단의 단일염기다형성(singlenucleotide polymophism, SNP) 부위 수와 유전자형 다양성(haplotype diversity, Hd) 및 염기 다양성(Nucleotide diversity)을 구하였고, 유전적 분화도(genetic differentiation) 정도를 알아보기 위해 고정지수(F-statistics, FST) 값을 산출하였으며, AMOVA (analysis of molecular variance) 분석을 실시하였다. 또한 유전자형 네트워크(haplotype network)는 PopART ver. 1.7 (Leigh and Bryant, 2015)의 Median joinning network 분석을 통해 시각화하였으며, 유전적 거리(genetic distance)의 추정은 MEGA ver. 11.0.13에서 Kimura-2-Parameter(K2P; Kimura, 1980) 치환 모델로 1,000회의 bootstrapping을 수행하여 추정 값을 산출하였다.

4. 분자계통학적 분석

미토콘드리아 DNA의 cytb 유전자 영역에 대한 분자계통도는 MEGA ver. 11.0.13 (Kumar et al., 2018)을 이용하여 Maximum likelihood (ML) 방법으로 작성하였고, 분지 신뢰도를 높이기 위해 bootstrapping 방법으로 1,000회 반복하였으며, 분지의 지지도가 50% 미만일 경우에는 표시하지 않았다. 또한, Bayesian inference (BI) 분자계통도의 작성은 MrBayes ver. 3.2.7 (Ronquist et al., 2012)을 사용하였고 1×106 세대의 Markov Chain Monte Carlo (MCMC) 분석을 진행한 후, 1,000회마다 무작위로 샘플링하고 초기 25%는 burn-in으로 제거하였다. 이후, 분석된 BI 데이터는 TRACER ver. 1.7.1 (Rambaut et al., 2018)을 사용하여 effective sample size (ESS) 값의 200 초과 여부를 확인하고 사용하였다. 최적 치환 모델은 jModelTest ver. 2.1.10 (Darriba et al., 2012)을 사용하여 Akaike information criterion (AIC)의 값에 따라 선정하였으며, 최적 치환 모델은 GTR+I+G 모델로 ML과 BI 분석 모두 동일하게 적용하였다. 작성된 모든 분자계통도는 Figtree ver. 1.4.4 (Rambaut, 2018)를 통해 시각화하였다.

한국산 중고기속 어류와 중국, 일본 등 동아시아에 분포하는 중고기속 어류 사이의 분자계통학적 유연관계를 확인하기 위하여 NCBI의 GenBank에 등록된 중고기속 어류의 ctyb 유전자 영역의 염기서열을 이용하였으며, 외군(out group)으로는 쉬리(Coreoleuciscus splendidus, DQ267433.1)를 사용하였다(Table 2).

Table 2. Genbank sequence information used for molecular phylogenetic analysis of East Asian Sarcocheilichthys

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결과

1. 염기서열 및 집단유전학적 분석

본 연구에서는 한국산 중고기속에 속하는 중고기 8개 집단의 80개체와 참중고기 5개 집단의 25개체에서 확보한 미토콘드리아 DNA의 cytb 유전자 영역에서 증폭된 1,141 bp의 염기서열을 이용하여 유전적 다양성을 분석하였다(Table 3). 중고기 집단에서는 총 12개의 유전자형(Hap1~Hap12)이 관찰되었으며, 집단별로는 한강(HR), 형산강(HSR), 섬진강(SJR), 영산강(YSR), 탐진강(TJR), 동진강(DJR) 집단이 각각 2개, 금강(GR), 만경강(MGR) 집단이 각각 3개의 유전자형이 확인되었다. 유전자형 다양성은 0.2000±0.1541~0.6000±0.1305의 범위로 한강(HR)과 동진강(DJR) 집단이 낮았고, 금강(GR) 집단이 가장 높았다. 100개(집단별 1~72개)의 단일염기다형성(SNP) 부위가 관찰되었으며, 염기 다양성은 0.0002±0.0003~0.0234±0.0127의 범위로 한강(HR)이 집단 가장 낮았고, 형산강(HSR)과 동진강(DJR) 집단이 높게 나타났다. 참중고기 집단에서는 총 19개의 유전자형(Hap13~Hap31)이 관찰되었으며, 집단별로는 금강(GR)과 영산강(YSR) 집단이 각각 3개, 한강(HR)과 섬진강(SJR) 집단이 각각 4개, 낙동강(NDR) 집단에서 5개의 유전자형이 확인되었으며, 유전자형 다양성이 0.8000±0.1640~1.0000±0.1265의 범위로 모든 집단에서 높게 나타났다. 169개(집단별 4~12개)의 단일염기다형성(SNP) 부위가 관찰되었으며, 염기 다양성은 0.0019±0.0015~0.0046±0.0031 범위로 낙동강(NDR) 집단이 다소 높았으나 전체적으로 낮았다. 한국산 중고기속 어류에서는 총 31개의 유전자형이 관찰되었으며(Table 4), 유전자형 다양성은 참중고기의 낙동강(NDR) 집단이 가장 높았으며, 염기 다양성은 중고기의 형산강(HSR) 집단이 가장 높았다.

Table 3. Genetic diversity summary based on the mitochondrial cytb gene of two Korean Sarcocheilichthys fish

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N, number of samples; SNP, singlenucleotide polymophism sites; h, number of haplotype

Table 4. Distribution of cytb haplotypes obtained at populations of two Korean Sarcocheilichthys fish

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유전적 거리 및 분화도(FST) 분석 결과(Table 5), 중고기 8개 집단 간의 유전적 거리는 0.0007~0.0674로 나타났으며, 한강(HR), 금강(GR), 동진강(DJR), 만경강(MGR) 집단의 유전적 거리는 0.0014~0.0086, 탐진강(TJR), 영산강(YSR), 섬진강(SJR) 집단 간의 유전적 거리는 0.0007~0.0008로 나타나 유전적으로 유사하였으나, 형산강(HSR) 집단의 경우 한강(HR), 금강(GR), 동진강(DJR), 만경강(MGR) 집단과의 유전적 거리는 0.0219~0.0278, 탐진강(TJR), 영산강(YSR), 섬진강(SJR) 집단과의 유전적 거리는 0.0642~0.0644로 나타났다. 유전적 분화도는 섬진강(SJR)과 탐진강(TJR) 집단, 만경강(MJR)과 동진강(DJR) 집단을 제외하고는 FST 값이 낮은 집단 간에도 유의미한 유전적 분화가 확인되었는데(P<0.05), 이 중 만경강(MGR)과 동진강(DJR) 집단은 -0.0027 (P>0.05)로 음의 값을 나타내었고, 한강(HR)과 탐진강(TJR) 집단이 0.9948 (P<0.05)로 높은 수준의 분화도를 나타내었다. 참중고기 5개 집단 간의 유전적 거리는 한강(HR)과 금강(GR) 집단이 0.0248로 유전적으로 유사하였으며, 섬진강(SJR)과 낙동강(NDR) 집단이 0.0452로, 이 두 집단도 상대적으로 유사하였다. 그러나, 영산강(YSR) 집단은 종 내 타 집단들과의 유전적 거리가 0.0869~0.0961로 높게 나타나 유전적 차이가 상당하였고, 중고기의 탐진강(TJR), 영산강(YSR), 섬진강(SJR) 집단과 0.0139~0.0142의 유전적 거리를 나타내며 유전적으로 더 유사하였다. 유전적 분화도는 0.9130~0.9749의 범위로 나타나 집단 간에 높은 수준의 유의미한 유전적 분화도가 확인되었다 (P<0.05).

Table 5. Genetic distance estimated value (above diagonal) and genetic differentiation FST measures(below diagonal) for two Korean Sarcocheilichthys fish based on the mitochondrial cytb gene

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*P <0.05

31개의 유전자형을 기반으로 한 유전자형 네트워크는 한국산 중고기속 13개 집단을 4개의 Group (Group A~Group D)으로 구분하였다(Fig. 2). Group A는 참중고기의 섬진강(SJR)과 낙동강(NDR) 집단, Group B는 참중고기의 한강(HR)과 금강(GR) 집단으로 이루어졌다. Group C는 중고기의 참중고기의 영산강(YSR)과 탐진강(TJR), 영산강(YSR), 섬진강(SJR), 동진강(DJR) 집단으로 구성되었으며, 이 그룹 내에서 중고기의 섬진강(SJR) 집단 대부분은 탐진강(TJR) 및 영산강(YSR) 집단과 Hap4를, 일부는 동진강(DJR) 집단과 Hap5를 공유하였다. Group D는 중고기의 한강(HR), 금강(GR), 만경강(MGR), 동진강(DJR), 형산강(HSR) 집단으로, 한강(HR)은 형산강(HSR) 집단과 Hap1를, 금강(GR)은 만경강(MGR), 동진강(DJR) 집단과 Hap8를 공유하였다. 한편, 중고기의 형산강(HSR) 집단에서 관찰된 Hap3은 어느 집단과도 그룹화되지 않았으며, 중고기와 다르게 참중고기는 집단 간에 공유하는 유전자형이 확인되지 않았다.

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Fig. 2. Haplotype networks of Sarcocheilichthys nigripinis morii (Hap1~Hap12) and S. variegatus wakiyae (Hap13~Hap31) on the mitochondral cytb gene. Circle size indicates the number of individuals examined.

중고기와 참중고기의 각 집단을 그룹화하여 AMOVA 분석을 실시하였다(Table 6). 중고기 집단은 한강(HR), 금강(GR), 만경강(MGR), 동진강(DJR), 형산강(HSR) 집단 그룹과 영산강(YSR), 탐진강(TJR), 섬진강(SJR) 집단 그룹 간에 AMOVA 분석을 수행한 결과, 그룹 간 총 변이는 87.09%, 그룹 내 집단 간 변이는 4.94%, 각 집단 내 개체 간 변이는 7.98%로 나타났다. 참중고기 집단은 한강(HR)과 금강(GR) 집단 그룹, 섬진강(SJR)과 낙동강(NDR) 집단 그룹, 영산강(YSR) 집단 간에 AMOVA 분석을 실시한 결과, 그룹 간 총 변이는 58.24%, 그룹 내 집단 간 변이는 38.37%, 각 집단 내 개체 간 변이는 3.39%로 나타났다.

Table 6. Analysis of molecular variance (AMOVA) for populations of Sarcocheilichthys

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d.f., degree of freedom.

2. 분자계통학적 분석

cytb 유전자을 기반으로 한 ML과 BI의 분자계통도상에서 한국산 중고기속 어류는 높은 부트스트랩 값(bootstrap value; left)과 베이지안 사후 확률(bayesian posterior probabilities; right)을 바탕으로 유사한 분지 패턴을 나타내며, 4개의 Clade (Clade 1~Clade 4)를 형성하였다(Fig. 3). 참중고기의 낙동강(NDR)과 섬진강(SJR) 집단이 Clade 1, 참중고기의 한강(HR)과 금강(GR) 집단이 Clade 2, 중고기의 섬진강(SJR), 동진강(DJR), 탐진강(TJR), 영산강(YSR) 집단과 참중고기의 영산강(YSR) 집단이 Clade 3, 중고기의 형산강(HSR), 한강(GR), 금강(GR), 만경강(MGR), 동진강(DJR) 집단이 Clade 4를 이루며 가까운 유전적 유연관계를 나타냈다.

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Fig. 3. Phylogenetic tree of Korean Sarcocheilichthys using mitochondrial DNA cytb gene. Numbers at nodes indicate ML bootstrap values(left) and Bayesian posterior probabilities(right)>50%, 0.50 (both parameters). Population ID as Table 1.

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Fig. 4. Phylogenetic tree of Korean Sarcocheilichthys using nuclear DNA rag1 gene. Population ID as Table 1.

동아시아에 분포하는 중고기속 어류를 포함한 분자계통도는 6개의 Cluster (Cluster A~Cluster F)를 형성하였다(Fig. 5). 중국에 서식하는 S. lacustris, S. parvus, S. sinensis, S. vittatus와 베트남에 서식하는 S. caobangensis로 이루어진 Cluster A, 일본에 서식하는 S. biwaensis, S. variegatus, S. variegatus microoculus로 이루어진 Cluster B, 참중고기의 섬진강 (SJR)과 낙동강(DNR) 집단으로 이루어진 Cluster C, 참중고기의 한강(HR)과 금강(GR) 집단으로 이루어진 Cluster D, 중고기의 한강(HR), 금강(GR), 만경강(MGR), 형산강(HSR), 동진강(DJR) 집단과 중국에 서식하는 북방중고기, S. soldatovi가 포함된 Cluster E, 중고기의 섬진강(SJR), 영산강(YSR), 탐진강(TJR), 동진강(DJR) 집단, 참중고기의 영산강(YSR) 집단, 중국에 서식하는 S. davidi, S. hainanensis, S. nigripinnis nigripinnis가 포함된 Cluster F를 형성하였다.

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Fig. 5. Phylogenetic tree of East Asia Sarcocheilichthys using mitochondrial DNA cytb gene. Numbers at nodes indicate ML bootstrap values(left) and Bayesian posterior probabilities(right)>50%, 0.50 (both parameters). Population ID as Table 1.

고찰

본 연구는 한국산 중고기속 어류의 13개 집단을 대상으로 cytb와 rag1 유전자 분석을 통해 각 집단의 유전적 다양성과 구조, 유전적 유연관계를 살펴보았다. 연구 대상인 중고기 8개 집단과 참중고기 5개 집단에서 총 31개의 유전자형이 확인되었으며, 참중고기 집단이 중고기 집단에 비해 분석에 사용된 개체수가 적음에도 불구하고, 전체 및 각 집단에서 더 많은 유전자형이 관찰되었다. 특히, 참중고기 집단은 중고기 집단과 달리 집단 간에 공유하는 유전자형이 없는 것으로 확인되었으며, 집단별로 높은 수준의 유전자형 다양성(0.8000±0.1640~1.0000±0.1265)을 나타냈다. 이는 참중고기의 각 집단이 중고기 집단보다 유전적으로 더 분리되었을 가능성을 제시하며, 다양한 유전적 특성을 지니고 있음을 시사한다. 염기 다양성은 중고기의 형산강(HSR)과 동진강(DJR) 집단이 종 내 다른 집단 및 참중고기 집단들과 비교할 때 높은 염기 다양성을 보여 주목되었으나, 전반적인 한국산 중고기속 어류의 염기 다양성은 낮은 수준이었다. 유전자형 다양성과 염기 다양성은 유전적 변이를 이해하는 중요한 지표이며, 추정된 수치가 클수록 집단 내부와 집단 간의 유전적 변이와 유전적 다양성이 높음을 의미한다(Falush et al., 2003; Liu and Zhang, 2009; Liu, 2017; Jiang et al., 2019). 그러나 한국산 중고기속의 어류와 같이 유전자형 다양성은 높고, 염기 다양성이 낮게 관찰되는 현상은 개체군이 병목 현상을 겪은 이후 개체군의 급격한 증가와 이에 따른 돌연변이 축적이 원인일 가능성이 있다(Grant and Bowen, 1998). 따라서 이러한 현상과 한국산 중고기속 어류의 유전적 다양성을 보다 정확히 파악하기 위해 핵 DNA의 미세부수체(microsatellite) 마커를 이용한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.

한반도 담수어류는 지리적 분포구계에 따라 서론에서 전술한 3개의 하위 구역으로 나뉘는데, 본 연구의 한강(HR), 금강(GR), 동진강(DJR), 만경강(MGR) 집단은 서한아지역, 탐진강(TJR), 영산강(YSR), 섬진강(SJR), 낙동강(NDR), 형산강(HSR) 집단은 남한아지역에 포함된다. 중고기 집단들은 유전적 거리 및 분화도(FST) 분석 결과에서 이입되어 서식하는 것으로 알려진 형산강(HSR) 집단을 제외한 이외 집단들은 서한아지역의 집단들과 남한아지역의 집단들이 동일 지역 내에서 유전적으로 매우 유사한 것으로 나타났으며, 두 지역 집단들 간에는 유전적으로 큰 차이를 나타내, 한반도 담수어류의 지리적 분포구계 패턴에 따라 구분되었다. 한편, 형산강(HSR) 집단은 지리적으로 가깝거나 동일 지역인 남한아지역 집단들과 유전적으로 유사할 것이라 예상되었으나, 서한아지역의 집단들과 유전적으로 더 유사한 것으로 확인되었다. 또한, 만경강(MGR)과 동진강(DJR) 집단은 유전적 분화도가 음의 값(FST= -0.0027)을 나타내며 유전적으로 동일한 집단임을 의미하였는데, 한강(HR) 집단은 동진강(DJR) 집단과는 낮은 수준의 유전적 분화도(FST=0.1779)가 나타난 반면 만경강(MGR) 집단은 유전적으로 유사하였으나 높은 분화도(FST=0.8696)를 나타내 차이를 보였다. 참중고기 5개 집단은 유전적 거리 분석 결과에서 서한아지역의 한강(HR)과 금강(GR) 집단, 남한아지역의 섬진강(SJR)과 낙동강(NDR) 집단은 유전적으로 유사하였으나, 영산강(YSR) 집단은 이외 집단들과 유전적으로 큰 차이를 나타낸 반면 중고기의 탐진강(TJR), 영산강(YSR), 섬진강(SJR) 집단과는 유전적으로 더 유사한 것으로 확인되었다. 유전적 분화도(FST)는 지역과 관계 없이 집단 간 높게 나타났으며, 공유되는 유전자형이 없어 집단 간에 상당한 유전적 분화가 발생하였음을 시사하였다. AMOVA 분석 결과 또한 두종 모두 지역 그룹 간에 높은 유전적 변이를 나타내며 위의 분석 결과들을 잘 반영하였다.

한국산 중고기속 어류의 13개 집단은 cytb 유전자에서 확인된 31개의 유전자형을 기반으로 한 분자계통도상에서 크게 4개의 유전적 Clade (Clade 1~4)로 구분되었다. 참중고기의 섬진강(SJR)과 낙동강(NDR) 집단이 Clade 1, 한강(HR)과 금강(GR) 집단이 Clade 2, 참중고기의 영산강(YSR) 집단과 중고기의 영산강(YSR), 탐진강(TJR), 섬진강(SJR), 동진강(DJR) 집단이 Clade 3, 중고기의 한강(HR), 금강(GR), 만경강(MGR), 동진강(DJR), 형산강(HSR) 집단이 Clade 4를 형성하였다. 이러한 계통학적 구분에서 다음과 같은 특이점이 확인되었는데, Clade 1, 2, 4는 중고기와 참중고기가 유전적으로 뚜렷하게 구분되며 종 내에서의 유전적 유연관계를 명확히 나타냈으나, Clade 3은 참중고기의 영산강(YSR) 집단과 중고기의 영산강(YSR), 탐진강(TJR), 섬진강(SJR), 동진강(DJR) 집단이 분자계통도상에서 분지되어 나타났지만, 높은 부트스트랩 값과 베이지안 사후 확률에 의해 Clade로 묶이며 현재의 분류체계와 일치하지 않는 유전적 유연관계를 나타내었다. 이는 유전적 거리 분석 결과와도 부합하였으며, 참중고기의 영산강(YSR) 집단과 중고기의 영산강(YSR), 탐진강(TJR), 섬진강(SJR), 동진강(DJR) 집단 간의 염기서열 변이는 약 1.6% (18개)로 나타나 동일 종 수준의 유사성을 보였다. 한편, 핵 DNA의 rag1 유전자를 기반으로 한 분자계 통도상에서는 cytb 분자계통도 결과와 달리 참중고기와 중고기가 뚜렷하게 구분되어 나타나(Fig. 4), 미토콘드리아 및 핵 DNA가 분자계통도상에서 상충되는 mitonuclear 불일치 현상이 확인되었으며, 이는 Kim (2020)의 결과와도 일치하였다. 이러한 현상은 교잡(hybridization), 유전자 이입(introgression), 불완전한 계통 분류(incomplete lineage sorting), 선택 압력(selection pressure), 그리고 지질학적 및 인위적 요인 등 다양한 원인들로 발생할 수 있다(Gerber et al., 2001; Larmuseau et al., 2010; Perea et al., 2016; Wallis et al., 2017; Campbell et al., 2022). 특히 어류에 대한 분자계통학적 연구에서 지속적으로 보고되어 왔으며, 해양어류에 비해 교잡이 빈번히 발생하는 담수어류에서 더 흔히 관찰되는 경향이 있다(Šlechtová et al., 2008; Lee, 2009; Yoon, 2009; Larmuseau et al., 2010; Wallis et al., 2017). 위 결과를 종합하여 보면, 영산강(YSR) 수계 내에서 중고기와 참중고기 간 교잡이 빈번하게 발생하여 잡종을 생성하였고, 역교배에 의해 미토콘드리아 DNA상에 유전자 이입이 발생한 것으로 판단되었다(Rhymer and Simberloff, 1996; Allendorf et al., 2001; Hallerman, 2003; Hohenlohe et al., 2010; Muhlfeld et al., 2014; Kim, 2020). 자연 잡종은 어류에서 폭넓게 일어나며, 특히 잉어과 어류에서 빈번하게 발생한다고 알려져 있다(Hubbs, 1955; Kim et al., 2015b; Scribner et al., 2000; Corush et al., 2021). 중고기속 어류 또한 최근 자연 잡종 사례가 보고된 바가 있으며(Kim, 2020), 담수 이매패류(bivalves)를 산란숙주로 삼아 체내에 알을 낳는 동일한 산란 습성을 가진 납자루아과(Acheilognathinae) 어류의 교잡 사례는 흔하게 관찰되어 왔다(Kim et al., 2014b, 2015a; Chae et al., 2019; Hata et al., 2019; Kwak et al., 2020; Kim et al., 2021).

중고기 집단들은 앞서 전술한 바와 같이 형산강(HSR) 집단을 제외하고는 한반도 담수어류의 지리적 분포구계와 일치하는 유전적 구조를 나타냈으나, 동진강(DJR) 집단은 Clade 3에서 남한 아지역의 섬진강(SJR) 집단과도 가까운 유전적 유연관계를 나타냈으며, 유전자형 네트워크상에서 일부 유전자형(Hap5)을 공유하는 것으로 확인되었다. 또한, rag1의 electropherogram 분석 결과에서 동진강(DJR)과 섬진강(SJR) 집단의 일부 개체에서 단일염기다형성(SNP) 부위 모두에서 double peaks 양상이 나타나, 이입으로 집단 간 교배가 일어난 것으로 추정되는 유전자형이 확인되었다(Fig. 6). 이러한 결과는 이전 연구에서 그 원인을 확인할 수 있었는데, 1931년과 1945년에 섬진강(SJR) 상류의 옥정호와 동진강(DJR)의 상류를 잊는 도수터널이 건설되었으며, 연결 지점 간 고도 차이로 인해 물이 섬진강(SJR)에서 동진강(DJR)으로 단방향으로 흘러 들어감에 따라 어류군집 변화가 발생하였고, 섬진강(SJR)의 고유종 줄종개 Cobitis tetralineata가 이입되어 동진강(DJR)에 서식하던 점줄종개 C. nalbanti 사이에 종 간 잡종이 확인되었다(Kim and Lee, 1984b). 중고기 또한 동일한 경로로 섬진강(SJR) 집단이 동진강(DJR) 집단에 이입되어 교배가 이루어진 것으로 판단된다. 한편, Kwan et al. (2014)은 동진강(DJR)의 점줄종개와 섬진강(SJR)의 줄종개 사이에 2차 접촉으로 생성된 잡종 개체들이 역교배를 통해 동진강(DJR)에 서식하는 점줄종개의 유전자 풀(gene pool)이 줄종개의 유전자 풀로 빠르게 대체되며 토종 집단의 유전자 소멸(genomic extinction) 가능성을 예측된 바 있어, 동진강(DJR) 중고기 집단에 대한 유전적 모니터링 연구가 필요할 것으로 판단된다.

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Fig. 6. Electropherograms to the nuclear DNA rag1 gene shown clear evidence of natural intra-species hybrid of Dongjingang river and Seomjingang river S. nigripinis morii. Double peaks indicate by red arrows.

Clade 4에서 중고기의 형산강(HSR) 집단은 한강(HR) 집단과 유연관계가 가까운 것으로 나타났으며, 유전자형 네트워크 상에서 일부 유전자형(Hap1)을 공유하는 것으로 확인되었다. 중고기는 동해로 유입되는 하천 중 유일하게 형산강(HSR)에만 이입되어 서식하는 것으로 알려져 있으나, 어떤 집단이 이입되었는지 명확히 밝혀진 바가 없다. 본 연구 결과에 따르면, 한강(HR) 집단으로부터 이입되어 형성된 집단으로 추정되지만 정확한 이입 경로나 시기를 뒷받침할 문헌자료나 사례를 확인할 수 없었고, 일부 유전자형(Hap3)은 고유한 유전적 그룹으로 확인되어, 추후 다양한 지점에서 시료를 확보하여 추가적인 유전학적 분석이 필요하다.

동아시아에 분포하는 중고기속 어류의 ctyb 유전자를 기반으로 한 분자계통도에서, 한국산 중고기속 어류는 중국에 서식하는 북방중고기, S. davidi, S. hainanensis, S. kiangsiensis, S. nigripinnis, S. soldatovi와 최근 조상형을 공유하며 Cluster C~Cluster F로 분지되어 나타났다. 참중고기는 한국산 중고기 속 분자계통도와 유사한 양상으로 독립된 유전적 그룹으로 나타났으나, 중고기의 경우 동진강 이북의 집단(Cluster E, 형산강 제외)들은 북방중고기와 S. soldatovi와 유전적으로 동일 집단을 형성하였으며, 이외 집단(Cluster F)들은 S. davidi, S. hainanensi, S. nigripinnis와 유전적 유연관계 가까운 것으로 나타났다. 과거에 북방중고기는 임진강, 한강에 서식한다고 하였으나(Mori, 1927), 현재까지 확인된 바가 없으며 한반도에는 압록강에 서식하는 것으로 알려져 있다(Kim and Lee, 1984a; Chae et al., 2019). 한편 북방중고기와 S. soldatovi는 중고기와 형태학적 유사성으로 인해 분류학적으로 혼란을 일으켰으나 많은 연구자들에 의해 유효한 종으로 기재되었으며(Bănărescu and Nalbant, 1967; Luo et al., 1977; Yue et al., 1998), 여러 연구자들에 의해 받아들여져 왔다(Kottelat, 2006; Bogutskaya et al., 2008; An et al., 2020). 하지만 최근에 Li et al. (2022)은 형태 및 분자계통학적 분석을 통해 북방중고기와 S. soldatovi를 동종이명 처리하며 S. sciistius로 제안하였고 아직까지 유효명으로 기재되진 않았다. 이러한 분포 역사와 분류학적 과정으로 볼 때 서한아지역에 서식하는 중고기의 다양한 표본을 확보하여 형태학적 및 분자계통학적 연구를 통한 분류학적 재검토가 필요할 것으로 사료된다.

사사

시료확보에 도움을 주신 보령민물생태관 조성장 관장님과 물들이연구소 성무성 대표에게 깊은 감사의 말씀을 전합니다.

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