Huh7 간암세포에서 민들레 추출물의 상피간엽전환 억제를 통한 항전이 효과

Anti-metastatic Effect of Taraxacum Officinale Water and Ethanol Extracts Through the Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition in Huh7 Cells

Abstract

Purpose : Epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) is recognized as an important cellular response in metastatic proceduresand characterized by loss of cellular polarity as well as gain of mesenchymal features, which enables migration and invasion. Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common primary carcinomas in the liver and exhibits a poor prognosis due to frequent extrahepatic metastasis. Taraxacum officinale has been used for a long time in oriental medicine because of its various pharmacological activitiessuch as anti-rheumatic, anti-inflammatory, antioxidative, and anticarcinogenic activities. In this study, the anti-metastatic activity of T. officinale water extract (TOWE) and ethanol extract (TOEE) was investigated through the regulation of EMT in the Huh7 cells. Methods : The effects of TOWE and TOEE on migratory and invasive activities were investigated by wound healing and in vitro invasion assays. Western blot analysis was also applied to analyze protein expression levels associated with EMT and their upstream transcription factors in Huh7 cells. Results : TOWE and TOEE treatment potently inhibited migration and invasion of Huh7 cells compared to the untreated group. Both extracts treatment inhibited protein expression levels of N-cadherin, matrix metalloproteinase (MMP)-9, and vimentin while E-cadherin was significantly accelerated. In addition, the activated status of transcription factors, Snail, nuclear factor (NF)-κ B, and zinc finger E-box binding homeobox (ZEB)1 was also inhibited with statistical significance. In comparison to both extracts, TOEE more potently attenuated migration, invasion, and EMT markers as well as their transcription factors in Huh7 cells than TOWE, which means that TOEE might possess more functional phytochemicals than TOWE. Conclusion : Consequently, TOWE and TOEEattenuated metastatic activity of hepatocellular carcinoma through the regulation of EMT markers and their transcription factors in Huh7 cells, which means that T. officinale might be a promising strategy for a chemopreventive agent against HCC metastasis.

Ⅰ. 서론

1. 연구의 배경 및 필요성

원발성 간암 중 90 %를 차지하는 가장 주요한 형태의 암종인 간세포암(hepatocellular carcinoma)은 높은 전이 위험도로 인해 예후가 좋지 않은 것으로 보고되고 있으며 이들은 주로 폐, 림프절, 뼈 등으로 전이된다(Samant 등, 2021). 원발암에서 원격장기로의 전이과정에서 종양 세포가 보이는 특징 중 하나는 상피간엽전환(epithelial-mesenchymal transition; EMT)으로 상피세포의 특성을 잃고 중간엽세포의 특성을 나타내는 것을 말한다. EMT에서 나타나는 일반적인 특징은 E-cadherin의 발현 감소와 N-cadherin의 발현 증가이고, cadherin switch라 불리는 이것으로 인해 암세포의 migration과 invasion이 증가하는 것으로 알려져 있다(Guarino 등, 2007). 이 과정에서 암종세포는 상피세포에서 나타나는 특성인 세포간 부착능력을 잃고 유리형의 세포로 바뀌면서 동시에 침투성을 얻어 중간엽세포로 분화하며 세포의 외형 또한 원형에서 방추형 모양으로 바뀌게 되면서 중간엽세포의 특성을 나타낸다(van Zijl 등, 2009). 정상적인 조직의 발달과 염증의 유발에도 관여하는 것으로 알려진 EMT는 특히 전이가 나타나는 암의 진행 단계에서 보이는 두드러진 특징이다. 상피세포의 마커인 E-cadherin의 발현 감소는 세포와 세포 또는 세포와 기질간 부착을 약화시키고, 중간엽세포의 특징인 vimentin과 N-cadherin의 발현 증가는 세포의 운동성과 침윤을 촉진하여 종양 세포의 악성도를 높이는 것으로 알려지고 있다(Rubtsova 등, 2022). 또한 matrix metalloproteinase (MMP)-9과 같은 효소의 활성은 세포외기질을 분해하고 EMT 과정의 자극을 통해 종양세포의 전이에 중요한 역할을 한다(Li 등, 2020). 그리고 이러한 EMT 마커들과 전이를 촉진시키는인자들의 발현은 전사인자인 Snail, nuclear factor (NF)-κB와 zinc finger E-box binding homeobox(ZEB)1의 활성에 의해 조절된다(Lamouille 등, 2014). 그러므로 Snail, NF-κB와 ZEB1의 활성 조절을 통해 EMT 관련 마커들과 전이를 촉진시키는 인자들의 발현을 조절하면 종양세포의 전이능을 조절할 수 있을 것으로 생각된다.

서양 민들레(Taraxacum officinale)는 이뇨, 항염증, 항산화 및 항암효과가 있는 것으로 알려져 동양의학에서 오래전부터 약재로 이용되어 왔고, 특히 최근에는 간기능 개선과 관련된 다양한 활성이 검증되면서 기능성 식품의 소재로 활용되고 있다(Park, 2011; Schütz 등, 2006). 특히, 항암활성 측면에서는 T. japonicum의 뿌리 열수 추출물과 추출물에서 분리한 taraxasterol, taraxerol이 생쥐에서 유발된 피부암의 개시와 촉진을 강하게 억제하였고, taraxasterol은 유방암의 발생 또한 억제하였다(Takasaki 등, 1999a; Takasaki 등, 1999b). T. officinale 열수 추출물은 간암세포주인 HepG2에 세포독성을 유발하고, 염증성 싸이토카인의 분비를 촉진시켜 세포자멸사를 유도하였다(Koo 등, 2004).

따라서, 다양한 생리 활성이 보고된 T. officinale로부터 열수 추출물(T. officinale water extract, TOWE)와 에탄올 추출물(T. officinale ethanol extract, TOEE)을 준비하고, 간세포암 세포주인 Huh7 세포에 대한 항전이능을 EMT 기전을 중심으로 분석하였다.

2. 연구의 목적

본 연구에서는 T. officinale을 이용하여 열수 추출물(TOWE)과 에탄올 추출물(TOEE)을 준비하고, 인간 간세포암 세포주인 Huh7 세포에 대한 두 추출물의 항전이능과 기전을 비교분석함으로써, 간세포암 전이 억제에 효과적인 기능성 소재로서 민들레 추출물의 활용 가능성을 검증하고자 하였다.

Ⅱ. 연구방법

1. 실험재료

인체 간세포암 세포주(human hepatocellular carcinoma cell line)인 Huh7 세포는 한국세포주은행(Korea)에서 분양받아 영양성분인 fetal bovine serum(FBS, Cytiva, Marlborough, USA)의 농도를 10 %로, 항생제인 penicillin/streptomycin(Cytiva)을 첨가하여 complete medium을 제조하여 37 ℃, 5 % CO₂, 가습조건에서 배양하였다. 민들레 열수 추출물과 에탄올 추출물은 기존의 연구와 동일한 방법으로 준비하였다(Yoon & Park, 2019). Western blot 분석을 위한 1차 항체인 epithelial(E)-cadherin, neural (N)-cadherin, MMP-9, vimentin, Snail, phospho-p65, ZEB1, actin과 2차 항체인 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-rabbit IgG는 Cell Signaling Technology(Boston, MA, USA)에서 구입하여 1:1,000의 비율로 희석하여 사용하였다.

2. Wound healing assay

Huh7 세포를 6-well plate에 파종하고 24시간 동안 부착한 후 10 ㎕ micropipet tip을 이용하여 plate의 바닥을 긁어 wound를 형성하였다. 그리고 TOWE와 TOEE를 500 ㎍/㎖의 농도로 24, 48시간 동안 배양하면서 시간별 세포의 이동 정도를 위상차 현미경(Eclipse TS 100, Nikon, Japan)으로 관찰하여 결과를 비교분석하였다.

3. In vitro invasion assay

Invasion 분석이 가능한 transwell(8 ㎛ pore, Corning Inc, USA)의 위쪽 챔버에 Huh7 세포를 serum free DMEM에 500 ㎍/㎖의 TOWE, TOEE를 함께 처리하고, 아래쪽 챔버에 complete medium을 위치하게 한 후 24시간 동안 배양하였다. 이동한 세포를 확인하기 위하여 위쪽 챔버에 남아있는 세포는 면봉으로 제거하고 transwell membrane의 하단으로 이동한 세포는 .1 % crystal violet으로 염색하였다. 그리고 광학현미경(Leica DM3000, Leica biosystems, Germany)으로 관찰하여 결과를 비교분석하였다.

4. Western blot analysis

Huh7 세포를 100 ㎜ dish에 파종하고 24시간 동안 부착한 후 TOWE와 TOEE를 250, 500 ㎍/㎖의 농도로 24시간 동안 처리하여 세포내 EMT관련 단백질의 변화를 분석하였다. 시료 처리가 끝난 Huh7 세포로부터 protein lysis buffer(PRO-PREP, Intron Biotechnology, Korea)를 이용하여 단백질을 추출하였고, 농도는 Bradford법으로 결정하였다. 전기영동을 위한 시료의 준비는 추출된 50 ㎍의 단백질과 loading buffer인 4x laemmli buffer(Bio-Rad Laboratories, Inc. USA)를 섞은 후 10 % SDS-polyacrylamide gel에 전기 영동을 진행하였다. 전기영동이 완료된 SDS-PAGE gel은 polyvinylidene fluoride(PVDF, Bio-Rad Laboratories, Inc. USA) membrane으로 transfer 후 5 % non-fat dry milk가 포함된 PBST를 사용하여 non-specific binding을 줄이기 위한 blocking을 수행하였다. 그리고 membrane은 4 ℃에서 24시간 동안 1차 항체와 반응을 진행한 후 2차 항체와 실온에서 2시간 동안 반응을 수행하였다. 반응이 완료된 membrane은 enhanced chemiluminescence solution(ECL, Santa Cruz Biotechnology, USA)을 이용하여 ChemiDoc XRS+system(Bio-Rad Laboratories, Inc. USA)에서 단백질 발현의 변화를 측정하고 Gel Doc EQ system(Bio-Rad Laboratories, Inc. USA)으로 발현도를 정량 분석하였다.

4. 통계적 방법

실험은 3회 반복 시행한 값을 평균±표준편차(mean±SD)로 표시하였다. 통계적 유의성 분석을 위하여 SPSS 프로그램(version 26.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 일원배치 분산분석법(one-way ANOVA)을 사용하였고, 사후 검증은 Duncan 방법을 이용하였으며 통계적인 유의수준은 .05로 하였다.

Ⅲ. 결과

1. TOWE와 TOEE에 의한 Huh7 세포의 migration과 invasion 억제 효과

Huh7 세포는 강한 침윤과 전이능을 보이고, 이로 인해 세포의 migration과 invasion 활성도 강하게 나타난다(Seo 등, 2021). 따라서 TOWE와 TOEE의 항전이능을 알아보기 위하여 두 추출물이 migration에 미치는 영향을 먼저 분석하였다. Fig 1에서 보는 것과 같이 500 ㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때 시간이 경과함에 따라 세포의 migratory activity에 의해 untreated cell의 경우 wound healing이 많이 이루어졌다. 그러나 500 ㎍/㎖의 농도로 TOWE와 TOEE가 처리된 세포의 경우, 세포의 migration이 현저히 떨어져 wound healing이 많이 일어나지 않는 것을 볼 수 있었다. 그리고 두 추출물을 비교했을 때 TOEE가 TOWE보다 강한 wound healing activity를 보이는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 바탕으로 침윤 억제 효과를 in vitro에서 분석하기 위하여 8 ㎛의 pore size를 가진 transwell membrane을 이용하였다. Fig 2에서 보는 것과 untreated cell은 transwell membrane을 통과하여 아래쪽 챔버로 많은 수의 세포가 이동하였으나 TOWE와 TOEE를 처리한 경우 이동한 세포의 수가 급격하게 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과를 통해 TOWE와 TOEE는 Huh7 세포의 migration과 invasion을 효과적으로 억제할 수 있는 능력을 가지고 있음을 알 수 있었다.

Fig 1. Inhibitory effect of TOWE and TOEE on wound healing in Huh7 cells

Fig 2. Inhibitory effect of TOWE and TOEE on matrigel invasion in Huh7 cells

2. Huh7 세포에서 TOWE와 TOEE의 EMT 관련 마커의 조절을 통한 전이 억제 효과

Wound healing assay와 in vitro invasion assay의 결과를 통해 TOWE와 TOEE는 Huh7 세포가 보이는 침윤과 전이능을 억제하는 활성을 가지고 있는 것으로 판단할 수 있었다. 따라서 이러한 활성이 TOWE와 TOEE의 EMT 관련 단백질 발현 조절에 기인한 것인지를 확인하기 위하여 Huh7 세포에서 추출한 단백질을 Western blot analysis를 활용하여 분석하였다. Cadherin switch를 구성하는 E-cadherin, N-cadherin, 그리고 중간엽 줄기세포의 지표인 vimentin과 세포외기질을 분해할 수 있는 효소인 MMP-9의 발현량을 확인한 결과 Fig 3에서 보는 것과 같이 TOWE와 TOEE의 처리에 의해 E-cadherin의 발현량은 유의적으로 증가하였고, N-cadherin의 발현은 TOEE의 처리로 감소하는 결과를 보였으며, 이를 통해 TOWE와 TOEE는 cadherin switch를 ‘OFF’하는 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다. 또한 vimentin과 MMP-9의 발현 억제를 통하여 중간엽 줄기세포로의 전환을 억제하고 세포외기질의 분해 억제를 통해 종양세포의 전이를 조절할 수 있는 것으로 나타났다.

Fig 3. Regulatory effect of TOWE and TOEE on the expressions of E-cadherin, N-cadherin, vimentin, and MMP-9 in Huh7 cells

3. Huh7 세포에서 EMT 관련 전사인자의 활성 조절을 통한 TOWE와 TOEE의 전이 억제 효과

Snail, NF-κB와 ZEB1은 EMT 과정을 촉진하는 전사인자들로 이들 전사인자의 활성으로 종양세포의 EMT 활성이 증가하고, 따라서 종양세포가 강한 침윤능과 전이능을 보이는 것으로 보고되고 있다(Lamousille 등, 2014). 본 연구에서는 TOWE와 TOEE가 전사인자들의 발현에 미치는 영향을 Western blot analysis로 분석한 결과 Fig 4에서 보는 바와 같이 untreated cell에서는 Snail, NF-κB와 ZEB1의 활성이 강하게 나타나는 반면, TOWE와 TOEE의 처리에 의해 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 두 추출물간의 활성 비교에서는 TOEE가 TOWE보다 전사인자들을 더 강하게 억제하는 것으로 나타났다. 이 결과들로 미루어보아 TOWE와 TOEE는 cadherin switch 조절과 vimentin의 활성 억제를 통해 Huh7 세포의 중간엽세포로의 전환을 억제하고, 종양세포 주변을 구성하고 있는 세포외기질의 융해에 관여하는 효소인 MMP-9의 활성을 조절함으로써 종양세포의 침윤능과 전이능을 억제하는 것으로 나타났다. 그리고 이러한 EMT 관련 마커들의 발현 조절은 이들의 전사인자인 Snail, NF-κB와 ZEB1의 활성 억제를 통해서 이루어지는 것을 알 수 있었다.

Fig 4. Regulatory effect of TOWE and TOEE on the expressions of transcription factors, including Snail, NF-κB, and ZEB1 in Huh7 cells

Ⅳ. 고찰

진단되는 악성 신생물 중 여섯번째로 흔하게 발생하는 원발성 간암은 많은 사례들이 간세포암의 형태로 나타나고, 세계에서는 두 번째로 높은 사망률을 보여줄 뿐만 아니라 절제술 등의 치료 후에도 재발율이 높아 예후가 나쁜 것으로 알려져 있다(Guarino 등, 2007). 이러한 통계는 우리나라에서도 동일하게 나타난다(Kang 등, 2023). 특히, 발생하는 간암의 97 %가 암종이고 그 중 76 %는 간세포암일 정도로 발생 건수도 또한 많은 것으로 보고되고 있다(Portolani 등, 2006). 간세포암의 초기 재발암은 주로 기관 내 전이로 이루어지고 후기 재발암은 다양한 경로를 통해 전이되어 발생한다(Gilles 등, 1999; Mani 등, 2008). 그러므로 본 연구에서는 간질환에 효과적인 것으로 알려진 서양 민들레(T. officinale)의 열수 추출물과 에탄올 추출물이 EMT 기전 조절을 통해 간세포암의 전이를 억제하는지를 알아보고자 하였다.

악성 종양의 전이는 암세포가 보여주는 강한 운동능으로 인해 획득되는 경우가 많아 본 연구에서는 wound healing과 in vitro invasion assay를 TOWE와 TOEE의 Huh7 세포의 운동능 억제 효과를 확인하고자 하였다. 연구 결과 Huh7 세포의 운동성으로 인해 micropipet tip으로 발생한 wound healing이 시간이 경과함에 따라 많이 이루어졌으나 TOWE와 TOEE를 처리한 Huh7 세포의 운동성은 현저히 떨어져 untreated cell과 비교하였을 경우 wound healing이 제대로 이루어지지 않은 것을 확인할 수 있었다. 또한 in vitro invasion assay에서도 TOWE와 TOEE를 처리한 세포의 transmembrane 효과가 untreated cell과 비교 시 현저히 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 TOWE와 TOEE는 Huh7 세포의 운동성의 억제를 통해 전이를 조절할 수 있는 능력이 있음을 알 수 있었고, 두 물질 간의 비교에서는 에탄올 추출물인 TOEE가 열수 추출물인 TOWE보다 강한 활성을 보이는 것은 유기용매를 이용한 추출이 지용성 활성 성분의 추출에 유리하기 때문인 것으로 생각된다.

TOWE와 TOEE가 보여준 Huh7 세포의 운동능 억제 효과가 전이를 조절할 수 있는 활성이 있는지를 알아보기 위하여 EMT와 관련된 마커들의 발현을 Western blot으로 분석하였다. 종양세포가 EMT 과정에서 보여주는 중요한 변화 중 하나는 세포간의 접합에 관여하는 세포막 표면 단백질인 E-cadherin의 발현이 줄어들고 중간엽 세포의 특성 중 하나인 N-cadherin의 발현이 늘어나는 cadherin switch가 작동하는 것이다(Noronha 등, 2021). 또한 상피세포에서는 발현되지 않고 중간엽세포에서 강하게 나타나는 vimentin은 미세섬유, 미세소관과 함께 세포의 구조와 기능을 유지하는 세포 골격의 구성요소를 구성하고, 암전이과정에서 과발현되는 것으로 확인되어 type 3 EMT의 주요한 마커로 활용되고 있다 (Usman 등, 2021). MMP는 종양미세환경의 조절에 관여하는 중요한 효소로서 세포외기질을 분해함으로써 종양세포의 이동 공간을 확보하고 세포막 부착단백질인 E-cadherin을 분해하여 종양세포가 원발암 종괴에서 쉽게 유리될 수 있도록 할 뿐만 아니라 integrin을 활성화함으로써 원격 장기의 표면의 부착을 용이하게 하여 전이율을 높이는 역할을 한다(Augoff 등, 2022). 그 중 MMP-9은 세포외기질과 바닥막의 분해를 위한 핵심 효소 중 하나로 상처치유 및 조직복구에 관여하지만, 종양의 발생과 발달, 침윤, 전이와 혈관신생에서도 중요한 역할을 하므로 악성 종양의 치료를 위한 중요한 표적이 되고 있다(Kim 등, 2010). 본 연구에서 cadherin switch, vimentin, MMP-9의 발현을 분석한 결과 TOWE와 TOEE의 처리에 의해 E-cadherin은 증가하고 N-cadherin의 발현이 감소하는 cadherin swith가 ‘OFF’되는 경향이 있음을 알 수 있었고, 중간엽 줄기세포의 특징인 vimentin의 발현과 종양조직 주변의 세포외기질을 분해하는 MMP-9의 발현 또한 억제되었다. 이 결과를 통해 TOWE와 TOEE는 EMT와 관련된 단백질의 발현을 억제하여 Huh7 세포의 전이를 조절할 수 있음을 알 수 있었다.

종양세포의 EMT 진행과정에서 발생하는 다양한 마커들의 발현 조절에는 Snail, Slug, Twist, ZEB 등과 같은 여러 전사인자들이 관여되어 있고, 이들 전사인자의 활성 조절을 통해 상피세포의 부착력을 결정하는 인자 중 하나인 E-cadherin을 억제하고 중간엽세포의 특징인 N-cadherin과 vimentin의 활성을 촉진할 뿐만 아니라 원발암 종양조직 주변을 구성하는 세포외기질의 재구성에 관여하는 MMP의 활성에도 관여하는 것으로 알려져 있다(Tania 등, 2014). 또한 염증 매개 물질의 발현에 주요한 역할을 하는 것으로 알려진 염증 전사인자 중 하나인 NF-κB도 EMT 진행과정에서 EMT 관련 전사인자들과 유사한 역할을 하는 것으로 알려지고 있다(Lamousille 등, 2014). Huh7 세포에 TOWE와 TOEE를 처리한 결과 이 전사인자들의 활성은 유의하게 억제되었다. 또한 전이 마커들과 전사인자의 활성 억제능을 비교하였을 때, TOEE가 TOWE보다 전체적으로 더 강한 활성을 보이는 것을 알 수 있었고, 이는 유기용매에 더 많은 활성 성분이 추출되기 때문인 것으로 사료된다.

결론적으로 TOWE와 TOEE는 E-cadherin, N-cadherin, vimentin, MMP-9의 발현과 이들의 전사인자인 Snail, ZEB1, NF-κB의 활성을 억제하여 Huh7 세포의 전이능을 억제하는 것으로 나타났다.

Ⅴ. 결론

간질환에 효과적인 것으로 알려진 서양 민들레로부터 열수(TOWE)와 에탄올(TOEE)을 이용한 추출물을 준비하고 간세포암 세포주인 Huh7 세포의 전이 억제 효과를 EMT 기전을 중심으로 분석하였다.

Huh7 세포의 운동능에 미치는 TOWE와 TOEE의 효과를 확인하기 위하여 wound healing과 in vitro invasion assay를 시행한 결과 두 시료의 처리로 인해 Huh7 세포의 운동성은 현저히 떨어져 wound healing이 억제된 것을 볼 수 있었다. 또한 in vitro invasion assay에서도 두 시료를 처리한 세포의 membrane 투과 효과가 억제되는 것으로 보아 TOWE와 TOEE는 Huh7 세포의 운동성의 억제를 통해 전이를 조절할 수 있는 능력이 있음을 알 수 있었다.

두 시료가 EMT 관련된 마커들 및 그들의 전사인자들의 발현 조절을 할 수 있는지의 여부를 Western blot으로 분석하였다. 특히, cadherin switch, vimentin, MMP-9 뿐만 아니라 이들의 발현 조절에 관여하는 Snail, NF-κB, ZEB1과 같은 전사인들의 발현을 분석한 결과 두 시료는 E-cadherin을 증가시키고 N-cadherin의 발현을 감소시켜 cadherin swith를 ‘OFF’시키려 하였고, vimentin과 MMP-9의 발현도 억제하였다. 그리고 전사인자인 Snail, NF-κB, ZEB1의 활성 또한 유의하게 억제하였다. 이 결과를 통해 TOWE와 TOEE는 Huh7 세포의 전이를 조절할 수 있음을 알 수 있었다. 더불어 TOWE와 TOEE의 활성을 비교하였을 경우, TOEE가 TOWE보다 더 강한 EMT 마커와 전사인자 억제능을 보이는 것은 유기용매가 더 많은 활성 성분을 녹일 수 있기 때문인 것으로 추측된다.