Korean Journal of Pharmacognosy (생약학회지)

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Antioxidant Activity of Beta vulgaris L. Methanol Extract in Caenorhabditis elegans

비트 Methanol 추출물의 예쁜 꼬마선충에 대한 항산화 효과

  • Received : 2020.09.07
  • Accepted : 2020.09.28
  • Published : 2020.09.30
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Abstract

Caenorhabditis elegans model system was used to investigate the antioxidant activity of Beta vulgaris L. (Chenopodiaceae) methanol extract. The methanol extract showed DPPH radical scavenging and superoxide quenching activity in a dose-dependent manner. The B. vulgaris methanol extract was measured for the activity of superoxide dismutase (SOD), catalase, and oxidative stress tolerance by using C. elegans, along with reactive oxygen species (ROS) level. In addition, to see that the regulation of the stress response gene is responsible for the increased stress tolerance of C. elegans treated by the methanol extract, SOD-3 expression was measured using a transgenic strain. As a result, the B. vulgaris methanol extract increased SOD and catalase activities, and decreased ROS accumulation, dose-dependently. Furthermore, the methanol extract-treated CF1553 worm showed higher SOD-3::GFP intensity than the control.

Keywords

활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)은 모든 세포에서 수많은 종류의 효소가 관여하는 작용과 리독스 반응에서 생성되는 hydrogen peroxide(H2O2), hydroxyl radical(OH−), singlet oxygen(1O2) 및 superoxide(O2−) 등의 집합체이며, 일부의 활성산소종은 세포 내에서 중요한 역할을 하기도 한다.1-3) 필요 이상의 활성산소종의 발생은 산화적 스트레스를 일으켜 세포를 공격하는 주요 원인 물질이 될 수 있으며, 세포 내의 미토콘드리아 호흡의 결과로 많이 발생하는 과잉의 활성산소종은 산화적 스트레스를 야기시켜 염증, 관절염, 당뇨병, 치매, 암, 동맥경화, 혈관질환, 골다공증 등을 포함하는 노화관련 질병을 초래할 수 있다고 보고되어 있다.4, 5) 이러한 활성산소종에 의해 발생하는 산화적 손상을 늦추거나 억제하는 능력을 가진 것으로 인체 세포 내에는 superoxide dismutase(SOD), glutathione(GSH), glutathione S-transferase(GST)와 같은 효소들이 활성산소종을 제거하여 세포 내 산화와 항산화 균형을 유지하고 있다. 그러나 세포 내의 효소만으로는 활성산소종을 모두 제거하기 어려워 추가적인 항산화제의 보충이 필요하다.6-8)이러한 연구의 일환으로 주변에서 쉽게 섭취 할 수 있는 음식물이나 식물로부터 천연 항산화제를 개발하기 위해 다양한 연구가 진행되고 있다.6-8)

비트(Beta vulgaris)는 명아주과(Chenopodiaceae)에 속하는 식물로 오래전부터 다양한 질병을 치료하는 많이 사용 되어왔고, 많은 연구들에서 빈혈, 파킨슨병, 간보호, 항당뇨, 항균 및 항염증에 효과가 있다고 보고되어 있다.9-11) 본 연구에서는 비트 메탄올 추출물을 이용하여, DPPH free radical 소거시험, superoxide 소거 활성 실험을 vitamin C를 대조군으로 항산화능을 측정하였다. 그리고 수명연장 실험모델 및 항산화효과 실험모델로 많이 이용되는 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)을 이용하여 선충 내 항산화 효소인 catalase와 SOD 및 선충 내의 활성산소종의 축적에 미치는 영향을 측정하였다. 또한, 산화적 스트레스를 유도하여 이에 대한 저항력과 이와 관련된 산화적 스트레스에 저항하는 단백질의 발현 여부를 형질전환 선충인 CF1553을 이용하여 SOD-3 유전자의 발현 증가 여부를 확인하였다. 이와 같은 실험을 통하여 몇 가지 결과를 얻었기에 이를 보고하고자 한다.

재료 및 방법

실험재료

본 실험에 사용한 비트는 청정먹거리 제주땀에서 유기농비트를 구입하여 김대근 교수가 검증한 후에 음걸세절하여 사용하였으며, 표준품은 남부대학교 응급구조학과에 보관하고 있다(NB-20-007).

추출

음건 세절한 비트 2 kg을 methanol로 진탕하면서 6시간씩 50℃에서 2회 온침 추출하였다. 그 추출액을 수욕상에서 감압농축하여 methanol 엑스 약 450 g을 얻었으며, 수용성 당제거를 실시하고 농축하여 98 g의 비트 methanol 추출물을 확보하였다.

DPPH Free Radical 소거활성12)

96well plate에 비트 methanol 추출물을 EtOH로 각 농도별로 조제한 용액에 0.2 mM의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)(EtOH)을 일정량씩 가하였다. 10초간 진탕한 후 25℃에서 30분간 방치한 후 microplate reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조약물은 L-ascorbic acid를 사용하였다. 항산화효과는 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도와 비교하여 그래프로 나타내었다. 각 시료에 대한 DPPH radical 소거작용을 3회 반복하여 측정하였다.

Riboflavin 유래 Superoxide 억제활성13)

비트 methanol 추출물의 superoxide 억제능력은 methionine, riboflavin, NBT로 구성된 평가시스템을 이용하여 광화학작용을 측정하는 것이다. 반응혼합액은 2.6 μM riboflavin, 3 mM methionine, 75 μM NBT, 0.1mM EDTA, PBS(pH 7.4) 및 여러 농도의 시료로 이루어졌다. 혼합물은 light box에 넣은 후 5분마다 자리를 임의로 바꾸어 주면서 15분 동안 넣어두었다. light box안의 온도는 20±1℃, 빛의 밝기는 5,500lux를 유지하였다. NBT는 빛 아래에서 blue formazane으로 환원되어지는데, 이 생성물을 560 nm에서 측정하였다. Blue formazane 형성억제가 superoxide 억제능력이 된다.

Caenorhabditis elegans(예쁜꼬마선충) 배양14)

C.elegans를 E. coli OP50을 도말한 Nematode Growth Medium(NGM) agar plate에서 20℃에서 배양하였다. 비트 methanol 추출물을 DMSO를 용매로 한 stock solution 상태로 멸균된 NGM plates(50℃)에 첨가하였다. 최종 DMSO농도는 모든 상태에서 0.1%(v/v)를 유지하였다.

선충 내의 SOD, Catalase 활성 측정15, 16)

비트 methanol 추출물을 농도별로 조제한 plate에 성장 단계가 동일한 N2 선충을 배양하였다. 성체가 된 후 4일째에 선충을 모아 M9 buffer로 3회 세척 후 분쇄하여 효소 활성 측정에 사용하였다(homogenization buffer: 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH7.5). SOD 활성은 Ibrahim등의 방법을 응용하여 측정하였다. 먼저 10 mM phosphate buffer(pH 8.0)를 용매로 반응혼합물(1.6 mM xanthine과 0.48 mM NBT 0.49 mL)를 만든 뒤 농도별 시료 10 μL와 37℃에서 5분간 pre-incubation시켰다. 그 후 xanthine oxidase 100 μL(0.05 U/mL)을 첨가하고 37℃에서 20분 동안 incubation시킨 다음 69 mM SDS로 반응을 멈추고 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. Catalase activity는 Aebi의 방법을 응용하여 25 mM H2O2에 농도별 시료 50 μL를 3분 동안 반응시키고 240 nm에서 흡광도를 측정하였다.

선충 세포 내 활성산소종(ROS) 분석17)

선충 세포 내 활성 산소종은 2',7'-dichlorodihydro fluorescein diacetate(H2DCF-DA)를 사용하여 측정하였다. 성장 단계가 동일한 선충을 비트 methanol 추출물을 농도별로 제조한 plate에서 배양하였다. 성체가 된 후 4일째 50 μM juglone을 함유한 M9 buffer에넣고 2시간 노출시킨 뒤 96 well plate에 담긴 50 μL M9 buffer에 5마리씩 옮겼다. 마지막으로 25 μM H2DCF-DA 50 μL를 첨가한 뒤 여기 485 nm, 방출 535 nm에서 흡광도를 각각 측정하였다.

산화적 스트레스 저항성 평가18, 19)

비트 methanol 추출물이 선충의 산화 스트레스 저항성에 미치는 영향을 알아보기 위해 산화적 스트레스 조건하에서 선충을 배양하여 생존율을 측정하는 실험을 수행하였다. 성체가 된 후 7일째 일시적으로 선충을 2 mM juglone이 함유된 M9 buffer가 담긴 96 well plate의 well에 옮기고 시간별로 생존율을 확인하였다.

형질전환 선충 내 SOD-3::GFP 형광 측정

형질 전환된 선충으로 SOD-3::GFP를 포함한 CF1553을 농도별로 투여된 배지에 배양하였다. 성체가 된 후 4일째에 사용하였으며, 선충은 sodium azide(4%)로 마취시켰고 GFP 발현은 형광 실체 현미경(Olympus, Japan)으로 관찰하였다. 발현강도를 정량, 분석하기 위해 현미경을 이용한 사진 촬영과 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 모든 실험은 3회 반복하였다.

통계 분석

통계 자료의 값은 평균값 ± 표준오차(mean ± S.E.M.)로 표시 하였다. 그룹간의 통계적 유의성 검정은 Student’s t-test를 통해서 분석하였고 선충의 연속적인 생존도는 Log-rank test 분석 방법을 이용하였다. p값은 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001일 때 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

결과

DPPH Free Radical 소거능

비트 methanol 추출물의 DPPH radical 소거 효과(IC50 value, 239.3 μg/ml)는 Fig. 1에 나타난 바와 같이 농도의존적으로 나타났으나, methanol 추출물 특성성 대조군인 비타민 C (IC50 value, 19.81 μg/ml)와 비교하여 높지 않게 측정되었다.

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Fig. 1. DPPH radical scavenging effects of the Beta vulgaris methanol extract.

Superoxide 억제능

Superoxide 억제능은 methionine, riboflavin, NBT로 구성된 평가시스템을 이용하여 광화학작용을 측정하는 것으로 사용된 시료의 superoxide 억제 활성평가하기 위해 수행되었다. 비트 methanol 추출물에서, superoxide 억제효과는 Fig. 2에서 보여지는 바와 같이 비트 methanol 추출물이(IC50 value, 317.8 μg/ml), 비타민 C (IC50 value, 255.7 μg/ml)와 거의 유사한 superoxide 억제 효과를 나타내었다.

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Fig. 2. Riboflavin-originated superoxide quenching activities of Beta vulgaris methanol extract.

SOD, Catalase 활성 증가 효능

Xanthine을 기질로 xanthine oxidase의 효소반응 과정 중에 생성되는 superoxide anion을 활용하여 비트 methanol 추출물의 SOD의 활성을 측정한 결과 Fig. 3A에서 나타난 바와 같이 예쁜꼬마선충의 비트 methanol 추출물 투여군은 SOD의 활성을 농도의존적으로 증가 시켰으며, 비트 methanol 추출물 250, 500 μg/mL 투여군은 대조군과 비교 하여 SOD 활성을 각각 약 6.2%, 14.4%(*p<0.05) 정도 증가시켰다. 한편, hydrogen peroxide를 체내에서 대사 시키는 catalase의 활성은 Fig. 3B에서 나타난 바와 같이 비트 methanol 추출물 250, 500 μg/mL 투여군이 대조군에 비해 catalase활성을 약 10%(*p<0.05), 21.7%(**p<0.01) 정도 증가시켰다(Fig. 3).

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Fig. 3. Effects of Beta vulgaris methanol extract on the antioxidant enzyme activity of wild-type N2 nematode. (A) The enzymatic reaction of xanthine with xanthine oxidase was used to generate •O2- and the SOD activity was estimated spectrophotometric through formazan formation by NBT reduction. The SOD activity was showed as a percentage of superoxide-scavenged amount per control. (B) Catalase activity was calculated from the concentration of residual H2O2, as determined by a spectrophotometric method. The catalase activity was expressed in U/mg protein. Data are expressed as the mean±S.E.M. of three independent experiments. Differences compared to the control were considered significant at *p<0.05, **p<0.01 by one-way ANOVA.

활성산소종(ROS) 감소 효능

비트 methanol 추출물의 세포 내 활성산소종의 감소 효능을 알아보기 위해 H2DCFDA와 선충 내부의 활성산소종을 반응시켜 형광을 관찰하였다. 활성산소종 형광의 감소 폭은 대조군과 비교하여 비트 추출물 250 μg/mL 투여군에서 9.1%(*p<0.05), 500 μg/mL 투여군에서 평균 약 20.8%(***p<0.001) 활성산소종을 감소시키는 것으로 확인되었다(Fig. 4).

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Fig. 4. Effects of Beta vulgaris methanol extract on the intracellular ROS levels of wild-type N2 nematodes. Intracellular ROS accumulation was examined in a microplate fluorescence reader at 535 nm (emission) and 485 nm (excitation). (A) Plates were read for 120 min. (B) The average percentages of intracellular ROS accumulation were presented. Differences compared with the control were considered significant at *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 by the one-way ANOVA.​​​​​​​

Oxidative Stress 저항성 증가 효능

비트 methanol 추출물의 선충의 산화적 스트레스 조건하에서 선충의 생존율에 미치는 영향을 확인하였다. 선충에 산화적 스트레스를 유도하기 위해서 1 mM juglone이 함유된 M9 buffer가 담긴 96 well plate에서 배양한 대조군 선충의 최고 생존시간은 21시간이었으나, 비트 methanol 추출물 250 µg/mL에서는 생존시간을 22시간으로 증가 시켰으며, 500 µg/mL 농도에서는 생존시간을 26시간으로 증가시켰다. 대조군의 평균 생존시간이 13.7±0.9시간었으나 250 μg/mL 처리군에서는 15.8±0.9시간, 500 μg/mL 농도 처리군은 평균 생존 시간을 18.1±1.2시간으로 15.8%, 32.2%의 생존 시간을 각각 향상시켰다(*p<0.05, **p<0.01)(Fig. 5, Table I).

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Fig. 5. Effects of Beta vulgaris methanol extract on the stress tolerance of wild-type N2 nematodes. For the oxidative stress assays, worms were transferred to 96-well plate containing 1 mM of juglone liquid culture, and then their viability was scored. Statistical difference between the curves was analyzed by log-rank test.​​​​​​​

Table. I. Effects of Beta vulgaris methanol extract on the oxidative stress tolerance of C. elegans​​​​​​​

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Mean lifespan presented as mean ± S.E.M data. Change in mean lifespan compared with control group (%). Statistical significance of the difference between survival curves was determined by log-rank test using the Kaplan-Meier survival analysis. Differences compared to the control were considered significant at *p<0.05 and **p<0.01.​​​​​​​

형질 전환 선충 내 SOD-3의 발현 증가 효능

선충 내에서 비트 methanol 추출물 투여에 의한 oxidative stress에 저항하는 단백질의 증가 여부를 확인하기 위해서 SOD발현유전자의 증가 여부를 확인 하였다. SOD-3을 포함한 형질 전환 선충 CF1553을 사용하여 실험한 결과 CF1553 형질 전환 선충에 비트 methanol 추출물 250, 500 μg/mL 처리군이 처리되지 않은 선충에 비해 높은 SOD-3::GFP 발현율(8.9%, 18.5%, *p<0.05, **p<0.01)을 보여 주었다(Fig. 6A, 6B).

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Fig. 6. Effect of Beta vulgaris methanol extract on the expression of SOD-3 was determined using transgenic nematodes. (A) Images of SOD-3::GFP expression of CF1553 worm in the presence or absence of Beta vulgaris methanol extract. (B) The mean GFP intensity of mutant was represented as mean ± S.E.M. of values from 25 to 30 animals per each experiment. The GFP intensity was quantified using Image software by determining average pixel intensity. Data are expressed as the mean ± standard deviation of three independent experiments. Differences compared with the control were considered significant at *p<0.05 and **p<0.01 by one-way ANOVA.​​​​​​​

고찰

본 연구는 예쁜꼬마선충(C. elegans)을 실험모델로 사용하여 비트 methanol 추출물에 대한 항산화 효과에 대한 실험을 하였다. E. coli를 먹이로 하는 예쁜꼬마선충은 수명연장 효능과 다이어트, 치매, 파킨슨 질환 등을 비롯한 다양한 연구에 모델시스템이 개발되어 있다.20-23)

비트 methanol 추출물은 DPPH radical과 superoxide 소거 활성시험에서 농도의존적으로 소거 활성이 증가됨을 보여주었으며, 이와 같은 결과는 기 보고된 비트 추출물의 항산화 효능들과 잘 부합되는 결과이다.24, 25) 비트 methanol 추출물은 예쁜꼬마선충 내의 항산화 효소인 SOD 및 catalase의 활성을 높이는 것으로 확인되어 free radical에 의해 야기되는 oxidative stress로부터 방어하는 기전에 영향이 있을 것으로 생각된다.26) 비트 methanol 추출물의 선충의 oxidative stress에 대한 저항능력을 측정한 실험에서는 대조군과 비교해 볼 때 시료 처리군의 생존율이 농도 의존적으로 크게 증가하였다. 또한 GFP-fused transgenic strain CF1553의 mutant를 이용한 oxidative stress 저항성 실험에서 저항성 지표인자인 SOD-3::GFP 형광 발현량이 농도 의존적으로 증가시키는 것이 관찰되어 oxidative stress에 저항하는 단백질이 생성되었음을 확인할 수 있었다.27)이와 같은 결과는 비트와 관련된 연구 중에 비트 추출물의 함유성분으로 알려진 phenol성 화합물들의 항산화 효능과 관련성이 있을 것으로 사료된다.28) 활성산소종에 저항하는 인체 내의 방어 체계로 catalase, glutathione, SOD 등의 항산화 효소들이 작용하고 있으나 필요 이상의 활성산소종과 각종 스트레스, 세포 손상 등에 의해 생성되는 활성산소종은 이러한 항산화효소 등을 소멸시켜 oxidative stress를 야기시키며, 노화와 관련된 각종 질환과 각종 암 발생 또는 염증 생성 등에 관련성이 있음이 보고되어 있다.29) 비트 methanol 추출물이 SOD나 catalase 등의 항산화 효소의 활성을 증가시키고, oxidative stress에 대한 저항력을 높여 주는 효능은 암과 각종 염증성 질환 등의 예방 및 stress로 인한 노화를 억제하는데 기여할 수 있을 것으로 생각된다. 차후에 비트 methanol 추출물에서 분리정제된 단일 물질 수준에서의 항산화 활성 및 기전 연구가 필요할 것으로 사료된다.

결론

비트 methanol 추출물의 항산화제로서의 가치가 있는지를 확인하기 위해 in vitro 시험인 DPPH free radical 및 superoxide 소거시험에서 농도의존적으로 항산화 효능을 나타냈으며, 예쁜꼬마선충을 이용한 항산화 실험에서는 SOD 및 catalase의 활성을 농도의존적으로 높이는 것을 확인하였다. 선충 세포 내의 활성산소종의 발생을 농도 의존적으로 감소시켰으며, juglone 투여로 인한 oxidative stress 조건하에서는 선충의 생존율을 농도의존적으로 증가시켰다. 이와 관련하여 mutant인 GFP-fused transgenic strain CF1553을 이용한 oxidative stress 저항성 단백질 발현 실험에서는 oxidative stress에 저항성이 있는 SOD-3::GFP의 발현량 증가됨을 확인하였다. 이러한 결과는 비트 methanol 추출물은 항산화 및 이와 관련된 질병의 예방 및 치료를 위한 자원으로서의 가치가 충분히 있을 것으로 사료된다.

사사

본 연구는 중소벤처기업부에서 시행한 중소기업 기술개발사업 수행과제(S2719178) 결과의 일부 내용입니다.

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