Osteoblastogenic Activity of Tenebrio molitor Larvae Oil on the MG-63 Osteoblastic Cell

갈색거저리 유충 오일이 MG-63 조골세포 분화에 미치는 영향

Abstract

Recently, Korea has seen a rapid increase in the elderly population. As a result, osteoporosis, a geriatric disease, has become a social problem. To investigate the novel and natural materials for promoting osteoblastogenesis, we investigated the osteoblastogenic activity of Tenebrio molitor larvae oil (TMO) on the MG-63 preosteoblast cells. The cytotoxicity and proliferation effects of TMO on MG-63 cells were measured by MTS assay. There was no cytotoxicity up to $80{\mu}g/ml$. At 40 and $80{\mu}g/ml$ of TMO (treated for 48 hr), cell proliferation was elevated about 120% compared to the control. The osteoblastogenic activity of TMO was measured with alkaline phosphatase (ALP) activity at 5 days. Doses of 5 to $80{\mu}g/ml$ of TMO increased ALP activities significantly compared with the control. In addition, expression of ALP and Runx2 (osteoblastogenic markers) were markedly increased after treatment of TMO for 5 days. These results provide evidence that TMO promotes osteoblastogenesis by increasing the gene and protein expression of ALP and Runx2, and they suggest that TMO may be a potential agent for bone formation and preventing osteoporosis.

현재 우리나라는 고령화 사회에 접어들었으며, 이와 함께 골 대사 질환이 큰 문제로 대두되고 있다. 그 중 가장 흔하게 발생하는 골다공증은 여러 요인에 의해 발생하고 있으며 이의 예방 및 치료를 위한 소재 개발 연구가 활발하게 진행되고 있다. 그러나 곤충을 소재로 한 골다공증 예방 및 치료 연구는 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 골 형성 촉진 효능을 가진 새로운 소재 개발을 위해 갈색거저리 유충 오일의 MG-63 조골세포의 분화 촉진 효과를 연구하였다. 조골세포에서 갈색거저리 유충 오일의 독성 및 증식 효과를 평가하기 위하여 MTS assay를 진행한 결과 $80{\mu}g/ml$ 농도까지 세포 독성이 나타나지 않았으며, 48시간 배양했을 때 $40-80{\mu}g/ml$ 농도에서 120% 정도의 세포 증식 효능을 확인 하였다. 갈색거저리 유충 오일이 조골세포 분화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 5일간 갈색거저리 유충 오일을 MG-63 조골세포에 처리한 후 ALP 활성을 측정하였다. 그 결과 $80{\mu}g/ml$ 농도에서 무처리 군에 비해 약 180%의 조골세포 분화 촉진 효능을 관찰 하였다. 이 결과는 ALP staining에서도 유사하게 나타났다. mRNA 발현량의 변화를 측정한 결과, Alpl과 Runx2 유전자 발현량이 증가하였고, 단백질 발현량을 측정했을 때에도 유사한 결과를 확인하였다. 이를 통해 ALP와 Runx2 유전자 및 단백질 발현에 의해서 ALP 활성이 증가하고 조골세포 분화가 촉진되었을 것으로 판단되며, 갈색거저리 유충 오일을 이용한 골 형성 촉진에 따른 골다공증 예방 및 치료 기능성 소재 개발에 대한 가능성을 확인하였다.

서 론

우리나라는 현재 고령화 사회에 접어들었으며 65세 이상 고령인구는 계속하여 증가하고 있는 추세이다. 고령화 사회에서는 골 대사 질환이 큰 문제로 대두되고 있으며 그 중 가장 흔하게 발생하는 골다공증은 골 밀도의 감소와 미세구조의 이상을 특징으로 하며 골 파열 위험의 증가로 경미한 충격에도 쉽게 골절을 일으킬 수 있는 질환이다[8]. 골절이 일어나기 전까지는 자각증상이 거의 없어 더욱 위험한 것으로 알려져 있으며[14], 특히 폐경기 여성의 경우 에스트로겐 결핍에 의해 파골세포에 의한 골 흡수가 많아져 골다공증이 쉽게 유발되는 것으로 보고되고 있다[10, 20]. 현대사회에서는 폐경기 여성뿐만 아니라 나이와 성별을 불문하고 골다공증 발생률이 증가하는 것으로 보고되었으며, 그 요인으로는 연령, 성, 가족력 등과 같은 유전적 요인과 음주, 흡연 및 운동 등 생활습관 요인이 있다[22].

뼈는 체내 구조를 이루고 골격계를 구성하는 역할을 하며 칼슘과 인의 혈중 농도 조절 및 조혈작용에도 관여하는 조직이다. 뼈 조직은 골 기질 흡수 작용을 하는 파골세포와 새로운 골 기질을 형성하는 조골세포로 이루어져 있으며 파골 및 조골세포가 서로 균형을 이루면서 칼슘과 인을 이용한 무기질화 과정이 끊임없이 일어남으로써 골 항상성이 유지되며, 이러한 균형이 깨지는 경우 골다공증이 발생하게 된다[19]. 골다공증의 발병 원인이 파골세포의 활성증가인지, 조골세포의 활성 감소인지 명확하게 밝혀지지 않았음에도 불구하고 현재 사용되고 있는 골다공증 치료방법은 주로 골 흡수를 억제하는 방법으로 에스트로겐 및 비스포스포네이트 제제가 대부분을 차지하고 있다[24]. 이러한 약제를 사용할 경우 파골세포의 활성을 억제하여 골 조직의 손실을 감소시킬 수 있지만 이미 진행된 골 소실에 대한 회복 효과 또는 새로운 골 조직의 형성과 같은 효과는 기대할 수 없으므로 골다공증의 완전한 예방 및 치료는 불가능한 실정이다[17, 18]. 따라서 골 조직 형성의 증가를 동반한 골다공증 예방 및 치료의 또 다른 방법으로 조골세포 활성 증가를 목적으로 한 연구가 활발해지고 있으며, 천연소재의 경우 복분자, 황금 및 가시오가피 등을 이용하여 조골세포의 활성화에 미치는 효과에 대한 연구가 진행되었다[18, 21, 26].

조골세포는 연골, 지방, 근원세포 및 섬유아세포로 분화될 수 있는 세포로 골수의 간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)에서 기원한 세포이다[25]. 조골세포는 칼슘 침착 및 무기질화를 조절하고 뼈의 세포 외 기질을 합성함으로써 뼈의 형성 및 재형성 과정에서 가장 중요한 역할을 한다[7, 11]. 따라서 조골세포를 이용한 연구는 골다공증 예방 및 치료 효능이 있는 소재의 개발에 도움이 될 것으로 사료된다. 조골세포는 골 표면에 근접하게 분포하며, 세포막에 alkaline phosphatase (ALP)라는 당단백 효소가 존재하는데 이 효소는 염기성 pH에서 최적의 활성을 보이며 기질 특이성이 있다. 또한 무기인산의 운반, 세포분열 및 분화의 조절자로서 세포의 외막과 석회화 조직의 기질 소포에서 높은 농도로 발견이 되며 이를 통해 골세포 분화의 표지인자로 사용되고 있다[8, 9, 28].

현재의 세계적인 인구 증가 및 지구온난화 등 각종 문제로 인해 미래에는 식량 부족 현상이 나타날 것으로 예측되며 이를 해결할 대안으로써 식용곤충이 각광받고 있다. 식용곤충은 단백질과 불포화지방산 함유량이 높으며 탄수화물, 비타민 및 무기질 등 다양한 영양소를 함유하고 있다. 뿐만 아니라 현재의 동물성 단백질 급원인 가축의 생산과정에 비해 온실가스 및 폐기물의 양이 적으며 생장기간은 짧고 개체 수 증가율은 높아 보다 효율적인 식량자원이 될 것으로 사료된다. 또한, 과거의 본초강목, 동의보감 등 문헌을 통해 곤충의 다양한 효능을 확인할 수 있으며, 극한 외부 환경에서 생존해나가는 곤충의 특성 상 체내에 기능성을 가진 대사산물을 함유하고 있을 것으로 추정된다[15].

현재 국내에 7종의 식용곤충이 일반식품으로 식품공전에 등록되어 있으며[1], 최근에는 곤충을 이용한 식품 제조 방법 연구, 곤충 유래의 생리활성 물질에 대한 연구 등이 활발히 진행되고 있어 식용 및 약용으로 곤충의 이용이 증가할 것으로 사료된다[6].

갈색거저리(Tenebrio molitor)는 딱정벌레목(Coleoptera) 거저리과(Tenebrionidae)의 곤충으로 갈색거저리의 유충은 대표적인 식용곤충이다. 최근 갈색거저리 유충의 분말을 이용하여 패티, 파스타 및 선식 등 식품에 적용하는 연구[12, 13, 23]가 선행되었으며 갈색거저리 추출물의 항산화, 항균 및 항염 효과 등이 밝혀져있다[2, 31]. 그러나 갈색거저리 유충을 이용한 골 형성 촉진 및 골다공증에 대한 효능 연구는 전무한 실정이다. 갈색거저리 유충은 다른 식용곤충에 비해 지방 및 불포화 지방산의 함량이 비교적 높아[30] 갈색거저리 유충 오일의 사용이 보다 용이할 것으로 사료된다.

따라서 본 연구에서는 갈색거저리 유충으로부터 추출한 오일이 MG-63 조골세포 증식 및 활성에 미치는 영향을 분석하고자 하였으며, 이를 통해 갈색거저리 유층 오일의 골다공증 개선 가능성을 확인하고자 하였다.

재료 및 방법

갈색거저리 유충 오일 추출

본 연구에 사용된 갈색거저리 유충(Tenebrio molitor)은 경기도 화성 소재 갈색거저리 사육농가에서 구입하여 중적외선 건조기(MS3-6, Lichtzen, Korea)를 이용하여 건조 후 시료로 사용하였다. 수분함량이 3.5%인 건조 갈색거저리 유충을 착유기(명진종합기계)에서 500 kgf/cm²의 압력으로 착유하였다. 시료량은 2 kg씩 나누어 착유하였으며, 착유 시간은 압력도달시간 15분, 압력지속시간 15분으로 설정하여 착유하였다. 갈색거저리 유충으로부터 착유된 오일(Tenebrio moritor larvae oil, TMO)은 사용 전까지 4℃에 냉장보관하여 사용하였다.

세포주

인간유래 조골세포(human osteoblast-like cell, MG-63)는 ATCC (Manassas, VA, USA)에서 구입하였으며, 10% FBS (fetal bovine serum) (Hyclone, Logan, UT, USA)와 1× penicillin-streptomycin (Hyclone)이 첨가된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (Hyclone)을 배양배지로 사용하여 37℃, 5% CO₂의 배양조건에서 배양하였다. 세포의 계대배양은 세포가 충분히 성장하는 2-3일 간격으로 수행하였다.

세포 생존율 측정

TMO가 MG-63의 세포 생존율에 미치는 영향은 Chao 등[4]의 방법에 따라 MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) re-agent를 이용하여 확인하였다. MG-63에 대한 TMO의 세포독성 및 세포증식을 확인하기 위하여 MG-63을 96-well plate에 5.0×10³ cells/well로 분주하여 약 80%의 confluency에 도달할 때까지 10% FBS가 들어있는 배지에서 약 24시간 동안 배양하였다. 그 후 TMO를 5, 10, 20, 40, 80 μg/ml 의 농도로 처리하여 24시간 및 48시간 동안 추가 배양한 후 MTS reagent를 사용하여 세포 생존율을 측정하였다.

ALP (Alkaline phosphatase) 효소 활성 측정

ALP 효소 활성 검사는 p-nitrophenyl phosphate (p-NPP)의 가수분해 반응에 ALP가 촉매로 작용하는 원리를 이용하여, p-nitrophenyl phosphate 의 가수분해 산물인 p-nitrophenol의 양을 측정함으로써 ALP의 활성을 간접적으로 확인하는 방법을 사용하였다. MG-63세포를 96-well plate에 1.5×10⁴ cells/well 농도로 분주하여 24시간 배양한 다음, TMO를 농도별(5, 10, 20, 40, 80 μg/ml)로 처리하고 2일마다 배지를 갈아주며 5일간 조골세포 분화를 유도하였다. 5일 후 분화가 유도된 세포는 PBS로 세척하고 0.1% Triton X-100을 20 μl씩 분주하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 30분간 세포를 lysis 한 후, 100 μl의 p-NPP (sigma)을 분주하여 30분간 ALP에 의한 p-NPP의 가수분해 반응을 유도하였다. 반응 후 3 M NaOH로 가수분해 반응을 정지시키고 405 nm에서 흡광도를 측정하여 ALP 효소에 의해 p-nitrophenol로 전환된 양을 측정하였고 이를 통해 ALP 효소 활성을 산출하였다.

ALP (Alkaline phosphatase) staining

ALP 활성 및 조골세포의 분화 정도를 확인하기 위하여 ALP staining을 통해 염색 정도를 확인하였다. ALP 활성 측정 방법과 동일한 방법으로 세포에 TMO를 처리하여 분화를 유도하였다.. 분화가 유도된 세포는 PBS로 세척하였고 10% formalin을 사용하여 세포를 고정한 후, BCIP/NBT substrate solution (sigma)을 각 well에 분주하고 빛이 없는 조건에서 1-2시간 동안 반응시켰다. 세포에 푸르게 염색된 정도를 통해 조골세포의 분화 및 ALP 활성을 확인하였다.

RT-PCR

MG-63 세포를 3×10⁵ cells/well의 농도로 6-well plate에 분주하여 24시간 배양하였다. 그 후 TMO (5, 10, 20, 40, 80 μg/ ml) 및 조골세포 분화배지(50 μg/ml ascorbic acid과 10 mM β-glycerophosphate)로 교환하여 2일마다 배지를 갈아주며 3일 및 5일간 조골세포 분화를 유도하였다. RNA의 분리는 TRIzol reagent (Invitrogen Life Technology, USA)를 이용하였으며 RNA의 정량은 분광광도계를 이용하여 260 nm에서 흡광도로 정량하였다. RT-PCR을 위한 cDNA의 합성은 cDNA reverse transcription kit (Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 합성하였으며, qPCR Green Mix (ENZO, USA)와 Table 1에 제시한 primer를 사용하여 Realtime PCR 반응을 수행하였다. 측정하고자 하는 목적 유전자의 발현은 Gapdh의 발현 양을 이용하여 정량화 하였다.

Table 1. The sequences of primers for RT-PCR

Western blot

MG-63 세포를 3×10⁵ cells/well의 농도로 6-well plate에 분주하여 24시간 배양하였다. 그 후 TMO (5, 10, 20, 40, 80 μg/ ml) 및 조골세포 분화배지로 교환하여 2일마다 배지를 갈아주며 5일간 조골세포 분화를 유도하였다. 배양 후, 세포를 PBS로 세척한 뒤 protease와 phosphatase inhibitor가 함유된 RIPA buffer를 사용하여 세포를 lysis하고 원심분리하여 상등액으로부터 단백질을 회수 한 후 BCA를 이용하여 정량하였다. 회수한 단백질은 SDS-PAGE gel 전기영동을 통해 분자량에 따라 분리하고, PVDF membrane으로 transfer하였다. Membrane을 5% skim milk 용액으로 blocking 한 후 rabbit-anti-ALP 및 rabbit-anti-RUNX2 (Cell Signaling, MA) 항체를 4℃에서 overnight으로 반응시켰으며, 그 후 각 항체에 대한 2차 항체를 반응시킨 후 ECL kit를 이용하여 각각의 단백질 발현 양상을 관찰하였다.

통계처리

모든 실험 결과는 3회 반복하여 평균과 표준편차(mean ± SD)로 나타냈다. 실험군 간의 유의성은 Student’s t-test를 통해 검정하였고, p<0.05일 때 군 간의 차이가 유의적인 것으로 판단하였다.

결과 및 고찰

조골세포 증식 및 독성 평가

인간 골육종 유래 MG-63 세포는 골 형성 연구에서 primary osteoblast cell을 대체하여 alkaline phosphatase (ALP), runtrelated transcription factor 2 (Runx2) 및 osteoprotegerin (OPG) 등 다양한 골 형성 관련 인자들의 발현 확인을 통한 골 형성 연구에서 폭넓게 사용되고 있다[5]. 본 연구에서는 갈색거저리 유충으로부터 추출한 오일(Tenebrio molitor larvae oil, TMO)이 MG-63 조골세포의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해서 TMO를 24시간 및 48시간 동안 처리한 후 MTS reagent를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과, TMO는 80 μg/ml 농도까지 세포 독성을 유발하지 않았으며 특히 TMO 농도에 따라 세포 생존율이 유의적으로 증가하는 것을 관찰 할 수 있었다(Fig. 1). 따라서 이후 실험에서는 세포독성이 확인된 80 μg/ml 이하의 농도에서 모든 연구를 수행하였다.

Fig. 1. Effect of Tenebrio molitor larvae Oil on the osteoblastic cells proliferation. MG-63 cells were seeded into 96-well plate (5×10³ cells/well), and then treated with TMO (5-80 μg/ml) for 24 hr and 48 hr. Cell proliferation were determined using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) assay. Values are the mean ± SD of triplicate. #p<0.05, compared with the control of 24 hr. *p<0.05, compared with the control of 48 hr. CTR, control; TMO, Tenebrio molitor larvae Oil.

Alkaline phosphatase (ALP) 활성에 미치는 영향

조골세포의 분화 활성을 나타내는 표지인자로 사용되는 염기성 인산 분해 효소(alkaline phosphatase, ALP)는 거의 모든 조직에 분포하는 것으로 알려져 있으며, 특히 골 조직에 존재하는 ALP는 골 성장이 활발하게 일어날 때 그 활성이 증가하는 것으로 알려져 있다[3]. 따라서 본 연구에서는 TMO가 조골세포의 골 세포 분화 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 조골세포의 분화활성을 나타내는 표지인자인 ALP 활성을 조사하였다.

조골세포의 ALP 활성은 시료처리를 하지 않은 control (CTR) 군에 대한 비율로 나타내었으며 그 결과는 Fig. 2와 같다. TMO를 MG-63 세포에 농도별로 5일간 처리한 결과 5 μg/ ml 농도부터 ALP 활성이 대조군(CTR)에 비해 유의적으로 증가함을 확인 할 수 있었다. 이는 이전 연구에서 보고된 가시오가피 추출물(100-150%), 홍화자와 두충 혼합 추출물(100-140 %) 및 적송잎(100-140%) 추출물의 ALP 활성 측정 결과에 비해 현저하게 높은 ALP 활성을 나타내고 있다[9, 21, 27]. 또한 풀무치 추출물의 ALP 활성 결과와 비교했을 때, 풀무치 추출물 농도보다 현저하게 낮은 농도임에도 불구하고 비슷한 정도의 ALP 활성을 나타내었다[2]. 다음으로 세포 내 ALP 염색을 통하여 갈색거저리 오일이 ALP 활성에 미치는 영향을 확인한 결과, ALP 활성변화와 유사하게 CTR 군에 비해 TMO 처리군에서 농도 의존적으로 ALP 염색(푸른색)의 진하기가 증가함을 확인할 수 있었다. 따라서 갈색거저리 유충 오일은 MG-63 조골세포의 ALP 활성을 증가시키며 이에 따라 조골세포의 분화가 증가하였음을 확인하였고, 이는 갈색거저리 유충 오일이 골세포 분화 및 성장 촉진에 도움을 줄 수 있는 소재로 사용될 수 있음을 의미하고 있다.

Fig. 2. Effect of Tenebrio molitor larvae Oil on the ALP activity and staining of osteoblastic cells. MG-63 cells were seeded into 96-well plate (1.5×10⁴ cells/well) and treated with TMO (5-80 μg/ml) for 5 days. (A) Enzyme activity was measured by spectrophotometric method using p-nitrophenyl phosphate as a substrate. Values are the mean ± SD of triplicate*p<0.05, compared with the control. (B) Cells were stained with BCIP/NBT substrate solution after fixation. CTR, control; TMO, Tenebrio molitor larvae Oil.

MG-63 조골세포의 유전자 발현에 미치는 영향

TMO가 조골세포분화 조절 유전자의 발현에 미치는 영향을 검토하기 위하여 TMO를 MG-63 조골세포에 3일간 처리한 후, RNA를 분리하여 골 성장 및 분화와 관련된 유전자의 발현 변화를 확인하였다(Fig. 3). 그 결과 ALP 활성과 관련된 alkaline phosphatase (Alpl) 유전자의 발현은 TMO 20 μg/ml 농도부터 CTR군과 유의적으로 차이가 있었으며 오일의 농도에 의존적으로 조골세포 분화유도 배지(DM, 50 μg/ml ascorbic acid와 10 mM glycerophosphate)와 유사하게 약 2배까지 발현량이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 다음으로 전조골세포에서 골 형성 촉진의 핵심조절인자라 알려져 있는 유전자인 runtrelated transcription factor 2 (Runx2)의 발현 변화를 확인하였다[16]. 그 결과 Runx2의 유전자는 40 μg/ml 농도의 TMO로부터 CTR군과 유의적인 차이를 보였으며 80 μg/ml 농도에서는 약 4배 정도로 매우 높은 증가율을 나타냈다. 그러나 Alpl과는 달리 조골세포 분화 유도배지에서는 발현양의 변화를 관찰 할 수가 없었다. 이러한 결과는 Runx2의 발현이 조골세포분화유도 배지에 사용한 ascorbic acid에 영향을 받지 않는다는 기존 연구결과와 일치한다[29]. 결과적으로 TMO 처리는 조골세포 분화와 밀접한 관련이 있는 Alpl 및 Runx2 유전자의 발현을 증가시킴으로써 조골세포의 분화 및 골 형성을 촉진시킬 것으로 판단된다.

Fig. 3. Effect of Tenebrio molitor larvae Oil on the osteoblatogenesis related gene expression. MG-63 cells were seeded into 6-well plate (1.5×10⁵ cells/well) and treated with TMO (5-80 μg/ml). RNA was isolated at 3 days after the TMO treatment. The levels of Alpl and Runx2 mRNA were determined by quantitative realtime RT-PCR. The data were normalized to Gapdh. Results are shown as mean ± SD (n=3). *p<0.05 in comparison with control group. CTR, control; DM, differentiation medium (50 μg/ ml of L-ascorbic acid and 10 mM β-glycerophosphate); TMO, Tenebrio molitor larvae Oil.

MG-63 조골세포의 단백질 발현에 미치는 영향

TMO가 조골세포 분화 조절 단백질의 발현에 미치는 영향을 검토하고자 TMO를 MG-63 조골세포에 5일 동안 처리한 후 단백질을 추출하여 골 성장 및 분화와 관련된 단백질의 발현을 확인하였으며 그 결과는 Fig. 4와 같다. ALP 단백질 발현을 확인한 결과 40 μg/ml부터 CTR군과 유의적인 차이가 날 정도로 단백질 발현량이 증가하였으며 positive control로 사용한 조골세포 분화 유도 배지(DM)와 비슷한 정도의 발현량을 관찰할 수 있었다. 또한 80 μg/ml 농도에서는 CTR에 비해 약 4배 정도 ALP 단백질의 발현량이 증가하였다. TMO의 농도에 따라 발현량이 증가하는 양상은 앞서 Alpl 유전자 발현을 확인한 결과와 유사하였으며, Alpl 유전자 및 ALP 단백질 발현이 증가함에 따라 앞서 확인한 ALP 활성이 증가하였을 것으로 사료된다. RUNX2 단백질 발현의 경우 TMO 20 μg/ml 농도부터 CTR군에 비해 유의적으로 발현량이 증가하였으며 DM 군보다도 높은 발현량을 보였다. 또한 realtime PCR 결과와 동일하게 positive control인 DM 군에서 RUNX2의 발현량 또한 변화가 없음을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과들을 종합해보면, TMO는 MG-63 조골세포에서 ALP 및 RUNX2의 단백질 발현을 증가시키고, 이를 통해 MG-63 조골세포의 분화를 촉진하고 골 형성 기능을 강화하며 결과적으로 골다공증 예방 및 치료에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.

Fig. 4. Effect of Tenebrio molitor larvae Oil on the osteoblatogenesis related protein expression. MG-63 cells were seeded into 6-well plate (1.5×10⁵ cells/well) and treated with TMO (10-80 μg/ml). Protein was isolated at 5 days after the TMO treatment. The expression level of ALP and RUNX2 protein were determined by Western blot. The data were normalized to b-actin. Results of densitometric analysis of Western blot are also shown (lower). Results are shown as mean ± SD (n=3). *p<0.05 in com-parison with control group. CTR, control; DM, differentiation medium (50 μg/ml of L-ascorbic acid and 10 mM β-glycerophosphate); TMO, Tenebrio molitor larvae Oil.

감사의 글

본 연구는 농촌진흥청 어젠다 사업(과제 번호: PJ01419801)의 지원에 의해 이루어졌으며, 이에 감사 드립니다.