유근피 추출물 및 분획의 생리활성

Physiological Activity of Extracts of Bark from Ulmus davidiana var. japonica and its fractions

Abstract

In this study, extracts of bark from Ulmus davidiana var. japonica and its fractions were investigated the antioxidative, antibacterial and tyrosinase inhibition activity for physiological activity towards functional applications. In the measurement of DPPH radical scavenging activity, the ethyl acetate fraction showed higher radical scavenging ability than others. Moreover, in the tyrosinase inhibition assay, showed that the ethyl acetate fraction has good inhibition effects. Results of the DPPH radical scavenging and tyrosinase inhibition activity are related with the total polyphenol concentrations of ethyl acetate fraction. In antibacterial activity used to find out by utilizing the disc diffusion assay, chloroform fraction showed strong effect against Staphylococcus aureus and S. epidermidis. These results are related with the flavonoid contents of chloroform fraction. On the other hand, in the L929 cell viability measurement by MTT assay, the hexane, butanol and aqueous fraction treated at high concentration were showed cytotoxicity. But the others samples were exhibited a moderate viabilities. As a result of investigated the antioxidant and tyrosinase inhibition activity, the ethyl acetate fraction could be applicable for cosmetics related fields. And the chloroform fraction showed significant antibacterial activity against S. aureus and S. epidermidis.

느릅나무과(Ulmaceae)에 속하는 낙엽성 활엽교목인 느릅나무(Ulmus davidiana var. japonica)는 30m에 달하는 큰 나무로서 꽃은 황록색의 작은 꽃이 4~5월에 가지의 상단에서 피며, 과실은 5~6월에 성숙한다. 지리적으로 만주, 일본, 중국 등 동아시아에 널리 분포하며 우리나라의 전국에서 자생한다. 느릅나무의 수피는 유백피(楡白皮) 또는 유피(楡皮)라고도 불리며 뿌리의 껍질을 건조한 것을 유근피(楡根皮)라고 한다. 오래 전부터 민간에서는 느릅나무의 열매, 껍질, 뿌리를 이용하여 고약으로 만들어 소염제로 염증 및 종창 환부에 도포하여 사용하였고, 중탕을 하여 소화기 궤양 및 종양에도 이용하였다. 또한 느릅나무의 열매와 꽃을 발효하여 국수, 떡과 같은 음식으로 이용하거나 기생충을 죽이는 음식으로도 사용하였다는 역사적 기록이 있다. 뿐 아니라 한방에서는 유근피, 유백피가 다량의 tannin 과 점액질을 함유하고 있어 소종독(消腫毒), 치습, 이뇨, 완화제, 기생구충제 등 많은 증상에 활용해 왔다.^1,2) 현재까지 밝혀진 주요 활성 성분으로는 소염작용을 하는 triterpenoid계 물질인 friedelin, epifriedelanol 및 taraxerol, 점액질의 주성분인 pectic 다당류, sitosterol, stigmasterol, tannin, resin 등이 알려져 있으며,^3-5) 최근까지 연구된 유근피의 활성으로는 항산화, 항균, 항염증, 항암 효과를 비롯하여 지질대사 개선 등 많은 분야에서 연구가 이루어지고 있다.^6-10) 하지만 추출물 수준에서의 연구는 많이 이루어졌지만 분획물 수준의 연구는 미비한 실정이다. 따라서 유근피 추출물과 분획물의 항산화활성, 항균활성, tyrosinase 저해활성 등을 비교 조사하여 유근피를 이용한 기능성 소재 개발의 가능성을 살펴보고자 한다.  

 
재료 및 방법

 

식물재료

본 실험에 사용된 유근피는 전남생약농업협동조합에서 구입한 후 동신대학교 한의과대학 한의학과 정종길 교수에게 의뢰하여 동정한 후4^oC 이하로 냉장 보관하면서 실험에 사용하였으며, 표품(DSUBIO-2018-004)은 동신대학교 바이오센터에 보관되어 있다.

사용 균주와 세포주 및 배지

항균활성 실험에 사용된 미생물 균주인 Staphylococcus epdermidis(KCTC1917), Staphylococcus aureus(KCTC3881)는 한국생명공학연구원 생물자원센터(BRC)에서 분양 받은 것을 실험에 사용하였다. S. epidermidis와 S. aureus 균주는 Nutrient agar 및 broth를 사용하였다. 세포독성 실험에 사용된 동물세포주인 L929 cell은 BRC에서 분양 받은 것을 실험에 사용하였으며, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)배지에 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin을 혼합한 배지를 사용하였다. 

추출 및 분획

건조된 유근피 시료를 blender를 사용하여 마쇄한 후 methanol(MeOH)을 추출 용매로 하여 60℃에서 2시간씩 3회 반복하여 환류추출을 실시하였다. 추출액은 여과와 농축 및 동결건조를 실시하여 분말화하였고 이중 일부를 증류수에 분산시킨 후 hexane, chloroform(CHCl₃), ethylacetate(EtOAc), butanol(BuOH)을 사용하여 순차적으로 용매 분획을 실시하였다. 분획된 시료는 여과와 농축 및 동결건조 후 추출물과 함께 4℃ 이하로 냉장 보관하면서 실험에 사용하였다. 

총 polyphenol 함량 측정

Folin-Denis법을 이용하여 75% EtOH 추출물 및 분획물의 polyphenol 함량을 측정하였다.¹¹⁾ Methanol에 1 mg/ml농도로 용해시킨 시료액 80 μl와 Folin-Denis reagent 80 μl를 혼합하여 3분간 반응시킨 뒤 10% Na₂CO₃ 80 μl를 혼합하여 1시간동안 암실에서 반응시킨 후, 상등액 120 μl를 취하여 96well plate에 옮겨 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 tannic acid를 0∼500 μg/ml의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 표준 검량선을 작성하고 총 polyphenol 함량을 mg/g로 나타내었다.

총 flavonoid 함량 측정

페놀성 화합물중 특히 여러 가지 기능성을 나타내는 것으로 알려진 flavonoid 함량을 알아보기 위해 Moreno 등의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다.¹²⁾ 1 mg/ml 농도로 methanol에 용해시킨 시료액 100 μl와 10% aluminium nitrate 20 μl, 1M potassium acetate 20 μl, methanol 860 μl를 차례로 혼합하여 40분간 반응시킨 후 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 rutin 0∼500 μg/ml의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 표준 검량선을 작성하고 총 flavonoid 함량을 mg/g으로 나타내었다.

DPPH radical 소거능 측정

MeOH 추출물과 분획물의 항산화활성을 비교하기 위해 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)을 사용하여 radical 소거능을 측정하였다.¹³⁾ 각 시료를 methanol에 0.1~5 mg/ml의 다양한 농도로 용해시킨 시료액 20 μl와 200 μM로 용해시킨 DPPH 용액 180 μl를 혼합하여 20분간 암실에서 반응시킨 후 microplate reader(BIO-TEK, USA)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를 바탕으로 50%의 DPPH radical을 소거하는데 필요한 농도(SC₅₀)를 계산하였다. Positive control로 ascorbic acid(vitamin C)를 사용하였다.

Disc diffusion assay에 의한 항균활성 측정

유근피 추출물과 분획물의 항균활성을 비교하기 위하여 각 균주를 대상으로 disc diffusion assay로 측정하였다. 항균시험용 평판배지는 계대 배양된 각 균주 배양액을 100 μl씩 분주한 후 멸균 면봉을 이용하여 도말하여 준비하였고, 시료를 disc당 1.0, 5.0 mg이 되도록 직경 6 mm의 paper disc에 천천히 흡수시킨 뒤 건조과정을 거쳐 용매를 휘발시킨 후 평판배지 위에 밀착시킨 상태로 37℃에서 24시간 배양한 후 disc를 중심으로 생성된 저해환(clear zone, mm)을 측정하여 항균활성을 비교하였다. 

Tyrosinase 저해 활성

Tyrosinase 저해 활성은 tyrosinase의 작용 결과 생성되는 DOPA chrome을 비색법에 의해 측정하는 방법을 이용하였다.¹⁴⁾ 농도별 시료액 20 ㎕와 0.1 M phosphate buffer 100 ㎕를 혼합하여 5분간 실온에서 반응시켰다. 반응액에 1 Kunit/㎖ tyrosinase(in 0.1M phosphate buffer) 30 ㎕와 1.5mM tyrosine 30 ㎕를 혼합하여 37℃에서 10분간 반응시켰다. 반응이 완료되면 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 시료액 대신 0.1M phosphate buffer 용액을 사용한 blank의 흡광도를 기준으로 저해 활성을 산출하였고, positive control로 arbutin을 사용하였다.

MTT assay에 의한 세포독성 측정

추출물 및 분획물의 세포독성은 MTT assay 방법에 의해 측정하였다.¹⁵⁾ 배양된 L929세포를 96 well plate에 2×10⁴ cells/well의 농도로 분주하여 24시간 배양하여 부착 및 안정화시킨 후, 농도별로 희석한 시료를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. PBS에 5 mg/ml의 농도로 용해시켜 제조한 MTT용액을 각 well에 10 μl씩 가하고, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 4시간 동안 반응시켜 MTT가 환원되도록 하였다. 배지를 제거한 후, 각 well에 100 μl의 DMSO를 첨가하여 생성된 formazan 결정을 용해시켜 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 시료액 대신 PBS를 사용한 blank의 흡광도를 기준으로 세포 생존율 산출하였다.

통계분석

모든 측정값은 3회 이상 반복 실험한 결과의 평균값과 표준편차(mean±SD)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 windows용 SPSS 12.0(SPSS Inc, Chicago, USA)을 이용하였다. 각 군 간의 측정치 비교는 one-way analysis of variance(ANOVA)를 시행하였으며, 유의성은 신뢰구간 p<0.05에서 의미를 부여하였다.

결과 및 고찰

 

Total polyphenol 및 flavonoid 함량

식물은 다양한 2차 대사산물을 생성하는데, 이 중 항암, 항산화, 항염증 등 다양한 생리활성을 가지는 기능성물질들이 있다.¹⁶⁾ 이러한 기능성물질들은 대부분 polyphenol류 혹은 flavonoid 계열이다. Polyphenol 화합물은 hydroxyl기를 가지는 방향족 화합물로서 superoxide, hydroxy radical과 같은 세포손상을 초래하는 free radical을 없애주는 항산화활성, 항암활성 등 여러 생리활성에 관여하는 것으로 알려져 있다.^17,18) 한편, 플라보노이드는 C₆-C₃-C₆의 기본구조를 가진 전형적인 페놀성 화합물로서 항산화활성을 비롯하여 항암, 항균 등 다양한 생리활성을 가지는 것으로 알려져 있다.¹⁹⁾ 유근피 MeOH 추출물과 용매 분획별 시료의 polyphenol과 flavonoid 함량을 측정한 결과를 Table Ⅰ에 제시하였다. 추출물 중 polyphenol 함량이 478.79 mg/g으로 나타났고, 용매 분획별 시료에서 EtOAc 분획과 BuOH 분획의 함량이 각각 948.16 mg/g, 576.08 mg/g으로 추출물보다 높게 나타났다. 하지만 Hexane, CHCl₃, aqueous 분획의 함량은 각각55.49 mg/g, 255.20 mg/g, 227.38 mg/g으로 추출물보다 낮아지는 것으로 나타났다. 추출물의 flavonoid 함량이 2.90 mg/g으로 확인되었고, 추출물과 동량의  flavonoid 함량을 보여준 aqueous 분획을 제외한 모든 분획물에서 추출물보다 높은 함량을 보여주었다. 특히 CHCl₃ 분획은 29.45 mg/g으로 다른 분획보다 월등히 높은 함량을 보여주었다. 이러한 결과는 추출물 중에 존재하는 polyphenol 화합물의 경우 EtOAc와 BuOH 분획으로 대부분 분리되어 나왔으나, flavonoid 화합물은 CHCl₃ 분획으로 분리되어 나온 것을 의미한다.

 

 Table Ⅰ. Polyphenol and flavonoid content of extract and fractions from bark of Ulmus davidiana 

 

DPPH radical 소거능

유근피 추출물과 용매 분획별 항산화 활성을 확인하기 위해 실시한 DPPH radiacl 소거능 측정에서 50%의 DPPH radical을 소거하는데 필요한 시료의 농도를 산출한 SC₅₀ 값과positive control로 사용된 L-ascorbic acid의 SC₅₀ 값을 기준으로 비교한 relative activity를 Table Ⅱ에 나타내었다. EtOAc 분획의 SC₅₀ 값이 134.33 μg/m로 262.67l μg/ml인 추출물보다 높은 활성을 보여주었다. 이와 같은 SC₅₀ 수치는 relative activity에 나타난 바와 같이 EtOAc 분획의 활성이 55.33% 수준으로 positive control보다 낮은 수준의 항산화 효과를 보여주었다. 기존의 연구들에서 DPPH radical 소거능과 같은 항산화 활성이 polyphenol 화합물의 함량과 밀접한 연관관계가 있다고 알려져 왔는데, Table Ⅰ의 polyphenol 함량 측정의 결과와 DPPH radical소거능을 살펴본 결과 유근피 추출물 및 분획물에서도 유사한 양상임을 확인할 수 있었다.^20-22)  

 

Table Ⅱ. SC₅₀ values in DPPH radical scavenging ability of extract and fractions from bark of Ulmus davidiana 

 

Disc diffusion assay에 의한 항균활성

Disc diffusion assay를 이용하여 유근피 추출물과 분획의 항균활성을 비교하여 Table Ⅲ에 나타내었다. 추출물의 S. aureus, S. epidermidis에 대한 항균활성 결과를 살펴보면 실험을 실시한 3가지 농도 중 가장 고농도인 2.0 mg/disc에서 각각 9.23 mm, 7.17 mm의 생육저해환을 형성하였으며, 1.0, 0.5 mg/disc에서는 생육저해환을 형성하지 못하였다. 분획물의 S. aureus 에 대한 항균활성의 경우 2.0 mg/disc에서는 EtOAc 분획이 가장 큰 생육 저해환을 형성하였으나 1.0, 0.5 mg/disc에서는 CHCl₃ 분획의 항균활성이 더 우수한 것으로 나타났다. S. epidermidis에 대한 분획물의 항균활성 또한 S. aureus에 대한 항균활성과 유사하게 2.0 mg/disc에서는 CHCl₃, EtOAc 분획이 가장 높은 활성을 보여주었으나 1.0, 0.5 mg/disc에서는 CHCl₃ 분획의 활성이 다른 분획물에 비해 우수한 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 Table Ⅰ의 flavonoid 함량 측정의 결과와 유사한 양상임을 확인할 수 있는데, 이는 기존의 연구들에서 제시한 것과 마찬가지로 항균활성이 flavonoid 화합물의 함량과 밀접한 연관관계가 있음을 확인할 수 있었다.^23-25)

 

Table Ⅲ. Antibacterial activities of extract and fractions from bark of Ulmus davidiana

 

Tyrosinase 저해 활성

멜라닌은 자외선을 차단하여 피부를 보호하는 작용을 하기도 하지만 과도하게 생성되거나 분포의 이상으로 인해 주근깨, 기미, 피부반점, 피부노화 및 피부암을 유발하는 것으로 알려져 있다.^26-28) 이러한 피부 색소 침착, 피부암 방지 및 미백활성 연구는 주로 tyrosinase 활성을 조절하는 방향으로 연구되어왔다. tyrosinase는 tyrosine hydroxylase 활성과 3,4-dihydroxyphenylalanine(DOPA) oxidase 활성을 가지고 있어 아미노산의 일종인 tyrosine이 DOPA quinone으로 전환되는 과정을 촉매하는 효소로서 멜라닌 생성과정 중에 굉장히 중요한 역할을 하는 효소이다.^29,30) 유근피의 추출물과 용매 분획별 tyrosinase 저해활성 측정 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 유근피 추출물의 tyrosinase 저해활성을 살펴보면 고농도인 5.0 mg/ml에서 58.99%의 활성을 나타내었다. 분획의 경우 5.0 mg/ml의 시료를 처리하였을 때, EtOAc 분획과 BuOH 분획이 각각 60.40%. 56.67%로 높은 활성을 보여주었다. 특히 EtOAc 분획의 경우 1.0 mg/ml의 농도로 처리하였을 때 43.54%의 tyrosinase 저해활성을 보여줌으로써 41.52%의 활성을 나타낸 arbutin보다 높은 활성을 보여주었다. 이러한 결과는 항산화 활성과 tyrosinase 저해 활성이 높은 상관관계를 보여준다는 연구와 일치하는 결과이다.³¹⁾

 

Fig. 1. Tyrosinase inhibition activities of extract and fractions from bark of Ulmus davidiana.
MU; Methanol extract of Ulmus davidiana, HF; n-Hexane fraction, CF; Chloroform fraction, EF; Ethyl acetate fraction, BF; n-Butanol fraction, AF; Aqueous fraction, AR; Arbutin. Arbutin was used as a positive control.
¹⁾ Values are mean ± SD(n=3).
* Different superscript letters show significant differences at p<0.05 by One-way ANOVA.

 

MTT assay에 의한 세포독성

정상세포주인 L929 cell에서 유근피 추출물과 분획물의 세포독성을 측정한 결과를 Fig. 2에 나타내었다. 추출물을 10 mg/ml의 농도로 세포에 처리하였을 때, 63.64%의 세포 생존율을 보여줌으로써 세포의 생장을 저해하는 것으로 판단되었다. 분획의 경우Hexane, BuOH 및 aqueous 분획을 10 mg/ml의 농도로 처러하였을 때, 각각 31.60%, 41.49%, 35.23%의 세포 생존률을 나타내며 독성이 있는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 가장 우수한 항균활성을 보인 CHCl₃ 분획과 항산화 활성과 tyrosinase 저해활성이 우수하였던 EtOAc 분획을 10 mg/ml로 처리하였을 때 각각 111.30%, 67.59%의 세포 생존율을 보여줌으로써 우려할 만한 독성은 없는 것으로 판단되었다. 또한 고농도를 제외한 모든 농도에서 추출물과 분획의 세포 생존율이 93.70 ~ 124.90%로 세포 독성을 나타내지 않았다. 

 

Fig. 2. L929 cell viabilities of extract and fractions from bark of Ulmus davidiana.
MU; Methanol extract of Ulmus davidiana, HF; n-Hexane fraction, CF; Chloroform fraction, EF; Ethyl acetate fraction, BF; n-Butanol fraction, AF; Aqueous fraction.
¹⁾ Values are mean ± SD(n=3).
* Different superscript letters show significant differences at p<0.05 by One-way ANOVA.

 

결론

 

본 연구에서는 유근피의 추출물 및 용매분획별 시료의 항산화 및 항균활성, 미백활성 그리고 세포독성을 비교하여 피부 관련 기능성 소재로서의 활용가능성을 살펴보았다. 총 polyphenol 함량을 측정한 결과, MeOH 추출물 중 polyphenol 함량이 478.79 mg/g으로 나타났고, 용매 분획별 시료에서 EtOAc 분획의 polyphenol 함량이 948.16 mg/g 으로 추출물과 다른 분획보다 높게 나타났다. Flavonoid 함량의 경우, 추출물의 flavonoid 함량이 2.90 mg/g으로 확인되었고, 추출물과 동량의 flavonoid 함량을 보여준 aqueous 분획을 제외한 모든 분획물에서 추출물보다 높은 함량을 보여주었다. DPPH radical 소거능 측정을 통해 항산화 활성을 확인한 결과, polyphenol 화합물의 함량이 가장 높았던 EtOAc 분획의 SC₅₀ 값이 134.33 μg/ml로 추출물과 다른 분획보다 높은 활성을 보여주었다. Tyrosinase저해활성을 측정한 결과, EtOAc 분획이 높은 tyrosinase 저해활성을 보여줌으로써 항산화 활성과 tyrosinase 저해 활성이 높은 상관관계를 확인할 수 있었다. 피부 상재균으로 알려진 S. aureus, S. epidermidis에 대한 항균활성에서 CHCl₃ 분획이 실험을 실시한 모든 농도에서 높은 활성을 보여주었는데 이러한 결과는 CHCl₃ 분획의 flavonoid함량이 다른 시료에 비해 높게 나온 결과와 높은 연관성이 있는 것으로 판단되어진다. 정상세포주인 L929 cell을 이용하여 세포독성을 측정한 결과, hexane, BuOH 및 aqueous 분획을 고동도로 처리하였을 때 세포독성이 있다는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 고농도를 제외한 모든 농도에서 추출물과 분획 모두 세포독성이 없는 것을 확인하였으므로 독성의 우려가 없이 높은 활성을 보여주는 농도 설정이 필요할 것으로 판단되었다.  
이상의 결과를 종합해 보면 추출물 중에 존재하는 생리활성 물질의 대부분이 EtOAc 분획과 CHCl₃ 분획으로 분리되어 나온 것으로 판단할 수 있으며, EtOAc 분획의 높은 항산화 활성과 미백활성 및 CHCl₃ 분획의 항균활성을 통해 기능성 소재로의 가능성을 확인하였다.