In vivo Screening of Herbal Extracts on High Glucose-induced Changes in Hyaloid-Retinal Vessels of Zebrafish

고혈당으로 유도된 제브라피쉬 당뇨망막병증 모델에서 약용식물의 효능 평가

Abstract

The zebrafish (Danio rerio) is an established model organism for several pathophysiological conditions which are related to human diseases. In this study, we tested the preventive effect of eight herbal extracts, which show the inhibitory effect of advanced glycation end products (AGEs) or aldose reductase (AR) in our previous study, on high glucose (HG)-induced retinal vessel dilation in larval zebrafish and analyzed the change of hyaloid vasculature. HG-induced zebrafish hyaloid vasculatures were significantly increased in the thickness compared to untreated zebrafish (P<0.001, n=6~10). Eight herbal extracts were found to have significant retinal vessel dilation on the inhibitory activity. Particularly, Brandisia hancei (twigs and fruits), Castanopsis orthacantha (leaves and twigs), Litsea japonica (leaves and twigs), Spenceria ramalana (whole plant), and Synedrella nodiflora (leaves and stems) showed potent inhibitory activity against retinal vessel dilation in HG-induced larval zebrafish.

당뇨병은 인슐린과 글루카곤, 글루코코르티코이드 등 당질의 대사에 관여하는 호르몬의 이상이나 작용경로의 비정상적 반응으로 당질대사 장애가 초래되어 고혈당을 나타내는 질환이다.¹⁾

현재 전 세계 성인인구의 6.4%인 2억 8천만명이 당뇨병을 앓고 있으며,²⁾ 우리나라 당뇨병 환자는 지난 2006년 163만명에서 2010년 202만 명으로 계속 증가하는 추세이다.³⁾ 당뇨병 환자에서 고혈당이 지속되면 당뇨병성 신증, 당뇨병성 신경병증과, 당뇨병성 망막증이 나타날 수 있으며,⁴⁾ 그 중 대표적인 합병증의 하나인 당뇨병성 망막증은 초기에는 망막의 혈관이 확장되고 출혈이 되다가, 좀 더 진행되면 새로운 혈관이나 섬유조직이 형성되며 결국에는 망막박리나 초자체 출혈이 발생하면서 실명에 이르게 된다.⁵⁾ 현대 의학의 발달에도 불구하고 당뇨병에 대한 완치법이 아직까지 개발되지 못하고 있으며, 약물요법, 식사요법, 운동요법 등이 당뇨병 치료방법으로 이용되고 있으나, 현재 시도되는 약물요법은 위장장애, 급격한 혈당감소 등의 부작용을 나타낼 수 있으며 운동요법이나 식사요법만으로는 당뇨병의 완치가 어렵다.^6-8) 최근 당뇨병 치료제로 개발되어 사용되는 합성의약품의 경우 독성 및 알레르기 반응 등의 부작용이 나타나므로, 한약재를 포함한 천연물로부터 분리된 생리활성물질에서 혈당을 조절하고, 부작용이 적은 소재를 찾고자 하는 연구가 활발하게 진행되고 있다. ^8,9)

현재 당뇨병 및 당뇨합병증의 기전연구 및 약물의 효능 연구를 위해 제1형 당뇨동물모델인 스트렙토조토신(Streptozotocin, STZ)에 의해 유도된 설치류와 렙틴 리셉터(Leptin receptor)를 유전적으로 불활성화시킨 제 2형 당뇨모델db/db 마우스를 많이 이용하고 있다.^9-11) 특히, 기존 동물모델에서 당뇨합병증 치료제 효능 평가를 위해서는 많은 비용이 들고, 약물의 체중당 투여량을 최소 12주간 투여 해야 하므로 약물 소요량이 점점 늘어나게 되는 단점이 있다. 본 연구팀은 당뇨합병증의 치료제 개발 연구에 기존 동물모델의 단점을 보완하기 위해 최근 각광받고 있는 모델동물인 제브라피쉬(Danio rerio)를 이용하였다. 제브라피쉬는 척추동물로 유전자 구성면에서 인간과 90% 이상 유사하며 기관형성 과정이 비슷하고, 발생배(embryo)가 투명하여 일반적인 해부 현미경 아래에서 발생의 모든 과정을 육안으로 관찰하기 용이하여 모델동물로써 큰 장점을 가지고 있다.^12-14) 제브라피쉬는 현재 위암, 간암, 췌장암 등의 종양질환,^15,16) 심혈관질환, ^17,18) 뇌신경질환,^19-21) 피부질환,²²⁾ 비만과 당뇨와 같은 대사질환,²³⁾ 시각과 청각 장애^24,25) 등 다양한 분야에서 동물모델로 이용되고 있으며, 당뇨병성 망막증 모델로는 고혈당에 의해 유도된 망막 혈관 확장 현상을 보이는 모델이 보고 되었다.²⁶⁾ 본 연구그룹은 고혈당으로 처리된 제브라피쉬 치어의 유리체 혈관 변화를 통해 단기 당뇨병성 망막질환 모델로 제안하였다. 이 모델에서 VEGF 리셉터 억제제, 산화질소(Nitric oxide, NO) 억제제 및 상용화된 Lucentis^®(ranibizumab)의 처리에 의해 혈관 확장이 억제됨을 확인함으로써 in vivo 효능평가 모델임을 확인하였다.²⁷⁾ 제브라피쉬를 이용하여 얻어진 연구결과들은 인간의 질병연구 및 질환모델개발에 직접 적용이 가능하므로 본 실험에서는 천연물 추출물의 당뇨병성 망막질환 억제 효능을 in vivo에서 확인하였다.

본 연구는 제브라피쉬 치어를 이용하여 고혈당 조건에서 망막의 유리체 혈관(hyaloid vasculature)이 대조군에 비해 확장되는 현상을 관찰하고, 현재 제2형 당뇨병 치료제로 사용되고 있는 메트포르민(Metformin)을^28,29) 처리하여 유리체 혈관 확장이 정상과 같이 회복되는 것을 확인하였으며, 당뇨합병증의 주요 원인 인자인 최종당화산물(advanced glycation end products, AGEs)과 알도즈 리덕테이즈(aldose reductase, AR) 억제 효능이 우수하다고 기존 연구에서 보고된 8종의 천연물 추출물(Table 1)에 대해 망막 유리체 혈관 변화를 관찰하였다.^30-37)

 

Table I. Inhibitory activity of 80% ethanol extracts on high glucose induced vessel dilation in larval zebrafish.

 

재료 및 방법

 

제브라피쉬 사육 및 산란 - 제브라피쉬는 소형 열대담수어로 순환 여과 시스템을 갖춘 수조에서 생육 적정온도인 28.5℃ 유지되도록 사육한다. 최초 먹이는 수정 후 5일째부터 수정 후 15일째까지 encapsulon을 소량씩 투여하고, 이후에는 시판하고 있는 Brine shrimp(Artemia salina)를 24시간동안 부화시켜 먹이로 사용하였다. 제브라피쉬의 산란과 수정은 빛에 의해 유도되므로, 수정란을 얻기 위해 전날 저녁에 제브라피쉬 암, 수 각각 한 마리씩 전용 mating cage에 넣고 암반응을 유지한 뒤 다음날 빛에 반응하여 교미 및 산란이 유도된다. 수정란을 수집하여 Petri dish에 옮기고 egg water(Sea salts, 0.06 g/L)를 채워 28.5℃의 배양기에서 발생 시켰다. ³⁸⁾

제브라피쉬 치어를 이용한 당뇨병성 망막증 효능 검색

혈관내피세포에 특이적으로 형광단백질(Green Fluorescence Protein, GFP)이 발현하는 형질전환 제브라피쉬[Tg(kdrl:EGFP)] 암수를 교배하여 발생배를 획득하였다.³⁹⁾ 수정 24시간 째 형광단백질을 발현하는 발생배를 선별하여 24 well plate에 5 개체씩 분주한 후 30 mM glucose를 이용하여 고혈당(high glucose, HG)을 유도하였다. 이때 확인하고자 하는 약물을 glucose 용액에 적정 농도로 희석하여 처리하고, 약물 처리 후 2일 째 새로운 용액으로 교체하였다. 고혈당 조건에서 5일간 처리 한 후 고정액(4% paraformaldehyde)을 이용하여 하루 동안 고정하였다. 고정된 개체를 D.W(distilled water)로 수세하고, 3% trypsin[Tris-HCl(pH 7.8)]을 이용하여 37℃에서 80분간 반응시킨 후, 수정체를 분리하여 형광현미경(Olympus, SZX16, Japan)으로 유리체 혈관의 이미지를 얻은 후 Image J 프로그램으로 시신경 유두(optic disc)를 중심으로 일정한 거리에 있는 혈관의 두께를 측정하고, GraphPad Prizm 5 software(GraphPad, San Diego, CA, USA)로 분석하였다.²⁷⁾

식물 재료

Brandisia hancei Hook. f.(내강등)의 소지와 Spenceria ramalana Trimen(마제황)의 전초는 중국 운남성에서 2008년 8월 경에 채집하였으며, Castanopsis orthacantha Franch.(원강고)의 소지는 중국 운남성에서 2010년 6월 경에 채집하였으며, Harrisonia perforate (Blanco) Merr.의 줄기와 잎은 베트남 꽝찌성에서 2007년 11월 경에 채집하였으며, Litsea japonica (Thunb.) Juss.(까마귀쪽 나무)의 잎과 줄기와 Mallotus japonicus (Thunb.) Muell. Arg.(예덕나무)의 잎과 소지는 제주도 제주시에서 2010년 6월 경에 채집하였으며, Robinia pseudoacacia L.(아카시아나무)의 잎과 소지는 경기도 수원시에서 2010년 11월 경에 채집하였으며, Synedrella nodiflora (L.) Gaertn.의 줄기와 잎은 2010년 12월 경에 베트남 랑손에서 채집하였다. 채집한 식물은 가천대학교 김주환 교수에 의해 정확히 동정되었으며, 증거표본은 한국한의학연구원 내 식물표본실에 보관중이다.

추출 및 시료조제

분쇄 또는 절단한 시료 200 g에 2 L의 에탄올을 넣고 실온상태에서 3일간 3회 추출하였다. 이를 여과하여 40℃ 수욕상에서 감압농축을 실시한 후, 동결 건조기에서 건조 하였다.³¹⁾ 추출물은 실험 수행 전에 감압 하에서 P₂O₂를 이용하여 12시간 이상 재 건조한 후 DMSO(Sigma, St. Louis, MO, USA)에 용해시켜 stock solution을 조제하였으며 최종 DMSO의 농도가 0.1%가 되도록 30 mM glucose 용액에 희석하여 사용하였다.

 

결과 및 고찰

 

당뇨병은 전 세계적으로 중요한 성인병 중의 하나로, 최근 우리나라에서도 급속한 경제성장과 더불어 당뇨병 유병률이 급증하고 있으며 발생 연령이 낮아짐과 동시에 인간의 평균 수명은 길어지고 있어 합병증으로 진행되는 것은 피할 수 없는 상황이 되었다.⁷⁾ 기존 연구에서 선별된 최종당화산물 생성저해효능과 알도즈 리덕테이즈 억제 효능이 입증된 추출물 8 종에 대해서 제브라피쉬를 이용한 효능평가를 시행하였다.30-³⁷⁾ Fig. 1.에서 보여주는 것과 같이30 mM glucose 용액에서 5일간 배양한 고혈당군에서 치어 제브라피쉬 망막의 유리체 혈관이 대조군(Normal, NOR)과 비교하여 유의적으로 확장된 것을 확인할 수 있었으며(p<0.001, n=6-10), 확장된 혈관이 대조약물로 사용한 메트포르민(10 μM, 20 μM)에 의해 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 1. Effect of Metformin on HG-induced hyaloid-retinal vessel dilation in larval zebrafish. A) Representative images. a. Control zebrafish (NOR), The diameter of hyaloid vessels was measured at locations proximal to the optic disc (red circle); b. high glucose (30 mM) glucose treated zebrafish (HG); c-d. HG and metformin treated zebrafish (10 μM and 20 μM). B) Quantitative analysis of hyaloid-retinal vessel diameter. Metformin were significantly reduced the vessel dilation induced by high glucose. Data are presented as the mean ± S.E.M. (n=6∼10). ###P < 0.001 vs. NOR, ***P < 0.001, vs. HG. Scale bar = 50 μm

 

본 실험에서는 Fig. 2.에서와 같이 glucose와 Castanopsis orthacantha 80% 에탄올 추출물을 함께 처리한 실험군(1 μg/ml, 5 μg/ml)에서 고혈당에 의해 유도되는 혈관 확장 현상이 유의적으로 감소하는 것을 관찰하였으며, 8종의 80% 에탄올 추출물에 대해 유리체 혈관 확장 변화에 대해 분석하였다(Fig. 2). 현삼과의 B. hancei 에서 분리한 phenylethanoid glycosides는 항산화효과,⁴⁰⁾ 소태나무과의 H. perforate 뿌리에서 분리한 추출물은 대식세포항균효과,⁴¹⁾ 녹나무과의 L. japonica열매 추출물은 항골관절염 효과,⁴²⁾ 대국과의 M. japonicus 는 산화질소 발생 억제 효과,⁴³⁾ 콩과의 R. pseudoacacia 는 치석 및 치주염에 효과,⁴⁴⁾ 국화과의 S. nodiflora는 항균 및 항산화효과,⁴⁵⁾ 간 보호 효과,⁴⁶⁾ 항우울증 효능⁴⁷⁾에 대해 보고되었다. 참나무과의 C. orthacantha와 장미과의 S. ramalana는 현재 다른 활성에 대해 보고된 바가 없으며, 효과가 우수한 현삼과의 B. hancei, 녹나무과의 L. japonica, 장미과의S. ramalana는 본 연구팀에서 추출물과 분획물에 대해 당뇨합병증예방 및 치료용 물질로 확인하여 특허 출원을 한 바 있다(Fig. 3).

Fig. 2. Effect of C. orthacantha on HG-induced hyaloid-retinal vessel dilation in larval zebrafish. Representative images. a. Control zebrafish (NOR). The diameter of hyaloid vessels was measured at locations proximal to the optic disc (red circle). b. high glucose (30 mM) treated zebrafish (HG). c-d. HG and 80% EtOH extracts of C. orthacantha treated zebrafish (1 μg/ml and 5 μg/ml). C. orthacantha were significantly reduced the hyaloid-retinal vessel dilation induced by high glucose. Scale bar = 50 μm

 

 

Fig. 3. Quantitative data of herbal extracts on HG-induced retinal vessel dilation in larval zebrafish. The extracts of herbs were treated in HG-induced larval zebrafish. Hyaloid vasculature were analyzed from each lens. Vessel diameter was analyzed using Image J software. Data are presented as the mean ± S.E.M. (n=6∼10). ###P < 0.001 vs. NOR, ***P < 0.001, vs. HG

 

8종의 80% 에탄올 추출물에 대해 고혈당에 의한 유리체 혈관 확장 현상을 억제하는 효능(inhibition percent)을 분석하여 Table I과 같은 결과를 얻었다. Table I에서 보여 주는 것과 같이 실험을 진행한8종의 한약재 추출물 모두 고혈당 조건에서의 확장된 혈관이 유의적으로 감소하는 효능을 보였고, 그 중에서 5종의 추출물(Brandisia hancei, Castanopsis orthacantha, Litsea japonica, Spenceria ramalana, Synedrella nodiflora)은 억제 효능이 우수하여, 실험을 수행한 농도에서 정상수준(대조군 기준)까지 회복되는 효능이 있음을 알 수 있었다.

위 언급된 기존에 보고된8종의 약용식물에 대해서 최종당화산물 생성 억제 효능과 함께 in vivo제브라피쉬에서 망막 유리체 혈관 확장 현상을 탁월하게 억제하는 효능까지 확인하였다(Table I). 본 연구는 제브라피쉬 치어를 이용하여 당뇨에 의해 나타나는 합병증의 치료제 개발에 유용하게 활용되어질 수 있을 것이다.

 

결론

 

최종당화산물 생성저해효능과 알도즈 리덕테이즈 억제 효능이 입증된 추출물 8종의 80% 에탄올 추출물을 in vivo에서 고혈당에서 유도된 제브라피쉬 망막 유리체 혈관 확장 억제 효능을 조사하였다. 그 결과 8종 모두 억제 효과가 있었으며, 그 중에서도 5종이 고혈당 조건에서 두꺼워진 유리체 혈관을 정상수준까지 회복하는 우수한 효능이 있음을 확인하였다. 효능이 확인된 약용식물 추출물은 설치류 당뇨병성 망막증 모델에서 전임상 연구를 통한 추가 연구가 필요하며, 본 연구 결과에 따라 당뇨병성 망막병증 치료제 개발에 활용할 수 있을 것으로 기대한다.