Abstract
Extracts from Artemisia annua $Linn\acute{e}$ (AAE) have various functions (anti-malaria, anti-virus, and anti-oxidant). However, the mechanism of the effects of AAE is not well known. Thus, we determined the apoptotic effects of AAE in AGS human gastric carcinoma cells. In this study, we suggested that AAE may exert cancer cell apoptosis through the Akt/mammalian target of rapamycin (mTOR)/glycogen synthase kinase (GSK)-$3{\beta}$ signal pathway and mitochondria-mediated apoptotic proteins. Activation by Akt phosphorylation resulted in cell proliferation through phosphorylation of tuberous sclerosis complex 2 (TSC2), mTOR, and GSK-$3{\beta}$. Thus, de-phosphorylation of Akt inhibited cell proliferation and induced apoptosis through inhibition of Akt, mTOR, phosphorylation of GSK-$3{\beta}$ at serine9, and control of Bcl-2 family members. Inhibition of GSK-$3{\beta}$ attenuated loss of mitochondrial membrane potential and release of cytochrome C. Bax and pro-apoptotic proteins were activated by their translocation into mitochondria from the cytosol. Translocation of Bax induced outer membrane transmission and generated apoptosis through cytochrome C release and caspase activity. We also measured 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay, lactate dehydrogenase assay, Hoechst 33342 staining, Annexin V-PI staining, 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide staining, and Western blotting. Accordingly, our study showed that AAE treatment to AGS cells resulted in inhibition of Akt, TSC2, GSK-$3{\beta}$-phosphorylated, Bim, Bcl-2, and pro-caspase 3 as well as activation of Bax and Bak expression. These results indicate that AAE induced apoptosis via a mitochondrial event through regulation of the Akt/mTOR/GSK-$3{\beta}$ signaling pathways.
개똥쑥은 예로부터 항암, 항바이러스 및 항균의 효능을 지니는 것으로 알려져 왔지만 작용 기작에 대한 내용이 많이 알려지지 않았다. 본 연구에서는 AGS 인체 위암 세포를 대상으로 개똥쑥 추출물(AAE)에 의한 apoptosis 효과와 신호경로 연구를 시행하였다. AAE의 암세포 성장에 미치는 영향을 확인하기 위하여 AGS cell에 AAE를 처리하고 MTT assay와 LDH assay를 수행한 결과 AAE 농도 의존적으로 나타난 세포 성장 억제가 세포 손상에 의한 것임을 확인하였다. 또한, AAE에 의한 암세포 증식 억제 효과가 apoptosis에 의한 것인지 확인하기 위하여 Hoechst 33342 staining과 Annexin V-PI staining을 수행한 결과, Hoechst 33342 staining에서 apoptotic body와 세포질 응축이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였고, Annexin V-PI staining에서 apoptotic cells의 변화가 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다. Western blotting의 결과 AAE가 농도 의존적으로 세포 생장에 관여하는 신호 단백질인 p-Akt, p-TSC2, p-mTOR, p-GSK-$3{\beta}$의 발현이 감소함을 확인하였고, anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2의 발현이 억제됨으로써 proapoptotic 단백질인 Bax, Bak의 발현이 증가하는 일련의 신호경로를 조절할 수 있다는 것을 확인하였다. 미토콘드리아 막 전위의 탈분극 유도를 확인하기 위한 JC-1 assay 수행 결과, AAE 농도 의존적으로 미토콘드리아 막 전위의 탈분극이 유도됨을 확인하였다. 탈분극에 의한 caspase 활성을 확인하기 위해 caspase-3/7 activity assay를 수행한 결과, AAE 농도 의존적으로 caspase activity 증가를 확인하였다. 또한, apoptosis가 일어나는 일련의 신호경로를 확인하기 위해 apoptosis 상위 단백질인 Akt, mTOR, GSK-$3{\beta}$의 활성을 억제하는 LY294002, Rapamycin, BIO를 각각 AGS cell에 처리하고 세포증식에 미치는 영향과 신호 단백질의 발현 양상을 알아보기 위해 MTT assay, LDH assay, western blotting을 수행하였다. 그 결과 AAE와 LY294002, Rapamycin 처리군에서 세포증식 억제와 LDH 방출량 증가뿐만 아니라 세포 생장 신호 단백질인 p-mTOR, p-TSC2, p-Akt, p-GSK-$3{\beta}$의 발현이 감소하는 것을 확인하였고, Bcl-2의 발현이 억제됨으로써 Bax와 Bak의 발현을 증가시키는 신호경로를 조절할 수 있다는 것을 확인하였다. 따라서 AGS cell에 개똥쑥 추출물을 처리하였을 때 유도되는 apoptosis 효과는 Akt/mTOR/GSK-$3{\beta}$ 경로 활성 억제를 통해 Bcl-2 발현이 감소함에 따라 Bax, Bak를 활성화해 세포질로의 cytochrome C 유리에 따른 caspase 활성으로 이루어진다는 것을 알 수 있었다.