Biochemical and Molecular Characteristics of Vibrio anguillarum Isolated from Alaska Pollock Theragra chalcogramma Seedlings

명태(Theragra chalcogramma) 종묘에서 분리된 Vibrio anguillarum의 생화학적, 분자생물학적 특성

Abstract

The health of Alaska pollock Theragra chalcogramma seedlings was monitored during February and April 2015. After microscopic examination for parasites, 20 samples sets were made by pooling 50 individuals for each sample set. Then, they were homogenized and examined for viral and bacterial pathogens. No parasites or viruses were detected using either microscopy or PCR. Colonies suspected of belonging to the genus Vibrio were isolated from Tryptic Soya Agar and Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar plate incubations, and identified as Vibrio anguillarum based on biochemical and physiological examinations and PCR amplification of the 16S rDNA, recA, and pyrH genes. Although there was no mortality during the sampling period, 65.0% (13/20) of the pooled samples were PCR-positive for V. anguillarum. To prevent possible outbreaks, the pathogenic potential of V. anguillarum should be investigated in the future.

서 론

명태(Theragra chalcogramma)는 대구목(Gadiformes) 대구과(Gadidae)에 속하는 대표적인 한해성 어류로 우리나라의 동해안에서부터 오호츠크해, 베링해, 알래스카에 걸친 북태평양 해역에 넓게 분포하고 있다(Oh et al., 2004). 명태의 전 세계 어획량은 2001년에 약 300 만톤이 어획되었으나 2008년에는 약 260 만톤이 어획되어 총 생산량이 감소하고 있으며, 우리나라의 경우에도 2001년 약 20 만톤이 어획되었으나 2008년에는 약 2만 5천톤이 어획되어 어획 생산량이 크게 감소하고 있다(AT, 2010). 명태수급의 대부분을 원양어업에 의존하는 우리나라는 러시아와 명태 쿼터 협상이 난항을 거듭하고 있어 명태 수급은 더욱 불안정할 것으로 예상되며 앞으로 수입 의존도가 더 늘어날 것으로 추정되어 명태 자원회복이 매우 시급하다(Kim and Kim, 2014).

일본의 경우 우리나라에 비해 느리기는 하지만 90년대 이후 명태 자원양이 감소하는 추세가 나타나고 있으며, 주된 원인으로서 기후변화와의 관련성을 보고하고 있다(Shida et al., 2007). 또한 명태 인공종묘생산 기술을 보유하고 있으나(Ishida et al., 2014), 현재까지 완전양식기술은 개발되어 있지 않다. 우리나라에서도 최근 명태자원 회복을 위해 명태 인공종묘생산에 관한 연구가 시작되어 종묘생산에는 성공하였으나(Kwon et al., 2015), 아직 완전양식까지는 불가능한 상황이다.

어류양식의 성공여부를 결정짓는 요인 중 하나로서 종묘생산 과정에서 발생하는 폐사를 들 수 있으며 폐사원인의 규명은 생산성 향상과도 연결이 되므로 매우 중요하다. 현재까지 명태의 감염성 질병에 관해서는 ichthyophonus 감염증과 바이러스성 출혈성 패혈증(Viral hemorrhagic septicemia, VHS)이 알려져 있다(Meyers et al., 1999; White et al., 2014). 하지만, 이는 자연산 명태에서 보고된 것으로 양식산 명태에 발생하는 질병에 관해서는 보고된 바 없다.

강원도 해양심층수 수산자원센터에서 인공부화시켜 사육하고 있는 명태 종묘를 대상으로 2015년 2월-4월까지 9-11회에 걸쳐, 질병 모니터링을 실시하던 중 비브리오속(Genus Vibrio)으로 의심되는 세균이 분리되었다. 비브리오속 세균은 전 세계적으로 다양한 담수어 및 해산어 등에서 비브리오증을 유발하여 문제를 일으키고 있어(Frans et al., 2011), 명태의 인공종묘 생산 과정에서 발생할 수 있는 비브리오속 세균에 의한 피해를 최소화 하고 대책 마련을 위해서는 비브리오균의 명확한 동정이 선행되어야 한다.

본 연구에서는 명태 종묘에서 분리된 비브리오속 세균의 생화학적 및 분자생물학적 특성을 조사하여 종 수준에서 균주를 명확하게 동정하였다.

 

재료 및 방법

샘플링

2015년 2월에서 4월에 걸쳐 강원도 해양심층수 수산자원센터(강원도 고성군)에서 표층수(수심 10-15 m, 수온 5-7℃, Group Ⅰ)와 심층수(수심 605 m, 수온 4-5℃, Group Ⅱ)로 사육 중인 명태 종묘(전장, 6-10 mm) 50 마리씩을 9-11회(Group Ⅰ 11회, Group Ⅱ 9회) 무작위로 각각 샘플링하여 실험에 사용하였다(Table 1).

Table 1.Sampling of Theragra chalcogramma

생검 및 시료제작

샘플링한 명태 종묘의 아가미, 체표, 지느러미를 해부현미경(SMZ1000, Nikon, Japan)으로 관찰하여 기생충 감염 여부를 확인하고 멸균 PBS (Phosphate-buffered saline)로 2-3회 washing 하였다. 이후 명태 종묘 50마리씩을 pooling하여 균질화한 후, 50 mg을 취해 시료로 사용하였다.

바이러스검사

대구과 어류에서 보고된 바이러스(Nervous necrosis virus, NNV; Viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV; birnavirus; reovirus)(Glover et al., 2013; Samuelsen et al., 2006)를 대상으로 RT-PCR (Reverse-transcriptase Polymerase Chain Reaction) 분석을 실시하였다.

명태 종묘를 50마리씩 pooling하여 제작한 시료(총 20세트)는 9배 용량(450 μL)의 멸균 PBS를 첨가, 균질화한 후 Trizol(Invitorgen, USA)을 사용하여 RNA를 추출하고 M-MLV Reverse transcriptase(Bioneer, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성, RT-PCR의 template로 사용하였다. 실험에 사용된 primer set 및 PCR 조건은 Table 2에 나타내었다. 증폭된 산물은 전기영동으로 확인하였으며, 모든 RT-PCR 분석은 양성대조군 및 음성대조군을 사용하여 비교하였다.

Table 2.Oligonucleotide primers used for RT-PCR of viral disease

세균분리

바이러스검사용 시료와 동일한 방법으로 제작한 명태 종묘 시료를 1.5% NaCl을 첨가한 TSA (Trypticase soybean agar, Difco, USA) 배지에 20℃, 24-48시간 배양하여 나타나는 집락들을 육안으로 관찰, 외관상 서로 다르게 보이는 집락들을 선택하여 각각 1.5% NaCl이 첨가된 TSB 배지에 접종, 계대배양하여 이후의 실험에 사용하였다.

세균의 생화학적, 생리학적 특성

명태 종묘에서 분리된 균주의 생화학적 및 생리학적 특성을 확인하기 위해 20개 시료(Group Ⅰ 11개, Group Ⅱ 9개) 각각에서 1.5% NaCl이 첨가된 TSA 배지에 우점하는 colony를 하나씩 선택하여 총 20개의 colony를 선별하였다. 선별한 colony들은 1.5% NaCl이 첨가된 TSB (Trypticase soybean broth, Bacto, USA) 배지에서 20℃, 24시간 배양한 후 그람염색을 통해 균주의 형태를 관찰하였고, 생화학적 테스트인 API 20E(Biomerieux, France)와 oxidase test를 실시하였다. 비브리오속으로 의심되는 균주는 TCBS (Thiosulfate citrate bile salts sucrose, Difco, USA) 배지에 도말하여 colony의 생성 여부를 확인하였으며, 다양한 염분농도(0％, 3％, 6％, 8％, 10％ NaCl) 및 온도조건별(4℃, 20℃, 30℃, 35℃, 40℃) 성장 여부를 확인한 후, 기존에 알려진 비브리오속 세균들과 생화학적 및 생리학적 특성을 비교하였다.

세균의 분자생물학적 동정

20개의 시료에서 분리된 총 20개의 균주를 모두 1.5% NaCl이 첨가된 TSB 배지에서 24시간 배양한 후 3,000 rpm에서 10분간 원심분리, 상층액을 제거하여 세균 pellet을 제작하였다. 세균 pellet을 1.5 mL tube에 옮겨 PBS를 첨가하여 washing한 후, 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하고 상층액을 제거하여 새로운 세균 pellet을 제작하였다. 제작된 세균 pellet은 QIAamp DNA kit (QIAGEN, France)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 즉, 분리된 세균 pellet에 ATL (Tissue lysis buffer) 180 μL와 20 μL Proteinase K (10 mg/mL)를 첨가하여 60℃에서 overnight 시킨 후, AL (Lysis buffer) 200 μL를 첨가하여 70℃에서 10분간 반응시킨 뒤, 200 μL ethanol을 첨가하여 핵산을 침전시켰다. 침전된 핵산을 column tube에 넣고 원심분리하여 washing한 후, AE (Elution buffer) 200 μL를 첨가하여 DNA를 회수하였다.

분리된 모든 균주는 16S rDNA primer set을 사용하여 PCR을 실시하였고, TCBS 배지에서 yellow colony가 형성된 균주는 16S rDNA, pyrH (Uridylate kinase) gene 그리고 recA (recombination repair protein) gene primer sets을 사용하여 PCR을 실시하였다. 세균동정에 사용한 모든 primer sets의 정보 및 PCR 조건은 Table 3에 나타내었다. 증폭된 PCR산물은 1.5% agarose gel을 사용하여 전기영동 한 후 UV transilluminator상에서 확인 하였다. 타겟 부위에 생성된 gel을 잘라 Gel purification kit를 이용하여 정제한 결과물을 ABI Prism 3730 XL DNA analyzer (PE applied biosystems, USA)로 sequencing하여 염기서열을 결정하였다.

Table 3.Oligonucleotide primers used for PCR of bacteria identification

결정된 pyrH와 recA 유전자의 sequence들은 Blast search(NCBI, USA)를 이용하여 Genbank에 등재된 비브리오속 세균의 sequences data와 조합한 뒤, MEGA 6 Program을 이용하여 neighbor-joining tree를 제작하였다(Tamura et al., 2013)

 

결과 및 고찰

기생충 및 바이러스 검사

실험에 사용된 모든 명태 종묘(1,000 마리)의 아가미, 체표 및 내부장기를 해부현미경을 사용하여 검경한 결과, 기생충이 관찰되지 않았다(data not shown). 명태 종묘 50마리씩을 pooling하여 제작한 20개의 시료세트를 대구과 어류에서 보고된 바이러스(NNV, VHSV, birnavirus, reovirus)를 대상으로 RT-PCR 분석을 실시한 결과, 바이러스가 검출되지 않았다(data not shown).

세균검사

20개 시료(Group Ⅰ 11개, Group Ⅱ 9개)로부터 1.5% NaCl이 첨가된 TSA 배지에서 우점적으로 분리된 총 20개의 균주들을 각각 TCBS 배지에 도말하였다. 그 결과, 13개의 시료(Group Ⅰ 7개, Group Ⅱ 6개)에서 yellow colony가 나타났으며, 그 외 7개의 시료(Group Ⅰ 4개, Group Ⅱ 3개)는 TCBS 배지에서 colony가 나타나지 않았다. TCBS 배지에서 yellow colony가 나타난 13개의 시료에서 분리한 균주들은 생화학적, 생리학적 특성조사 및 분자생물학적 동정을 실시하였고, TCBS 배지에서 colony를 형성하지 않은 7개의 균주는 생화학적 동정 없이 분자생물학적 방법으로 동정하였다.

TCBS 배지에서 yellow colony로 확인된 균주들은 그람염색 결과 그람음성 간균으로 확인되어(data not shown) 비브리오속에 속하는 세균으로 추정, Noguerola and Blanch (2008)가 보고한 비브리오속 세균들과 생화학적 및 생리학적 특성을 비교하였다. API 20E와 oxidase test 결과 명태 종묘에서 분리된 균주는 기존에 보고된 V. anguillarum 균주와 Inositol, Amygladin을 제외하면 모두 동일한 생화학적 특성이 확인되었다(Table 4). 염분농도별로 세균의 성장여부를 조사한 결과 0%, 3% 그리고 6% NaCl이 첨가된 TSB 배지에서는 성장이 확인되었으나, 8%와 10%의 NaCl이 첨가된 TSB 배지에서는 성장이 확인되지 않았다. 온도조건별로 세균의 성장여부를 조사한 결과 20℃, 30℃, 35℃에서 성장이 확인되었으며 4℃와 40℃에서는 성장이 확인되지 않아, 염분 및 온도별 성장여부는 Vibrio anguillarum과 유사하였다(Table 4).

Table 4.ND: no data, +: positive, -: negative, v: variable1, V. anguillarum; 2, V. alginolyticus; 3, V. cholerae; 4, V. harveyi; 5, V. ichthyoenteri; 6, V. ordalii; 7, V. parahaemolyticus; 8, V. rotiferianus; 9, V. salmonicida; 9, V. splendidus; 10, V. vulnificus. ONPG, b-galactosidase; ADH, arginine dihydrolase; LDC, lysine decarboxylase; ODC, ornithine decarboxylase; CIT, citrate utilization; H2S, H2S production; URE, urease; TDA, tryptophane deaminase; IND, indole production; VP, Voges-Proskauer; GEL, gelatinase; GLU, glucose; MAN, mannitol; INO, inositol; SOR, sobitol; RHA, rhamnose; SAC, saccharose; MEL, melibiose; AMY, amygdalin; ARA, arabinose; OX, cytochrome oxidase.

비브리오속 세균은 그람 음성 간균으로 glucose의 발효능을 갖고, TCBS 배지에서 자라며, oxidase와 catalase 양성 반응을 나타내는 등의 특징이 있다(Pazos et al., 1993). V. anguillarum의 경우 oxidase와 catalase에 양성 반응을 나타내며, indole을 생산하는 능력이 없으며, arabinose를 분해하여 산을 생산하는 능력이 있는 것으로 알려져 있는데(Buller, 2004; Jee et al., 2011), 본 연구에서 명태의 종묘에서 분리된 균주는 oxidase 양성, indole 음성, arabinose 양성으로 확인되었으며 온도 및 염분별 성장여부도 V. anguillarum과 가장 유사하게 나타나 V. anguillarum으로 추정할 수 있었다.

TCBS 배지에서 yellow colony가 확인된 13개 균주와 TCBS 배지에서 colony를 형성하지 않은 7개의 균주를 모두 16S rDNA sequencing을 실시하였다. TCBS 배지에서 yellow colony로 확인된 13개의 시료는 NCBI Blast search 결과 V. anguillarum과 99% 이상의 상동성이 확인되어(Table 5), 동일한 균주로 추정할 수 있었다. 그러나 TCBS 배지에서 colony를 형성하지 않고 1.5% NaCl이 첨가된 TSA 배지에서만 colony를 형성한 나머지 7개의 시료는 NCBI Blast search 결과 Photobacterium phosphoreum (Group Ⅰ-1, 99%), Shewanella baltica (Group Ⅰ-3, Ⅱ-9, 98%), Pseudoalteromonas sp. (Group Ⅰ-6, 99%), Photobacterium iliopiscarium (Group Ⅰ-10, 99%; Group Ⅱ-5, 98%), S. woodyi(Group Ⅱ-1, 95%)로 동정되었다.

Table 5.1, This study; 2, V. anguillarum; 3, V. alginolyticus; 4, V. cholerae; 5, V. harveyi; 6, V. ichthyoenteri; 7, V. parahaemolyticus; 8, V. rotiferianus; 9, V. splendidus; 10, V. vulnificus.

비브리오속 세균은 전 세계적으로 수십 종 이상 보고되고 있으며 표현형의 변이가 심하고 특정 유전자의 상동성이 높아 동정에는 주의가 필요하다(Chang et al., 2008; Fabbro et al. 2010). Pascual et al. (2010)은 비브리오속 세균은 16S rDNA sequences가 매우 유사하여 종간 구별이 쉽지 않은데, 특히 Vibrio core group에 속하는 6개의 종(V. alginolyticus, V. campbellii, V. harveyi, V. parahaemolyticus, V. natriegens, V. rotifierianus)은 16S rDNA sequences가 97.6% 이상의 상동성을 나타내어 16S rDNA를 이용한 비브리오균의 종 동정에는 한계가 있다고 보고하였다.

본 연구에서 분리된 비브리오균의 명확한 동정을 위해 Thompson et al. (2005)이 제시한 비브리오속 세균을 특이적으로 동정하는데 사용되는 pyrH와 recA gene을 PCR증폭 후 sequencing하여 염기서열을 결정하였다(Genbank accession no.: KU879251, KU879252). 그 결과, 타겟 유전자 모두 V. anguillarum과 99% 이상의 상동성이 확인되었으며(Table 6, 7). 계통분석 결과 본 연구에서 분리된 균주는 기존에 보고된 V. anguillarum과 같은 cluster에 속하였다(Fig. 1, 2). 본 연구에서 분리된 균주의 pyrH, recA gene과 16S rDNA (Genbank accession no.: KX238882)의 sequence와 기존에 보고된 V. anguillarum외의 비브리오속 세균들과 유전적 상동성을 비교해 보았을 때 pyrH gene은 81.3-87.3%, recA gene은 80.3-85.2%, 16S rDNA는 93.7-97.7%의 상동성이 각각 확인되어(Table 5, 6, 7), pyrH와 recA gene이 16S rDNA 보다 비브리오속 세균을 동정하는데 유용한 것으로 확인되었다.

Table 6.1, This study; 2, V. anguillarum; 3, V. alginolyticus; 4, V. cholerae; 5, V. harveyi; 6, V. ichthyoenteri; 7, V. parahaemolyticus; 8, V. rotiferianus; 9, V. splendidus; 10, V. vulnificus.

Table 7.1, This study; 2, V. anguillarum; 3, V. alginolyticus; 4, V. cholerae; 5, V. harveyi; 6, V. ichthyoenteri; 7, V. parahaemolyticus; 8, V. rotiferianus; 9, V. splendidus; 10, V. vulnificus.

Fig. 1.Molecular phylogenetic tree showing the genetic relationships among Vibrio spp. based on pyrH genes sequences. The tree was constructed using the neighbor-joining criteria by MEGA version 6 (Tamura et al., 2013).

Fig. 2.Molecular phylogenetic tree showing the genetic relationships among Vibrio spp. based on recA genes sequences. The tree was constructed using the neighbor-joining criteria by MEGA version 6 (Tamura et al., 2013).

결론적으로 명태 종묘에서 분리된 균주는 생화학적 및 분자생물학적 특징을 종합해 볼 때 V. anguillarum으로 동정할 수 있었다. 총 20개의 시료중 65.0% (13/20)에서 V. anguillarum이 분리되었으며, Group Ⅰ (표층수)에서 63.6% (Group Ⅰ-2, 4, 5, 7, 8, 9, 11; 7/11), Group Ⅱ (심층수)에서 66.7% (Group Ⅱ-2, 3, 4, 6, 7, 8; 6/9)의 시료에서 V. anguillarum이 분리되어 본 연구에서 사육수의 종류에 따른 검출률의 차이는 관찰되지 않았다.

Vibrio anguillarum은 주로 물리적 또는 화학적 자극에 의해 손상된 점막을 통해 어체 내로 침입, 감염하지만 일부 오염된 먹이 등을 통해 경구로 침입, 감염하기도 한다고 알려져 있다(Frans et al., 2011). 본 연구에서 명태 종묘에서 분리된 V. anguillarum의 먹이를 통한 감염 가능성을 확인해 보기 위해 명태 종묘의 먹이로 사용된 로티퍼(Branchionus rotundiformis)와 알테미아(Artemia sp.)에서 세균 분리를 시도하였으나 V. anguillarum이 검출되지 않았다(data not shown).

Vibrio anguillarum은 1893년 뱀장어에서 처음으로 보고된 이후 무지개송어(Rainbow trout, Oncorhynchus mykiss), 대서양연어(Atlantic salmon, Salmo salar), 터봇(Turbot, Scophthalmus maxima), 농어(European seabass, Dicentrarchus labrax), 대구(Atlantic cod, Gadus morhua), 유럽뱀장어(eel, Anguilla anguilla) 등 50 여종 이상의 어류에 감염, 발병하여 문제를 일으키는 것으로 보고되고 있지만(Frans et al., 2011), 조건성 병원체로 병원성이 낮거나 없는 것으로도 알려져 있다(Dierckens et al., 2009).

본 연구에서 명태 종묘에서 분리된 V. anguillarum의 경우 샘플링 기간 동안 명태에서 지속적으로 분리되었지만 대량 폐사가 발생하지 않은 점에 비추어 볼 때, 분리균주의 병원성이 낮거나 사육환경 등이 나빠져 어체의 면역력이 떨어졌을 때 폐사가 발생할 가능성이 있을 것으로 생각된다. 차후 병원성 유무의 확인을 위해서는 인위 감염실험 등이 필요할 것이다.