해독사물탕(解毒四物湯)이 피부 접촉성 과민반응에 미치는 영향(影響)

Effects of Haedoksamul-tang on Trimellitic Anhydride-induced Contact Hypersensitivity in a Mouse Model

Abstract

Objectives : Haedoksamul-tang (HSTE), a water extract from a mixture of Phellodendri Cortex, Coptidis, Scutellariae Radix, Gardeniae Fructus, Angelica acutiloba Radix, Cnidii Rhizoma, Paeoniae Radix, Rehmanniae Radix, has been traditionally used for allergic skin diseases such as atopic dermatitis and contact dermatitis in oriental countries. However, little is known about the effects of aqueous extract of HSTE on trimellitic anhydride (TMA)-induced contact hypersensitivity (CHS) in a mouse model. Methods : In this study, we investigate the pharmacological effects of HSTE on TMA-induced CHS in Balb/c mice. Contact hypersensitivity was induced in mice by topically sensitizing and challenging with TMA in flank skin and ears during oral administration (for 17 days) and topical treatment (30 min before challenge) with HSTE. We examined the effects of HSTE on IgE and IgG1 levels, inflammatory parameters in ear tissues, CD4⁺/CD8⁺ ratio, cytokine and chemokine production in sera, tissues, and immune cells from TMA-sensitized mice.Results : Oral and topical administration with HSTE reduced, in a dose dependent manner, thickness and leukocyte infiltration of ear tissues and IgE levels in serum from mice sensitized with TMA. In addition, auricula lymph node cells isolated from TMA-sensitized mice significantly elevated the expression ratio of CD4⁺/CD8⁺ as well as increased the production of IL-4, IL-5, IL-13 and IFN-γ by ex vivo stimulation with antibodies against CD3 and CD28, and these inflammatory indexes, except for IFN-γ, were significantly suppressed by orally and topically administration of HSTE. Furthermore, stimulation of auricula lymph node cells from TMA-sensitized mice with antibodies against CD3 and CD28 increased the production of MCP-1/CCL2 and MIP-1α/CCL3, and these effects were inhibited in a dose-dependent manner in cells from mice treated with HSTE. Conclusions : These results suggest that HSTE can be used for treating contact hypersensitivity by inhibiting leukocyte infiltration as well as production of serum IgE and chemokine/Th2 cytokine in an animal model.

Ⅰ. 緖 論

解毒四物湯은 黃柏(Phellodendri Cortex), 黃連(Coptidis), 黃芩(Scutellariae Radix), 梔子(Gardeniae Fructus), 當歸(Angelica acutiloba Radix), 川芎(Cnidii Rhizoma), 白芍藥(Paeoniae Radix), 生乾地黃(Rehmanniae Radix)으로 구성되어 있는 處方으로, 朱1)의 丹溪心法附餘에 “解毒四物湯 治婦人經脈不住, 惑如豆汁, 五色相雜, 面色痿黃, 臍腹刺痛, 寒熱往來, 崩漏不止.”라고 최초로 기재된 이래 溫淸散2), 溫淸飮3)이란 이름으로도 불리는 方劑이다.

黃連解毒湯과 四物湯의 合方으로 補血養血과 淸熱瀉火作用이 동시에 있는 方劑로, 血熱로 인한 諸出血(子宮出血, 血尿, 衄血)과 皮膚疾患(皮膚炎, 濕疹, 瘙痒, 瘡)을 治하고 自律神經系를 鎭靜시키므로 神經症, 上衝症에 活用할 수 있는 方劑로, 消炎 解熱 鎭靜 滋養의 攻補兼治의 效能이 있는 方劑이다4,5).

이러한 解毒四物湯은 婦人의 生理不順, 生理痛, 子宮出血 등의 治療 목적으로 立方 되었으나, 最近에는 만성적으로 경과된 완고한 피부점막질환인 皮膚瘙痒症, 慢性濕疹, 아토피성피부염, 알러지성피부염, 蕁痲疹, 베체트증후군 등에 응용되고 있는 方劑로 특히, 일본에서는 아토피 피부염의 치료에 解毒四物湯이 활용되는 사례가 많은 것으로 보고되어있다6-9).

또한 李10)는 아토피 피부염에 상용되는 38종 處方을 분석하여 解毒四物湯이 生料四物湯, 升麻葛根湯, 回春凉膈散, 導赤散, 平胃散, 荊防敗毒散, 九味羌活湯, 白虎湯, 桂枝湯, 六味地黃湯 등의 處方과 함께 아토피 피부염 치료의 기본방으로 활용되고 있음을 보고하였다.

아토피 피부염(atopic dermatitis)은 주로 幼兒와 小兒에 발생하며, 瘙痒感, 紅斑, 浮腫, 滲出과 부스럼, 딱지 등의 증상이 나타나는 피부질환으로11-13), 韓醫學에서는 奶癬, 胎癬, 胎斂瘡, 濕疹, 濕瘡, 四彎風, 浸淫瘡 등의 範疇에 해당되는 알러지성 피부질환이다14).

최근 이러한 아토피 피부염 등의 알레르기성 피부질환과 관련한 解毒四物湯에 관한 연구를 살펴보면, 洪15)은 DNCB로 유도된 NC/Nga 아토피 생쥐 모델에서 溫淸飮과 三黃洗濟加味方 병용이 미치는 영향을 보고 하였고, 范16)은 溫淸飮과 加味溫淸飮이 抗알레르기 反應과 血液凝固에 미치는 영향을, 그리고 金17)은 RAW 264.7세포에 미치는 解毒四物湯의 효과에 대한 관찰을 통해 항염효과를 보고 하였다. 그러나 산업사회에서 빈번히 사용되고 있는 휘발성 유기용매에 의해 야기되는 알레르기성 피부질환에 대한 解毒四物湯의 효과에 대한 연구는 없는 실정이다.

이에 저자는 휴발성 유기용매인 TMA로 접촉성 과민반응을 유도한 BALB/c 마우스를 대상으로 귀의 부종, 귀 조직의 백혈구 침윤, 혈청 IgE와 귀 밑 림프절(auricula lymph node)의 CD4+/CD8+의 비율, 케모카인 및 Th2 사이토카인의 생산에 解毒四物湯이 미치는 효과를 조사하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

 

Ⅱ. 材料 및 方法

1. 材料

1) 試藥

Trimellitic anhydride (TMA), acetone, isopropylmyristate, biotin-conjugated monoclonal rat anti-mouse IgE mAb 또는 biotin-conjugated monoclonal rat anti-mouse IgG1 mAb, avidin-alkaline phosphatas, ρ-nitrophenyl-phosphate 등은 Sigma- Ardrich사(St Louis, MO)로 부터 구입하였다. RPMI 1640, streptomycin/penicillin, glutamine, 우태아혈청(FBS)은 Gibco/BRL사(Grand Island, NY. USA)로부터 구입하였으며, IL-4, IL-5, IL-13, MCP-1/CCL2와 MIP-1α/CCL3 등 ELISA immunoassay kits는 R&D사(Minneapolis, MN, USA)로부터 구입하였다. Anti-mouse CD3, anti-mouse CD28, FITC conjugated anti-mouse CD4와 PE-conjugated anti-mouse CD8 mAb는 PharMingen사(San Diego, CA, USA)로부터 구입하였다. 기타 시약은 reagent grade로 Sigma-Ardrich사로부터 구입하여 사용하였다.

2) 藥物의 추출

실험에 사용한 解毒四物湯의 구성 藥材는 (주)옴니허브에서 구입하였다. 解毒四物湯의 구성 비율은 Table 1과 같이 각 약재를 1돈(4g)씩 동량으로 정량하여 총 10첩(320g)을 한약추출기(일광기계, 신토불이 황토약탕기)에 주입하였고, 정수기(월드린, 역삼투압 정수기)에서 정수된 물 5000㎖를 첨가하여 100℃에서 2시간 30분 동안 전탕하였다. 추출된 解毒四物湯 2000㎖를 동결 건조하여 31.5 g을 얻고 -20℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다.

Table 1.Oriental Crude Drug Composition of Haedoksamul-tang Extract (HSTE)

3) 實驗動物

무균환경에서 사육된 7주령의 암컷 BALB/c 마우스는 중앙동물실험실(서울)사로 부터 구입하였다. 마우스는 1주일간 스트레스를 해소하기 위해 1주일간 낮과 밤의 주기를 12시간씩 고정하여 사료(중앙동물실험실)와 멸균 물을 공급하면서 사육한 후 실험동물위원회의 실험 규정에 준하여 실험에 사용하였다.

2. 方法

1) 실험설계

마우스 옆구리 털을 안과용 가위로 주의 깊게 자르고 제모크림을 바르고 25℃ 물을 이용하여 털을 제거한 후 10% TMA를 감작 및 공격하기 전에 즉시 아세톤과 isopropylmyristate(4:1, v/v)에 용해하였다. TMA-유도 피부 접촉성 과민반응의 유도에 따른 解毒四物湯의 효과를 조사하기 위해서 Fig. 1과 같이 실험설계를 하여 수행하였다. 요약하여 설명하면, TMA 감작과 공격은 Fukuyama 등18)의 방법을 약간 변형하여 50 ㎕ TMA(10%)를 옆구리에 3일간 연속으로 하루에 1회씩 5일 간격으로 3회 도포하였으며, 29일에 25 ㎕ TMA(10%)를 3일간 연속으로 귀에 공격하였다.

Fig. 1.Schematic diagram of experimental protocol. Mice were sensitized on saved flank skin with and without 50 ㎕ of 10% TMA on day 1-3, 8-10 and 15-17. On day 29, 30 and 31, mice were challenged with or without 25 ㎕ of 10% TMA on the dorsum of both ears. Control group received only filtered water for 31 days, Experimental groups received the different dose of HSTE (50-400 ㎎/㎏ body weight) one times per day for 17 days, and applied topical treatment 20 ㎕ of 3% HSTE on the dorsum of both ears.

2) 약물의 처리

스트레스가 해소된 8주령의 BALB/c 마우스를 5마리씩 분주하여 TMA로 감작하기 2시간 전부터 대조군과 실험군은 각각 생리식염수와 解毒四物湯 추출물(HSTE, 50-200 ㎎/㎏ 체중)을 하루에 1회씩 17일간 경구투여 하였으며, 공격일인 29일부터는 TMA로 공격전 30분에 20 ㎕ HSTE(3%)를 도포하였다.

3) 귀 두께 측정 및 피부조직

마우스 귀 두께의 측정은 TMA로 공격한 후 4시간에 양쪽 귀의 두께를 디지털 두께 측정기(Model 7326, Japan)로 측정하였다. 실험 과정에 따라 대조군과 실험군을 대상으로 희생시키고, 귀 피부조직 약 5×5 ㎜를 적출하여 4% paraformaldehyde(㏗ 7.4)로 고정하고 일련의 과정을 통하여 파라핀 블록을 제작한 후, 5 μm 간격으로 조직을 종단면으로 절편 하였다. 조직학적 검사와 백혈구 침윤을 검사하기 위해 Hematoxylin & Eosin, Wright Giemsa, Congo red 또는 Toluidine blue로 염색하고 저배율(X40)에서 관찰하고 확대하면서 X200 현미경 시야에서 사진을 찍어 제시하였고, 백혈구의 침윤을 확인하기 위해 X400 현미경 시야에서 검경하였다(Olympus, Japan).

4) 혈청의 IgE 및 IgG1 측정

혈청내 IgE 및 IgG1의 정량은 Sandwich ELISA법으로 측정하였다. 요약하면, anti-mouse IgE 또는 anti-IgG1은 코팅완충액(0.1 M NaHCO3, ㏗ 8.2)을 이용하여 high binding i㎜unoplate에 well 당 100 ㎕를 주입하고 4℃에서 24시간 방치한 다음 0.1% Tween 20이 포함되어 있는 PBS로 3회 세척하고 3%(wt/vol) BSA-PBS를 주입하고 2시간 동안 블로킹하였다. 혈청은 IgE 또는 IgG1을 측정하기 위해서 1:10으로 희석하였다. 혈청과 항원은 4℃ 상태에서 12시간 이상 방치한 후 0.05% gelatin 용액에 biotin-conjugated monoclonal rat anti-mouse IgE mAb 또는 biotin-conjugated monoclonal rat anti-mouse IgG1 mAb 를 주입하고 실온에서 1시간 동안 방치했다. 발색은 avidin-alkaline phosphatase(1:1000)를 주입하고 실온에서 1시간동안 반응 시킨 다음 6회 세척하여 phosphatase 기질인 ρ-nitrophenylphosphate, disodium을 첨가하고 발색시켜 405 ㎚에서 microplate reader (Molecular Devices)로 흡광도를 측정하였다. PGE2의 측정은 R&D사가 제시한 방법에 준하여 ELISA법으로 측정하였다.

5) Auricula lymph node 적출 및 세포 부유액 준비

마지막 공격한 다음 24시간 후 실험 마우스를 희생시키고 auricula lymph node를 양쪽 귀로부터 적출하고 마리당 두 개의 lymph node의 무게를 전자저울을 사용하여 측정하였다(Sartorius, Germany). 적출된 auricula lymph node는 1% streptomycin/penicillin이 함유된 냉각 인산완충용액(㏗ 7.2)에 들어 있는 페트리접시에 옮긴 후 핀셋으로 lymph node 캡슐을 제거하고 잘게 찢고 피펫팅하여 세포를 유출시키고 50 μm 라이론 메쉬를 통과시켜 단일세포 부유액을 만들었다.

6) Auricula lymph node 세포의 배양 및 ELISA

세포 부유액은 RPMI1640 배양액으로 2회 원심 세척 후 streptomycin (100 μg/mL), penicillin(100 U/mL), glutamine (5 mM)과 10% FBS가 함유된 RPMI 1640 배지에 부유시키고 24 well 배양용기에 well 당 1.0×106 세포의 농도로 접종하고 3시간 후에 anti-CD3 (1 μg/ml)과 anti-CD28 (1 μg/ml)로 자극하고 37℃가 유지되는 CO2 배양기(95대기/5%CO2)에서 48시간 동안 배양한 다음 세포 상층액을 얻고 -70℃에서 보관하면서 사이토카인 및 케모카인 측정에 사용하였다. 배양액으로부터 IL-4, IL-5, IL-13, IFN-γ, MCP-1/CCL2 및 MIP-1α/CCL3의 immunoassay는 R&D사가 제시한 ELISA 방법에 의하여 측정하였다.

7) CD4+/CD8+ 비율

Auricula lymph node로 부터 얻은 세포 부유액(1.0×106/100 ㎕)을 유식세포분석용 튜브에 주입하고 FITC conjugated anti-mouse CD4와 PE-conjugated anti-mouse CD8를 5 ㎕씩 주입한 후 2시간 동안 방치하고 1% paraformaldehyde(pH 7.4)로 고정하였다. CD4+와 CD8+ 세포 수는 flow cytometry (FACS, PharMingen, USA)를 활용하여 형광강도를 측정하고 CD4+와 CD8+ 의 비율을 계산하였다.

8) 통계처리

모든 실험값은 평균±표준오차로 표시했으며, 통계분석은 ANOVA와 Student’s t-test로 처리했으며, 유의성 한계는 p<0.05로 정하였다.

 

Ⅲ. 實驗 結果

1. 귀 두께에 미치는 解毒四物湯의 억제 효과

스트레스가 해소된 8주령의 BALB/c 마우스에 감작 기간인 17일 동안 하루에 1회씩 解毒四物湯을 농도별(50-400 ㎎/㎏)로 경구투여하고 2시간 후에 TMA로 재료 및 방법에 제시한 방법으로 감작하였다. 감작 후 29-30일까지 하루에 1회씩 TMA로 공격전 30분에 20 ㎕ HSTE(3%)를 도포하였다. 그 후 TMA로 공격한 다음 4시간 후에 1일당 1회씩 3일간 귀의 두께를 측정하였다. 그 결과 Fig. 2와 같이 TMA가 처리된 양성 대조군은 解毒四物湯과 TMA가 처리되지 않은 음성 대조군에 비해 매우 심하게 부종과 피부 병변이 유발되어 귀의 두께가 현저히 증가하였으나 解毒四物湯이 투여된 실험군에서는 농도에 의존적으로 귀의 부종이 감소되었다(Fig. 2). 특히, 200 ㎎/㎏과 400 ㎎/㎏ HSTE 투여군에서는 공격 후 2일부터 유의하게 억제 효과가 있었으며(p<0.05, p<0.01), 3일 후에는 그 억제 효과가 현저했다(p<0.01).

Fig. 2.Effect of HSTE on ear thickness in TMA-treated mice. Mice were orally administrated with or without different doses (50-400 ㎎/㎏/day) of HSTE for 17 days. During the challenge period, mice were externally applied with 20 ㎕ of 3% HSTE in 30 min before TMA treatment. Ear thickness was measured using a dial caliper every day. Data are shown as mean±S.D. (n=5). *=p<0.05 and **=p<0.01 versus a group of mice treated with TMA alone.

2. 조직학적 변화에 미치는 解毒四物湯의 효과

解毒四物湯 투여와 TMA 마지막 공격 24시간 후에 귀 조직 표본을 제작하여 Hematoxylin & Eosin으로 염색하여 解毒四物湯 투여에 따른 귀조직 형태의 변화를 조사한 결과 Fig. 3과 같이 TMA가 처리된 양성대조군은 解毒四物湯과 TMA가 처리되지 않은 음성대조군에 비해 매우 심하게 귀의 표피층(epidermis)이 두꺼워졌으며, 염증현상이 유발되어 백혈구의 침윤이 현저히 증가되었다. 그러나 50 ㎎/㎏의 HSTE가 투여된 실험군에서는 표피의 두께와 염증 억제효과가 없었지만, 100-400 ㎎/㎏ 투여군에서는 의존적으로 표피의 두께와 염증 억제효과가 뚜렷하였다. 특히, 400 ㎎/㎏ HSTE 투여군은 음성대조군의 귀 조직 상태와 유사할 정도로 개선되었다.

Fig. 3.Effects of HSTE on changes in morphological and skin thickness in TMA-treated mice. Mice were orally administrated with or without different doses (50-400 ㎎/㎏/day) of HSTE for 17 days. During the challenge period, mice were externally applied with 20 ㎕ of 3% HSTE in 30 min before TMA treatment. Skin tissues were obtained from experimental and control mice on 32 days. Tissue sections (5 ㎛ thick) were stained with hematoxylin & eosin and the photographed by microscopy (x200).

3. 백혈구 침윤에 미치는 解毒四物湯의 효과

귀 조직의 백혈구 침윤에 미치는 解毒四物湯의 효과를 알아보기 위해서, Wright Giemsa, Congo red 또는 Toluidine blue 염색을 하여 단핵세포(mononuclear cell) 호중구 (neutrophil), 비만세포(mast cell) 및 호산구(eosinophil)의 침윤을 조사하였다. 그 결과 Fig. 4와 같이 음성대조군에 비해 TMA가 처리된 양성대조군은 귀조직의 진피(dermis)층에 혈관이 확장되었고, 표피층과 진피층(dermis)에 ㎟당 단핵세포가 165.2±25.1개, 비만세포가 37.5±6.6, 호산구가 39.5±12.61개 그리고 호중구가 69.7±18.5개로 매우 높은 백혈구의 침윤이 관찰되었다(Fig. 4). 그러나 解毒四物湯 투여군은 농도에 의존적으로 단핵세포, 비만세포, 호산구 및 호중구의 침윤이 억제 되었으며, 200 ㎎/㎏과 400 ㎎/㎏ 투여군에서는 백혈구의 침윤이 현저히 억제되었다.

Fig. 4.Effects of HSTE on leukocyte infiltrations in TMA-treated mice. Mice were orally administrated with or without different doses (50-400 ㎎/㎏/day) of HSTE for 17 days. During the challenge period, mice were externally applied with 20 ㎕ of 3% HSTE in 30 min before TMA treatment. Skin tissues were obtained from experimental and control mice on 32 days. Tissue sections (5 ㎛ thick) were stained with Wright Giemsa, congo red or toluidine blue and then counter stained with hematoxylin & eosin. Leukocyte infiltrations were determined under a microscope (x400). Data are shown as mean±S.D. of the numbers of infiltrated leukocytes (n=5). *=p<0.05 and **=p<0.01 versus a group of mice treated with TMA alone

4. IgE 생산에 미치는 解毒四物湯의 효과

解毒四物湯이 TMA로 유도된 Balb/c 마우스의 혈청 IgE와 IgG1의 생산에 미치는 영향을 알아보기 위하여 TMA와 解毒四物湯이 투여된 마우스를 대상으로 혈청을 얻고 ELISA assay kit를 이용하여 IgE와 IgG1의 생산량을 측정하였다. 그 결과 Fig. 5와 같이 정상대조군의 혈청 IgE의 양은 베이스 수준이었지만, TMA로 공격된 양성대조군은 5,167±1,340 ㎎/㎖로 현저히 증가되었다. 그러나 解毒四物湯이 투여된 실험군에서 IgE의 생산은 50 ㎎/㎏과 100 ㎎/㎏ 처리군에서는 유의한 효과는 없었지만, 200 ㎎/㎏(p<0.05)과 400 ㎎/㎏(p<0.01) 처리군에서는 현저히 억제하는 효과가 있었다. IgG1 생산에 미치는 解毒四物湯의 효과를 조사한 결과 Fig. 6과 같이 정상대조군의 혈청 IgG1의 양은 베이스 수준이었지만, TMA로 공격된 양성대조군은 5,650±1,015 ㎍/㎖로 현저히 증가되었다. 고농도 투여군인 400 ㎎/㎏ HSTE(p<0.05)에서만 억제하였을 뿐 다른 사용농도에서는 큰 영향을 미치지 않았다.

Fig. 5.Effects of HSTE on serum levels of IgE in TMA-treated mice. Mice were orally administrated with or without different doses (50-400 ㎎/㎏/day) of HSTE for 17 days. During the challenge period, mice were externally applied with 20 ㎕ of 3% HSTE in 30 min before TMA treatment. Sera were obtained from TMA-sensitized and control mice on 32 days. Serum levels of IgE were measured using an anti-mouse IgE ELISA assay kit. Data are shown as mean±S.D. (n=5). *=p<0.05 and **=p<0.01 versus a group of mice treated with TMA alone.

Fig. 6.Effects of HSTE on serum levels of IgG1 in TMA-treated mice. Mice were orally administrated with or without different doses (50-400 ㎎/㎏/day) of HSTE for 17 days. During the challenge period, mice were externally applied with 20 ㎕ of 3% HSTE in 30 min before TMA treatment. Sera were obtained from TMA-sensitized and control mice on 32 days. Serum levels of IgG1 were measured using an anti-mouse IgG1 ELISA assay kit. Data are shown as mean±S.D. (n=5). *=p<0.05 versus versus a group of mice treated with TMA alone.

5. Auricula lymph node의 무게와 림프구의 CD4+/CD8+ 비율에 미치는 解毒四物湯의 효과

解毒四物湯이 TMA에 의해 유도된 과민성 반응에 마치는 영향을 알아보기 위해서, 마지막 공격 후 24시간에 auricula lymph node를 적출하여 무게를 측정한 결과 Fig. 7과 같이 정상대조군(4.95±0.63 ㎎)에 비해 TMA로 감작된 양성대조군은 18.25±2.35 ㎎으로 현저히 증가되었다. 그러나 解毒四物湯이 투여된 실험군에서 auricula lymph node의 무게는 농도에 의존적으로 억제하는 효과가 있었다. 특히 200 ㎎/㎏(p<0.05)과 400 ㎎/㎏(p<0.01) 처리군에서는 현저히 억제하는 효과가 있었다.

Fig. 7.Effects of HSTE on auricula lymph node weight1 in TMA-treated mice. Mice were orally administrated with or without different doses (50-400 ㎎/㎏/day) of HSTE for 17 days. During the challenge period, mice were externally applied with 20 ㎕ of 3% HSTE in 30 min before TMA treatment. Auricula lymph nodes were obtained from TMA-sensitized and control mice on 32 days. Weight of lymph nodes was measured using a electric microbalance. Data are shown as mean±S.D. (n=5). *=p<0.05 and **=p<0.01 versus versus a group of mice treated with TMA alone.

한편 TMA로 마지막 공격 후 auricula lymph node를 적출하여 림프구의 단일세포 부유액을 만들어 100 ㎕ 당 1.0×106세포로 적정하고 FITC conjugated anti-mouse CD4와 PE-conjugated anti-mouse CD8 항제를 이중 염색하여 flow cytometry를 활용하여 CD4+/CD8+의 비율을 조사하였다. 그 결과 Fig. 8과 같이 TMA로 공격된 양성대조군은 CD4+/CD8+비율이 4.41±0.033로 정상대조군에 비해 2배 이상으로 현저히 증가되었다. 그러나 解毒四物湯이 투여된 실험군에서 CD4+/CD8+비율은 농도에 의존적으로 억제하는 효과가 있었다. 특히 200 ㎎/㎏(p<0.05)과 400 ㎎/㎏(p<0.01) HSTE 처리군에서 현저히 억제하는 효과가 있었다.

Fig. 8.Effects of HSTE on CD4+/CD8+ ratio of auricula lymph node cells in TMA-treated mice. Mice were orally administrated with or without different doses (50-400 ㎎/㎏/day) of HSTE for 17 days. During the challenge period, mice were externally applied with 20 ㎕ of 3% HSTE in 30 min before TMA treatment. Lymphocytes were isolated from auricula lymph nodes of TMA-sensitized and control mice on 32 days. CD4+/CD8+ ratio was measured by flow cytometry. Data are shown as mean±S.D. (n=5). *=p<0.05 and **=p<0.01 versus a group of mice treated with TMA alone.

6. Th2 사이토카인 생산에 미치는 解毒四物湯의 효과

대표적인 Th2 (type 2 helper cell) 사이토카인은 IL-4, IL-5 및 IL-13 등으로 이들의 역할은 B세포의 활성에 영향을 주어 IgE와 같은 면역글로불린의 생산을 촉진하는 것으로 알려졌다19). 따라서 본 연구는 TMA로 공격된 마우스로부터 분리한 auricula lymph node 세포(1.0×106/㎖)를 96 well 플레이트에 접종하고 anti-mouse CD3와 anti-mouse CD28로 자극한 후 48시간에 세포배양 상층액을 분리하여 解毒四物湯이 처리된 세포의 Th2 사이토카인의 생산에 미치는 영향을 알아보고자 IL-4, IL-5 및 IL-13 그리고 대표적인 Th1 사이토카인인 IFN-γ를 측정하였다. 그 결과 Fig. 9-12와 같이 정상 대조군의 IL-4, IL-5 및 IL-13 그리고 IFN-γ는 베이스 수준이었지만, TMA로 공격되고 anti-mouse CD3과 anti-mouse CD28로 자극된 양성대조군의 IL-4 (120.8±20.1 pg/ml), IL-5(112.5±19.8 pg/ml), IL-13 (95.8±17.9 pg/ml) 그리고 IFN-γ (108.35±15.6 pg/ml)는 정상 대조군에 비해서 현저히 증가되었다. 그러나 解毒四物湯의 투여와 TMA로 공격된 세포에 anti-mouse CD3과 anti-mouse CD28로 자극된 실험군에서는 IFN-γ를 제외하고 IL-4, IL-5 및 IL-13의 경우 농도에 의존적으로 억제되었다. 특히 200 ㎎/㎏과 400 ㎎/㎏ HSTE가 투여된 군의 경우 IL-4, IL-5 및 IL-13의 억제 효과가 현저하였다(p<0.05와 p<0.01). IFN-γ의 경우 Fig. 12와 같이 50-200 ㎎/㎏ HSTE 투여군에서는 IFN-γ의 생성능이 양성대조군과 비슷하였지만, 400 ㎎/㎏ HSTE가 투여된 군에서만 억제하는 경향이 있었다(p<0.05).

Fig. 9.Effects of HSTE on IL-4 production in TMA-treated mice. Mice were orally administrated with or without different doses (50-400 ㎎/㎏/day) of HSTE for 17 days. During the challenge period, mice were externally applied with 20 ㎕ of 3% HSTE in 30 min before TMA treatment. Lymphocytes (1.0×106/㎖) isolated from auricula lymph nodes of experimental animals were stimulated with anti-mouse antibodies for CD3 (1 ㎍/㎖) and CD28 (1 ㎍/㎖) for 48 h. IL-4 production was measured in the cultured media using a mouse IL-4 ELISA kit. Data are shown as mean±S.D.(n=5). *=p<0.05 and **=p<0.01 versus a group of mice treated with TMA alone.

Fig. 10.Effects of HSTE on IL-5 production in TMA-treated mice. Mice were orally administrated with or without different doses (50-400 ㎎/㎏/day) of HSTE for 17 days. During the challenge period, mice were externally applied with 20 ㎕ of 3% HSTE in 30 min before TMA treatment. Lymphocytes (1.0×106/㎖) isolated from auricula lymph nodes of experimental animals were stimulated with anti-mouse antibodies for CD3 (1 ㎍/㎖) and CD28 (1 ㎍/㎖) for 48 h. IL-5 production was measured in the cultured medium using a mouse IL-5 ELISA kit. Data are shown as mean±S.D. (n=5). *=p<0.05 and **=p<0.01 versus a group of mice treated with TMA alone.

Fig. 11.Effects of HSTE on IL-13 production in TMA-treated mice. Mice were orally administrated with or without different doses (50-400 ㎎/㎏/day) of HSTE for 17 days. During the challenge period, mice were externally applied with 20 ㎕ of 3% HSTE in 30 min before TMA treatment. Lymphocytes (1.0×106/㎖) isolated from auricula lymph nodes of experimental animals were stimulated with anti-mouse antibodies for CD3 (1 ㎍/㎖) and CD28 (1 ㎍/㎖) for 48 h. IL-13 production was measured in the cultured medium using a mouse IL-13 ELISA kit. Data are shown as mean±S.D. (n=5). *=p<0.05 and **=p<0.01 versus a group of mice treated with TMA alone.

Fig. 12.Effects of HSTE on IFN-γ production in TMA-treated mice. Mice were orally administrated with or without different doses (50-400 ㎎/㎏/day) of HSTE for 17 days. During the challenge period, mice were externally applied with 20 ㎕ of 3% HSTE in 30 min before TMA treatment. Lymphocytes (1.0×106/㎖) isolated from auricula lymph nodes of experimental animals were stimulated with anti-mouse antibodies for CD3 (1 ㎍/㎖) and CD28 (1 μg/ml) for 48 h. IFN-γ production was measured in the cultured medium using a mouse IFN-γ ELISA kit. Data are shown as mean±S.D. (n=5). *=p<0.05 versus a group of mice treated with TMA alone.

7. MCP-1/CCL2와 MIP-1α/CCL3 생산에 미치는 解毒四物湯의 효과

염증부위로 림프구의 침윤을 화학주성으로 유도하는 케모카인인 MCP-1/CCL2와 MIP-1α/CCL3의 생산에 미치는 解毒四物湯의 영향을 알아보기 위해서, TMA로 처리된 마우스로 부터 분리한 auricula lymph node 세포(1.0×106/㎖)를 96 well 플레이트에 접종하고 anti-mouse CD3와 anti-mouse CD28로 자극한 후 48시간에 세포배양 상층액을 분리하여 解毒四物湯이 처리된 세포의 Th2 사이토카인의 생산에 미치는 영향을 측정하였다. 그 결과 Fig. 13, 14와 같이 정상대조군의 MCP-1/CCL2와 MIP-1α/CCL3은 베이스 수준이었지만, TMA로 공격되고 anti-mouse CD3와 anti-mouse CD28로 자극된 양성대조군의 MCP-1/CCL2 (80.5±10.2 pg/ml)와 MIP-1α/CCL3(21.4±3.4 pg/㎖)는 정상대조군에 비해서 현저히 증가되었다. 그러나 解毒四物湯 투여와 TMA로 공격된 세포에 anti-mouse CD3와 anti-mouse CD28로 자극된 실험군에서는 MCP-1/CCL2와 MIP-1α/CCL3의 경우 농도에 의존적으로 억제되었다. 특히 200 ㎎/㎏과 400 ㎎/㎏ 투여군은 MCP-1/CCL2와 MIP-1α/CCL3의 억제 효과가 현저하였다(p<0.05와 p<0.01).

Fig. 13.Effects of HSTE on MCP-1/CCL2 production in TMA-treated mice. Mice were orally administrated with or without different doses (50-400 ㎎/㎏/day) of HSTE for 17 days. During the challenge period, mice were externally applied with 20 ㎕ of 3% HSTE in 30 min before TMA treatment. Lymphocytes(1.0×106/㎖) isolated from auricula lymph nodes of experimental animals were stimulated with anti-mouse antibodies for CD3 (1 ㎍/ml) and CD28 (1 ㎍/ml) for 48 h. MCP-1/CCL2 production was measured in the cultured medium using a mouse MCP-1/CCL2 ELISA kit. Data are shown as mean±S.D. (n=5). *=p<0.05 and **=p<0.01 versus a group of mice treated with TMA alone.

Fig. 14.Effects of HSTE on MIP-1α/CCL3 production in TMA-treated mice. Mice were orally administrated with or without different doses (50-400 ㎎/㎏/day) of HSTE for 17 days. During the challenge period, mice were externally applied with 20 ㎕ of 3% HSTE in 30 min before TMA treatment. Lymphocytes (1.0×106/ml) isolated from auricula lymph nodes of experimental animals were stimulated with anti-mouse antibodies for CD3 (1 ㎍/ml) and CD28 (1 ㎍/ml) for 48 h. MIP-1α/CCL3 production was measured in the cultured medium using a mouse MIP-1α/CCL3 ELISA kit. Data are shown as mean±S.D. (n=5). *=p<0.05 and **=p<0.01 versus a group of mice treated with TMA alone.

 

Ⅳ. 考 察

Trimellitic anhydride (TMA)는 epoxy·alkyd 합성수지, 가소제(plasticizers), 고온중합체 그리고 계면활성제를 제조하는데 일반적으로 활용되는 휘발성 유기용매제로 인체나 동물에게 장기간 노출되면, 천식20)은 물론 접촉성 피부염과 아토피 피부염 등 알레르기성 질환을 야기하는 것으로 알려져 있다21-23). 특히 TMA는 Th2 세포를 편향적으로 발달시키는 화학항원으로, IL-4, IL-5 및 IL-13과 같은 Th2 사이토카인의 증가를 유발하며 또한, IgE 항체를 증가시키는 작용을 나타낸다. IgE 항체는 비만세포(mast cell)와 호염구의 FcεRI와 매우 강력한 결합에 의하여 천식뿐만 아니라 아토피 피부염을 야기하며, 더욱 악화시키는 작용을 나타낸다21-25). 이러한 화학항원(chemical antigen)에 의해 증가된 면역학적 특징은 접촉성 피부염과 아토피 피부염 등의 알러지성 피부질환의 지표로 알려져 있다.

접촉성 과민반응은 T림프구가 매개하는 제 4형인 지연형 과민반응으로 다양한 항원(antigen)들에 의해 유발되는데23-26), 주로 금속 또는 휘발성 유기용매와 같은 물질의 합텐(hapten)에 의해 유발된다. 이러한 접촉성 과민반응은 접촉성 피부염을 일으키고, 아토피 피부염으로도 발전되는데, 이는 Th2 세포가 매개하는 사이토카인의 작용에 의해 일련의 염증반응이 유발되어 나타나는 것으로 알려져 있다27-29).

알러지성 피부질환의 한 종류인 아토피 피부염은 그 원인이 명확하게 알려져 있지 않으나, 주로 유전, 환경, 식생활 및 생활습관의 변화, 스트레스 등과 밀접하게 연관되어 있는 것으로 보고되고 있다. 이러한 아토피 피부염은 극심한 가려움증과 염증을 유발하여 육체적ㆍ정신적으로 정상적인 사회생활이 어렵게 만드는 질환으로26), 경제와 산업이 발달하고 고도화 되면서 그 발병이 증가되어 최근에는 선진국 어린이의 10-22%에서 발생하고 있으며 점차 그 수가 증가하고 있는 추세이다30).

접촉성 과민반응에 대한 기전 및 임상연구에 주로 활용되는 모델동물은 마우스이다. 마우스에 유기용매와 같은 화학 항원으로 감작(sensitization)과 공격(challenge)을 시행하면 접촉성 과민반응이 유발되는데, 이렇게 유발된 모델동물을 통해 약물의 기전 및 효능의 평가를 시행할 수 있다. 실제로 이렇게 과민반응이 유발된 마우스에서 귀의 부종 및 염증반응의 정도, IgE의 증가와 Th2 사이토카인 및 케모카인의 조절에 대한 일련의 작용 기전에 초점을 두어 많은 연구들이 진행되어 왔다20-22). 그러나 휴발성 유기용매인 TMA로 유발된 접촉성 과민반응에서 解毒四物湯이 나타내는 효능에 대한 연구는 아직 보고된바가 없다.

解毒四物湯은 四物湯의 連繫方으로 四物湯은 血虛의 기본적인 처방이다. ‘血虛’란 血의 濡養(滋潤, 營養) 作用이 不足한 營養不良狀態를 말하며, 營養狀態의 低下와 이에 따른 腦, 神經, 筋肉, 皮膚 등의 代謝異常, 機能失調, 內分泌 失調가 主要 病態이다5). 皮膚의 營養狀態가 低下되고, 皮脂의 分泌가 좋지 않아 皮膚가 거칠고 윤기가 없으며, 건조해 지면서 가려운 증상이 나타나는 血虛生風은 실제 아토피 피부염에서 反復的이고 慢性的인 2차 감염으로 병증 범위가 점점 넓어지고 滲出物의 양도 많아지기를 반복하다가 결국, 皮膚의 營養상태가 低下(血虛)되어 건조해지는 증상과 매우 비슷한 양상을 보이게 되는데, 이러한 경우에 四物湯을 활용하여 營養分을 供給하고, 血行循環을 促進하면 아토피 피부염의 증상 개선에 도움이 되는 것으로 알려져 있다.

解毒四物湯은 이러한 血虛를 치료하는 四物湯에 瀉火解毒 淸化濕熱하는 方劑인 黃連解毒湯을 합한 처방이다. 黃連解毒湯은 각각 上, 中, 下, 三焦의 火를 瀉하는 黃連, 黃芩, 黃柏, 梔子로 구성된 方劑로, 熱盛(實熱), 三焦實火의 基本處方이며, 濕熱을 치료하는 대표적인 처방이다4,5). 熱盛(實熱)이란 염증증상을 말하며, 三焦實火란 全身의 炎症을 의미하고, 濕熱이란 염증과 함께 炎症性 滲出이나 水分의 吸收 및 排泄障碍를 동반한 증상을 의미하는데, 이러한 염증증상의 치료에 사용되어 온 黃連解毒湯의 구성약물은 실험적 연구에서도 抗菌, 消炎, 解熱作用과 깊은 연관성이 있는 것으로 보고되고 있다. 이처럼 四物湯에 黃連解毒湯을 합한 方劑인 解毒四物湯은 補血과 瀉火의 功補兼治의 처방으로, 실제 임상에서 만성적인 염증이 재발되는 아토피 피부염의 治療에 사용되고 있다12).

이에 저자는 解毒四物湯이 아토피 피부염의 치료에서 어떤 기전과 효능을 나타내는지를 실제로 알아보기 위하여, 산업사회에서 빈번히 사용되는 유기용매인 TMA을 활용하여 Fig. 1과 같이 Balb/c 마우스를 대상으로 실험 설계한 후 解毒四物湯 추출물의 농도별 투여에 따른 접촉성 과민반응의 조절여부를 조사하였다. 그 결과 解毒四物湯의 투여는 농도에 의존적으로 TMA 유도 접촉성 과민반응을 현저히 억제하는 우수한 효과가 있었다.

TMA 감작과 공격은 Fukuyama 등23)의 방법을 약간 변형하여 50 ㎕ TMA(10%)를 옆구리에 3일간 연속으로 하루에 1회씩 5일 간격으로 3회 도포하였으며, 29일에 25 ㎕ TMA(10%)를 3일간 연속으로 귀에 공격하였다. 이와 같이 TMA를 반복적으로 피부에 도포시켜 귀의 두께와 조직학적 특징을 조사한 결과 정상대조군에 비해서 현저히 그 두께가 증가하였고, 정상 대조군에 비해 매우 심하게 표피층(epidermis)이 두꺼워졌으며, 진피층의 혈관이 확장되어 있음을 확인하고, 표피와 진피층에 단핵백혈구, 비만세포 및 호산구의 침윤이 매우 높게 나타나 염증현상이 유발됨을 확인하였다. 그러나 解毒四物湯을 투여한 실험군에서는 투여량에 의존적으로 귀의 두께가 줄어들었을 뿐만 아니라 백혈구의 침윤이 현저히 줄어들었다(Fig. 3, 4). 이와 같은 실험결과는 접촉성 피부 과민반응억제에 解毒四物湯을 활용할 수 있는 가능성을 제시하고 있다.

피부의 조직학적 관찰은 인간에서 나타나는 지연형 접촉성 과민반응의 진단에 핵심적 도구26)일 뿐만 아니라 모델동물에서도 귀 부종에 원인인 호산구 및 비만세포의 진피층 및 표피층에 침윤되는 정도에 따라 귀의 부종의 정도를 확인하는데 필수적인 자료로 이용 된다27,28).

TMA는 일반적으로 인체 및 모델 동물의 혈청 IgE 양을 높이는 것으로 알려져 있는데, 증가된 IgE는 비만세포와 호염구에서 FcεRI와 매우 높은 결합을 통하여 기관지염, 알러지성 고초열, 아토피 피부염 등과 같은 환경성 알러지성 질환을 유발 한다31-35). 본 연구의 결과 解毒四物湯을 처리할 경우 혈청 IgE를 효과적으로 억제(Fig. 5)한 반면, 면역능 향상에 도움을 주는 IgG1의 경우 고농도(400 ㎎/㎏)에서만 억제하는 경향을 보였고 50-100 ㎎/㎏에서는 큰 영향을 미치지 않은 것으로 조사되었다. 즉 IgE는 효과적으로 억제하지만, IgG계열에 대하여서는 억제작용이 없음을 보여주고 있다. 따라서 이와 같은 결과는 解毒四物湯이 IgE와 IgG계열 등의 억제와 항진조절을 통하여 아토피 피부염을 비롯한 알레르기 피부질환에 활용할 수 있음을 시사해주고 있다.

지연형 접촉성 과민반응은 T 림프구가 매개하는 제4형 과민반응으로 유해환경에 있는 다양한 항원들에 의해 유발될 수 있는 것으로 알려져 있다28). 지연형 접촉성 과민반응은 TMA와 같은 유기용매에 의한 합텐(hapten)에 의해 홍반, 면역세포 침윤 및 접촉성 피부염으로 발전 되는데, Th2 세포가 매개하는 사이토카인의 작용에 의해 일련의 염증반응이 동반 된다23). 최근 Hopkins 등35)은 림프절 유래 세포에 TMA를 노출시킨 결과 Th1 사이토카인이 아닌 Th2 사이토카인을 선택적으로 증가시키는 결과를 얻고 TMA를 Th2 유도성 화학항원으로 규정한 바 있다.

본 연구에서도 TMA를 반복적으로 감작과 공격시킨 마우스의 auricula lymph node를 적출하여 무게와 CD4+/CD8+의 비율을 조사하였다. 그 결과 정상대조군에 비해 TMA로 처리된 마우스 auricula lymph node의 무게가 현저히 증가 되었고, CD4+/CD8+ 비율이 약 2.5배 이상 증가 되었다(Fig. 8). 이러한 결과는 TMA가 CHS을 유발하는 원인 물질임을 확인하였다. 더불어 TMA로 감작과 공격된 마우스로부터 분리한 auricula lymph node 세포를 anti-mouse CD3와 anti-CD28로 자극하여 Th2 사이토카인에 속하는 IL-4, IL-5와 IL-13의 생산량을 조사해 본 결과 정상 대조군에 비해 모두 현저히 증가 되었다. 그러나 TMA에 의해 증가된 auricula lymph node의 무게, CD4+/CD8+비율 및 Th2 사이토카인의 생산은 解毒四物湯이 처리될 경우 농도에 의존적으로 현저한 억제효과가 있었다(Fig. 9-11). 이와 같은 결과는 解毒四物湯이 휘발성 유기용매에 노출되어 발생하는 Th2 염증반응을 효과적으로 억제할 수 있음을 시사하고 있다.

한편 케모카인(chemokine)은 저분자 단백질로 알려져 있고, 화학주성(chemoattractants)을 나타내며, 단백질의 구조와 기능에 따라 C, CC, CXC 및 CX3C 등 4가지 subfamily로 나눌 수 있는데, 이들 케모카인은 염증부위에 백혈구를 침윤시켜 염증반응을 더욱 유발한다36,37). CC계열의 MCP-1/CCL2와 MIP-1α/CCL3은 염증부위에 백혈구의 침윤을 야기 한다37,38). MCP-1/CCL2는 단핵구와 자연살해세포(natural killer cell) 및 수지상세포(dendritic cell)를 염증부위로 유도하는 중요한 역할을 하는 화학주성 케모카인으로 아토피 피부염을 더욱 악화 시키는 것으로 알려져 있고, MIP-1α/CCL3는 염증에 따른 림프기관과 염증부위에 대식세포, 수지상세포 및 T세포를 침윤시키는 중요한 역할을 하는 화학주성 케모카인으로 알려져 있다38). Balb/c 마우스에 TMA로 감작과 공격을 하면, IL-6와 TNF-α와 같은 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines)뿐만 아니라 MCP-1/CCL2와 MIP-1α/CCL3와 같은 케모카인이 증가 된다23). 본 연구에서도 TMA로 감작과 공격된 마우스로부터 분리한 auricula lymph node 세포를 anti-mouse CD3와 anti-CD28로 자극하여 MCP-1/CCL2와 MIP-1α/CCL3의 생산량을 조사해 본 결과 정상대조군에 비해 모두 현저히 증가 되었다. 그러나 TMA에 의해 증가된 MCP-1/CCL2와 MIP-1α/CCL3은 解毒四物湯이 처리될 경우 농도에 의존적으로 현저한 억제효과가 있었다(Fig. 13, 14). 이와 같은 결과는 解毒四物湯이 휘발성 유기용매에 노출되어 발생하는 백혈구 침윤에 핵심적으로 관여하는 케모카인을 효과적으로 억제할 수 있음을 시사하고 있다.

한편 기존의 아토피 피부염 등 알레르기성 피부질환 치료에 사용되는 제제의 문제점을 살펴보면, 가장 일반적으로 사용되고 있는 스테로이드제는 반복적으로 장기간 사용할 때 피부가 얇아지거나 (skin thinning), 피부위축 (skin atropy), 상흔 (scretch marks), 피부변색 (skin discoloration) 등의 부작용이 발생하게 된다31). cyclosporine, calcium inhibitor, tacrorimus, pimecrorimus, anti-histamine 및 Talk 등이 아토피 피부염 치료 및 개선에 또한 활용되고 있는데39), 이들 제제 또한 부작용이 있어 장기간 사용에 어려움이 있다는 한계가 있다. 최근에는 cytokine 및 chemokine 제어 또는 이들 수용체를 제어 할 수 있는 소재를 개발하고 있으나, 이들 소재는 수용체와 결합하여 그 효과를 내기 때문에 필연적으로 부작용을 수반할 수 있고 아직 임상실험 중에 있는 실정이다.

이처럼 합성의약품의 경우에는 장기간 사용시 부작용과 내성을 유발하고, 하나의 유효성분으로는 치료가 안 되는 질병들이 발생함에 따라, 점차로 다양한 유효성분과 기능을 지닌 천연 추출물에 관심이 고조되고 있다. 실제로 유럽 및 미국 등 서구 선진국들은 중국, 일본, 한국, 인도 및 아프리카 지역에서 민간요법으로 사용되어 왔던 생약 추출물을 이용한 천연물 의약의 개발을 서두르고 있다. 일반적으로 합성의약품 개발의 실패 요인 중 13-25%가 독성 및 안전성 문제에 기인한 것인데 반하여 천연물 의약의 경우에는 독성 및 안전성에 대한 문제가 상대적으로 적게 나타나고 또한, 상대적으로 개발기간이 짧게 소요되고 개발 성공률이 높으며 합성 의약품에 비하여 비용이 적게 소요되는 것으로 알려져 있다31,39,40). 이러한 관점에서 이번 연구에서 얻은 解毒四物湯의 항염증 효과는 의미를 갖는 결과라 할 수 있다.

이번 실험에서 解毒四物湯은 TMA로 접촉성 과민반응이 유도된 쥐의 귀 두께, 귀 조직의 백혈구 침윤, 혈청내 IgE 및 auricula lymph node 세포의 케모카인과 Th2 사이토카인을 현저히 억제하는 효과를 나타내었다. 이러한 본 연구의 결과는 아토피 피부염을 비롯한 알러지성 피부질환 치료에 解毒四物湯을 유용하게 활용할 수 있음을 증명하였다. 그러나 아토피 피부염 등 알레르기성 피부질환의 치료에 임상적으로 적용하기 위해서는 解毒四物湯의 항염증에 대한 자세한 작용기전이 앞으로도 계속 硏究되어야 할 것으로 思料된다.

 

Ⅴ. 結 論

解毒四物湯이 휘발성 유기용매인 trimellitic anhydride (TMA)가 유도하는 마우스의 접촉성 과민반응에 미치는 效果를 알아보기 위하여 본 實驗을 시행하여 다음과 같은 結果를 얻었다.

以上의 結果는 解毒四物湯 추출물(HSTE)이 TMA로 유도된 접촉성 과민반응을 抑制하는 效果가 있음을 보여주었다. 따라서 아토피 피부염 등의 알러지성 피부질환 治療에 解毒四物湯을 유용하게 活用할 수 있을 것으로 思料된다.