Effect of Fermented Platycodon grandiflorum Extract on Cell Proliferation and Migration in Bovine Aortic Endothelial Cells

혈관내피세포의 성장 및 세포 이동에 영향을 미치는 발효도라지추출물의 효과

Abstract

Platycodon grandiflorum A. De Candolle (Korean name, ‘Doraji’) is a perennial plant containing various triterpenoid saponins. The roots of this plant have traditionally been used as a food material in Korea. Here, we prepared a fermented P. grandiflorum extract (PG). Although it was previously reported that P. grandiflorum A. extract has a variety of physiological functionalities, including anti-inflammatory and anti-oxidant activities, little is known about its vascular functions. In this study, we executed a series of experiments to identify the effect of PG on endothelial cells. PG at a high concentration (100 μg/ml) was found to induce cell detachment, whereas PG at a low concentration (0.1 μg/ml) appeared to promote cell proliferation and migration in bovine aortic endothelial cells. The cell detachment induced by the high concentration was not associated with cell death, such as apoptosis, necrosis, and autophagy. In addition, we found that PG at the high concentration formed a small vesicular structure called an endothelial microparticle (EMP). The EMP was prepared by centrifugal fractionation and determined with flow cytometry and a microscope. Interestingly, PG-induced cell detachment was found to be mediated by EMP. We furthermore determined that PG at the low concentration activated Akt, a crucial cell-signaling molecule, and then controlled cell proliferation and migration. Overall, our findings suggest that PG at low doses maintains vascular stability by promoting endothelial cell proliferation, and enhances the efficacy of wound healing by cell proliferation and migration activity.

도라지는 다양한 종류의 triterpenoid계통의 saponin을 함유한 다년생 식물이다. 도라지는 한국에서 오랫동안 식품으로 사용되어 왔으며 그 추출물에 관한 생리활성연구도 많이 보고되었으나, 발효 도라지추출물에 관한 혈관기능 연구는 미미한 실정이다. 본 연구자들은 먼저 도라지 추출물을 발효시킨 후, 발효도라지추출물을 제조하였으며, 제조된 발효도라지추출물이 혈관내피세포에 어떤 효과를 미치는 지 관찰하였다. BAEC에 발효도라지추출물을 농도 별로 처리하였을 때, 고농도(100 μg/ml)에서는 혈관내피세포의 탈착이 일어났으며, 저농도(0.1 μg/ml)에서는 세포탈착은 일어나지 않았으나 세포성장과 세포이동이 촉발됨을 관찰하였다. 고농도에서 일어난 세포탈착은 세포사 즉, 세포사멸, 세포괴사, 오토파지 등과는 관련이 없었다. 또한 고농도의 도라지 추출물은 혈관내피세포에서 유래한 작은 vesicle을 형성하였는데, 이 vesicle은 세포사멸과 관련이 없기 때문에 내피세포에서 유래된 EMP로 추측된다. 흥미롭게도 고농도의 세포탈착 현상은 EMP로 추측되는 vesicle에 의하여 일어난 현상이었다. 저농도의 도라지 추출물이 유발한 세포이동과 세포성장은 혈관내피세포의 중요한 신호전달물질중의 하나인 Akt의 활성화를 통해 일어남을 확인하였다. 결론적으로 도라지 추출물은 혈관내피세포의 성장을 촉진함으로써 혈관의 안정성을 유지하고 세포성장과 이동을 촉발함으로써 상처치유에 효과를 나타낼 수 있음을 본 연구를 통하여 확인하였다.

서 론

혈관은 결체조직으로 이루어진 외막층, 평활근으로 이루어진 중간막층과 혈관내피세포와 그를 평활근에 부착시키는 세포외 기질(extracellular matrix)로 이루어진 내막층으로 구성되어 있으며, 혈관내피세포는 혈관의 내강에 있는 혈액과 직접 접촉하면서 다양한 혈관기능을 조절하고 있다[27]. 혈관내피세포는 혈액 내에 존재하는 성장인자, 호르몬, 대사산물 또는 시토카인 등과 같은 다양한 화학물질을 감지하며 반응하기도 하지만, 물리적인 힘인 혈류의 마찰력으로 기인하는 전단응력(shear stress)도 감지하고 반응하여 혈관기능의 hemostasis를 조절한다[7]. 이렇게 중요한 기능을 하는 혈관 내피세포는 세포의 항상성이 정상적으로 유지되어야만 건강한 혈관기능이 유지된다. 혈관 내피세포가 우리 몸의 혈관 안에서는 그 수명이 20년이기 때문에[30], 우리 몸 안에서는 세포사가 잘 일어나지 않는다. 그러나 동맥경화와 같은 병리적 현상이 진행되는 혈관에서는 세포사가 급속히 진행되기도 한다[5, 9, 10, 12, 23]. 동맥경화는 혈류의 흐름을 원활하게 하지 못하기도 하지만, 심한 동맥경화반(atherosclerotic plaque)이 형성되면 혈류가 차단되어 뇌경색이나 심장마비가 일어날 수 있다[1, 5, 9, 10, 12]. 따라서 혈관내피세포의 생리적 혹은 병리적 현상과 혈관내피세포의 세포사와는 밀접한 관계에 있다.

혈관의 항상성은 세포사멸과 세포증식이 일정하게 유지될 때 가능하다. 내피세포의 세포증식은 태아의 경우나 성인의 상처치유가 일어날 때, 빠르게 진행된다. 이와 같이 기관의 성장이 일어나려면 세포증식과 혈관형성은 분리되어 있지 않고 동시에 일어나야 한다[2, 25]. 혈관 내피세포의 성장을 자극하는 대표적인 자극인자는 VEGF이다. 한편 세포증식도 우리 몸에서는 정교하게 조절되어야 한다. 세포증식이 세포사멸에 비하여 과다하게 일어나면 종양이 발생할 수 있다. 이와 같이 세포 성장은 기관이나 조직의 성장에 필수적으로 일어나기도 하지만 억제되지 않는 특정세포의 세포증식은 암을 일으키는 주요 원인이 되기 때문에 혈관 내피세포의 세포증식이 어떻게 조절되는 지에 관한 연구도 많이 이루어져 왔다. 세포증식과 혈관형성 모두에게 관여하는 대표적인 신호전달 물질은 ERK, NFkB, eNOS 그리고 Akt/PKB이다[25, 32].

도라지(Platycodon grandiflorum)는 한국을 포함하는 극동 아시아에서 오래 전부터 식용과 약용으로 사용되어 왔던 초롱꽃과(Companulaceae)의 다년생 초본이다[22, 33]. 도라지에 포함되어 있는 성분들은 platycodin A, C, D, D2, polygalacin D, D2와 같은 triterpenoid 계의 saponion 24 종류가 알려져 있다[28]. 최근에 이런 화학물질을 갖는 도라지 추출물은 항염증, 항위궤양, 위산분비억제 및 혈관확장, 혈중 콜레스테롤 조절기능과 같은 다양한 약리효능이 있음이 밝혀졌다[15, 16, 18, 35]. 또한 도라지 추출물은 항산화 효과 및 항암효과도 갖고 있음이 알려졌으며[20, 21, 22], 골밀도 개선효과도 있음이 알려졌다[15]. 이와 같이 도라지는 전통적으로 음식 소재로 활용되어 왔고, 새롭게 밝혀지는 약리효능 때문에 새로운 약물로 개발시키려는 노력도 현재 다각도로 시도되고 있는 중이다. 반면에, 이들의 혈관기능에 관한 분자적 기전 연구는 매우 미흡한 상태이다. 따라서 본 연구자들은 이번 연구를 위해 제작된 발효도라지추출물이 혈관내피세포에서 어떤 분자적 기전으로 혈관생리활성에 관여하는 지 파악하고자 하였다.

본 연구에서는 지금까지 비교적 혈관기능이 잘 알려져 있지 않았던 발효도라지추출물에 관한 새로운 혈관기능을 규명하기 위하여, 발효도라지추출물을 혈관내피세포에 처리한 후 나타나는 세포사, 세포증식 및 세포이동에 관한 변화를 관찰하였다. 또한 각각의 현상에 관여하는 세포신호전달 물질은 무엇이지 조사함으로써 발효도라지추출물의 의약학적 혹은 식품의 기능성에 관한 분자기전을 보다 자세히 알고자 하였다.

 

재료 및 방법

재료

본 실험에 사용된 발효도라지추출물은 ㈜바이오랜드에서 구입하여 사용하였다. 제조 과정을 간략히 설명하면 다음과 같다. 국내산(충남 금산지역 재배) 도라지를 구입하여 수세한 후 분쇄하고 상수를 2배수 가하여 121~125℃ 1시간 동안 멸균하고 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 접종하여 30℃, 150 rpm, 0.5 bar, 0.5 vvm의 배양조건으로 24시간 배양하였다. 배양액에 α-amylase (Sigma-Aldrich, ST. Louis, MO, USA)와 Cellulase (Sigma-Aldrich, ST. Louis. MO, USA)를 혼합하여 45~55℃, 150 rpm, 16시간 효소분해하고 90~95℃, 30분간 열처리하여 효소를 실활하였다. 효소실활액을 여과하고 여과액을 Brix 50~60까지 진공농축하여 농축액의 고형분 대비 10%의 γ-cyclodextrin (Sigma-Aldrich, ST. Louis, MO, USA)을 혼합하였다. 제조된 발효도라지추출물을 90~95℃, 1시간 살균하여 실험에 사용하였다.

세포배양

소 대동맥 내피세포인 BAEC(bovine aortic endothelial cell)은 세포외 기질에 부착하여 성장하는 세포(adhesive cell)로, 소의 대동맥에서 추출한 후 계대수가 3에서 10 사이의 일차세포를 실험에 사용하였다. BAEC은 20% 소태아혈청(fetal bovine serum (FBS), Welgene, Seoul, Korea)과 항생제(50 μg/ml penicillin/streptomycin)가 포함된 DMEM (glucose 1 g/l, Welgene)을 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.

세포성장 실험

세포성장은 cell viability assay kit (Daeillab Service Co., LTD, Seoul, Korea)를 이용하여 평가하였다. 전면 성장한 BAEC을 최소 12시간 동안 혈청기아 시킨 후, 다양한 농도의 발효도라지추출물을 처리하여 0-24시간 동안 배양하였다. 그 후 PBS (phosphate buffered saline)로 2회 세척하여 WST reagent와 반응시켜 세포성장 비율을 결정하였다.

세포탈착 실험

전면 성장한 BAEC을 FBS가 포함되지 않은 DMEM 배지로 12시간 이상 혈청기아 시킨 후 다양한 농도의 발효도라지추출물을 0~24시간 동안 처리하였다. 1 μM wortmannin (AKT 억제자, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)은 발효도라지추출물을 처리하기 1시간 전에 처리하였다. 처리 시간에 따른 변화를 현미경으로 관찰·기록했으며, 세포 탈착 비율은 원형 탈착부유 세포를 계산하여 결정하였다[11, 23].

세포이동 실험

전면 성장한 BAEC에 2 mM thymidine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. USA)을 혈청기아상태에서 24시간 동안 처리하여 세포의 성장을 중지시킨 뒤 PBS (phosphate buffered saline)로 2회 세척하였다. 그 후 스크래퍼 찰과기를 이용하여 창상선을 만든 후 다시 PBS로 2회 세척하고 0.1 또는 100 μg/ml 발효 도라지추출물을 0~24시간 동안 처리하였다. 처리 시간에 따른 변화를 현미경으로 관찰·기록하였으며, 창상선에 의해 비워진 일정 면적으로 이동한 세포 수를 세고, 면적 당 이동한 세포수의 비율을 세포 이동 정도로 환산하였다[14].

Western Blot

전처리 된 BAEC을 분해완충액(50 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride)으로 분해한 뒤, 원심분리를 이용하여 상층액을 분획했다. Bio-Rad DC assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용해 세포 분해액의 단백질을 정량 하였으며 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis)에 loading하여 분리시켰다. 분리된 단백질을 polyvinylidene fluoride (PVDF) 막 (Millipore, Billerica, MA, USA)으로 전달시킨 후, 분석하고자하는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 1차 항체와 반응시켰다. 1차 항체는 caspase-3 (Cell Signaling, Danvers, Mass., USA), LC3 (Novus, Littleton, Co., USA), p62 (Cell Signaling), actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Calif., USA), p~Akt (Cell Signaling), Akt (Cell Signaling), p~eNOS (Cell Signaling), eNOS (Cell Signaling), IκBα (Cell Signaling)를 표적으로 하는 항체를 사용하였다. 2차 항체와 연속적으로 반응시킨 후, 이를 화학발광 검출법을 통해 X-선 필름에 감광시켜 단백질을 검출하였다.

Flow cytometry 분석

전면 성장한 BAEC을 24시간 동안 혈청기아 시킨 후 0.1 또는 100 μg/ml 발효도라지추출물을 24시간 처리하였다. 세포사 분석을 위하여 ApoScan Annexin V-FITC apoptosis detection kit (BioBud, Seongnam, Korea)를 이용하여 세포를 Annexin V-FITC와 propidium iodide (PI)로 염색하였다. 그 후 flow cytometry (Guava easyCyte system, Milipore)를 이용하여 분석하였다.

Endothelial Microparticle (EMP) 제조

24시간 동안 혈청기아 시킨 BAEC의 배지에 0.1 또는 100 μg/ml 발효도라지추출물을 24시간 동안 처리한 후, 배지만 획득하여 377x g로 15분 간 원심분리 하여 침전물은 제거하고, 상등액만 분획하였다. 분획한 상등액을 16,000× g로 15분 간 원심분리 하여 상등액을 제거하고 침전물을 확보하여 현미경과 flow cytometry로 EMP를 확인하였다. Flow cytometry를 이용한 EMP의 확인은 입자 혹은 세포의 크기와 모양을 구별할 수 있는 Forward scatter (FS)와 Side scatter (SS) 두 종류의 광 산란을 통해 검출하였다. 본 실험에서 사용한 광 산란 측정법은 기존의 광 산란 측정법[36]을 적용하였으며, BAEC 대조군과 EMP를 상호 비교하며 관찰하였다.

통계분석

실험결과는 mean ± S.E.로 나타내었고 분석된 데이터는 실험자료로부터 one-way ANOVA를 이용하여 유의성이 있을 경우 post-hoc test (Dunnett test)를 통해 95% 수준에서 유의성을 검증하였다.

 

결 과

혈관내피세포 세포탈착 및 세포증식에 관한 실험결과

발효도라지추출물의 세포탈착에 미치는 효과를 평가하기 위하여 발효도라지추출물을 농도별(0.05~100 μg/ml)로 처리한 후 재료 및 방법에 기술한 방법으로 BAEC의 세포탈착 현상을 관찰하였다. 일반적으로 탈착된 세포는 세포사가 일어나면서 나타나는 현상으로 간주되기도 한다[34]. Fig. 1A의 위쪽 패널 그림은 현미경을 통해 관찰된 세포들의 대표 사진이다. 같은 방법으로 여러 번 반복 시행한 실험 결과의 평균치를 Fig. 1A의 아래 패널의 막대 그래프로 나타내었다. 그 결과, 발효도라지추출물 0.1 μg/ml 이하의 농도에서는 내피 세포의 탈착이 일어나지 않았으나, 100 μg/ml 에서 세포 탈착이 통계적으로 유의있게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 100 μg/ml 농도의 발효도라지추출물은 세포에 독성을 나타낼 수 있음을 의미한다. 발효도라지추출물이 세포성장에는 어떤 영향을 주는 지 알아보기 위하여 세포 탈착에 영향이 없는 0.1 μg/ml 와 세포탈착에 영향을 강하게 미치는 100 μg/ml 농도에서 WST-1 분석을 이용하여 세포성장을 평가하였다. Fig. 1B에서 보는 바와 같이 세포 성장은 저농도인 0.1 μg/ml의 발효도라지추출물에서는 시간에 따라 증가하는 것을 관찰하였고, 고농도인 100 μg/ml에서는 세포성장에 영향을 미치지 않음을 관찰하였다. 고농도에서 세포성장을 일으키지 않는 현상은 고농도의 발효도라지추출물은 아마도 세포탈착과 같은 세포 독성 때문에 세포성장이 촉발되지 않은 것으로 추측된다.

Fig. 1.PG at high concentration induces cell detachment, whereas PG at low concentration promotes cell proliferation in bovine aortic endothelial cells. (A) Confluent BAECs were serum-starved for at least 12 hr and then cells were treated for 6-24 hr with none or various concentrations of a fermented Platycodon grandiflorum A. extract (PG). Then, photographs of BAECs were captured by a camera connected to a microscope. After triplicate experiments were performed, representative pictures for each condition were shown in the top panel. In bottom panel, detached cells (shown as round shrunken cells) were counted and quantified. The bar graphs represent numbers of detached cells per a field (means ± SE, n=3). *p<0.05. (B) BAECs were serum-starved for at least 12 hr and treated with none, 100 μg/ml and 0.1 μg/ml PG. Cells were additionally incubated for 0-24 hr after adding with PG. Then cells were reacted with WST-1 reagent according to Manufacturer’s protocol. Line graphs were shown as relative proliferation (means ± SE, n=3). *p<0.05.

고농도(100 μg/ml)의 발효도라지추출물에 의하여 일어나는 혈관내피 세포 탈착은 세포에서 유래한 미세입자(endothelial microparticle)에서 기인함을 증명한 실험결과

세포사는 개략적으로 세포괴사(necrosis), 세포사멸(apoptosis)및 오토파지(autophagy) 등으로 세분화되고, 기존의 연구에서 이들을 구별하는 방법이 보고되었다[29]. 위의 방법을 이용하여, 보다 구체적으로 발효도라지추출물이 혈관내피세포의 세포사에 어떤 영향을 미치는 지 조사하였다. Fig. 2A&B에서 보는 바와 같이 세포사멸과 연계된 caspase-3의 활성화는 저농도 및 고농도의 발효도라지추출물 처리에서 일어나지 않았고, flow cytometry 결과에서도 세포괴사와 연관된 PI staining이나 세포사멸과 연계된 annexin V staining 모두 발효도라지추출물이 특별한 영향을 미치지 않음을 관찰하였다. 오토파지를 관찰할 수 있는 LC-3 conversion이나 p62 degradation에서도 발효도라지추출물이 처리된 혈관내피세포와 처리하지 않은 대조군 세포 사이에 차이가 없었다(Fig. 2C). 이는 발효도라지추출물은 혈관내피세포에서 오토파지를 유발하지 않음을 의미한다. 한편, 고농도의 발효도라지추출물을 BAEC에 처리한 후, 세포 배지에 microparticle들이 형성되어 있음을 관찰하였다(Fig. 2D의 화살표로 표시된 부위 참조). 이들 microparticle들이 내피세포에서 유래한 microparticle인지 확인하기 위하여 내피세포의 marker중에 하나인 CD31 western blotting을 해 본 결과, 고농도의 발효도라지추출물이 처리된 세포 배양액에서 획득한 microparticle이 CD31이 검출됨을 알 수 있었다(Fig. 2D의 아래 패널참조). 이러한 결과는 고농도 추출물이 내피세포에서 유래하는 microparticle의 형성을 유발함을 보여주는 것이다. 또한 이렇게 형성된 microparticle이 세포와 다른 지 확인하기 위하여, 고농도(100 μg/ml)의 발효도라지추출물을 처리한 세포의 배지를 채취하여, 각각을 먼저 377 × g로 15분간 원심분리하여 침전된 세포를 제거하고, 상등액만 적출한 뒤, 다시 16,000 × g로 침전시켜 침전물을 확보한 후, 그 침전물을 flow cytometry로 BAEC 세포와 비교·분석하였다(Fig. 2E). 이를 통해 고농도 발효도라지추출물 처리에 의해 형성된 microparticle은 BAEC 세포에 비하여 forward scattering light (FSC)와 side scattering light (SCC)와 같은 광 산란이 독특하게 나타나고 있음을 볼 수 있었다. 이러한 결과는 고농도 추출물은 혈관내피세포에서 endothelial microparticle (EMP)의 형성을 유발하고 있음을 의미한다. 추가적으로 이렇게 형성된 EMP가 혈관내피세포의 탈착을 유발하는 지 알기 위한 실험을 수행하였다. Fig. 2F에서 보듯이, BAEC에 EMP를 처리하였을 때, 세포탈착이 유발됨을 알 수 있었다. 위의 결과들을 종합해 보면, 고농도의 발효도라지추출물은 혈관내피세포에서 EMP를 형성하고, 이렇게 형성된 EMP가 내피세포를 탈착시키는 것으로 보인다. 그러나 고농도의 발효도라지추출물에서 의해서 형성된 EMP가 세포독성을 나타내는 지 혹은 혈관에 유익한 효과를 나타내는 지는 현재로서는 알 수 없다.

Fig. 2.PG at high concentration forms endothelial microparticle, then inducing the cell detachment. (A) Serum-depleted BAECs were stimulated with 0 to 100 μg/ml of PG. After cells were lysed, proteins in the cell lysates were resolved with SDS-PAGE, transferred to PVDF membranes and immunoblotted with an anti-caspase-3 antibody. Res (100 μg/ml of resveratrol) was used as a positive control for activating caspase-3. (B) BAECs were treated with or without 0.1 or 100 μg/ml PG, then stained with FITC-tagged annexin V and propidium iodide (PI), as described in Materials and Methods. Stained cells were analyzed with flow cytometry and shown as dot plots. (C) Serum-supplemented or -depleted BAECs treated with 0 to 100 μg/ml PG. Then cells were immunoblotted with antibodies against LC3, p62 and actin. (D) Serum-depleted BAECs were treated with none, 0.1 or 100 μg/ml PG for 24 hr. Then cells were observed under a microscope. Arrows indicate endothelial cell derived vesicles (top panels). Small vesicles called EMP were then prepared as described in Materials and Method, lysed and immunoblotted with CD31 (PECAM-1) antibody (bottom panels). (E) EMP was prepared as described in Materials and Methods. Light scattering (FSC vs SSC) on BAEC cells (left panel) and EMPs (right panel) obtained from PG-treated cells were detected by a flow cytometry. (F) Serum-depleted BAECs were treated with or without 100 μg/ml PG and 1.2×105 particles/ml EMP for 12 hr. Then cell detachment was measured as shown in Fig. 1A. The bar graph represents means ± S.E. (n=3). *p<0.05.

저농도(0.1 μg/ml) 발효도라지추출물이 BAEC의 세포이동을 촉발하는 것을 보여주는 실험결과

혈청기아 처리된 BAEC에 발효도라지추출물을 저농도(0.1 μg/ml)와 고농도(100 μg/ml)로 처리한 경우와 혈청이 제공된 경우의 세포를 창상선을 만들어 시간별로 일어나는 세포이동을 관찰하였다. 양성 대조군으로 사용된 혈청이 처리된 실험군에서 세포이동이 시간별로 가장 강력하게 나타났고, 발효도라지추출물이 처리된 경우는 저농도(0.1 μg/ml)로 처리된 실험군에서 12시간이 지난 후에 혈청기아가 유지된 음성대조군에 비하여 이동한 세포가 눈에 띠게 증가함을 관찰하였다(Fig. 3). 세포의 이동은 혈관형성이나 상처치유를 증진시키는 경우에 나타나는 현상으로 혈관의 생성에 발효도라지추출물이 효능이 있음을 암시하는 실험 결과이다.

Fig. 3.PG at low concentration induces cell migration. Serum-depleted BAEC were scraped by a scraper after treated with 2 mM thymidine and then treated with none, 0.1 μg/ml PG, 100 μg/ml PG or serum for indicated periods of incubation time. Migrated cells were observed under a microscope.

저농도(0.1 μg/ml) 발효도라지추출물이 Akt의 인산화를 유발하는 것을 보여주는 실험결과

발효도라지추출물을 저농도(0.1 μg/ml)와 고농도(100 μg/ml)로 BAEC에 처리한 후, 처리 시간에 따른 여러 신호전달물질들의 활성 정도를 관찰한 실험결과들을 Fig. 4에 보여주었다. 관찰한 신호전달물질들은 혈관내피세포에서 중요한 신호 전달 조절을 하는 eNOS, IκB, Akt 등의 변화를 관찰하였다. 고농도의 발효도라지추출물을 처리한 실험군에서는 시간에 따른 신호전달물질의 활성의 변화가 관찰되지 않았고, 저농도의 발효도라지추출물을 처리한 실험군에서는 Akt의 인산화가 60분까지 서서히 증가한 후, 120분 처리한 실험군에서 현저하게 증가함을 알 수 있었다(Fig. 4A&B). Akt는 다양한 혈관기능을 조절하는 신호전달물질로 알려져 있기 때문에[25], 저농도의 발효도라지추출물에서 효과를 나타냈던 세포 성장 및 세포 이동은 Akt를 매개로 하여 일어났을 가능성이 있음을 본 실험결과를 통해 알 수 있었다.

Fig. 4.PG at low concentration activates Akt. BAECs were serum-starved for 12 hr and then were treated with 0.1 μg/ml (A) or 100 μg/ml PG (B) for indicated periods of incubation time. Then cells were harvested and lysed. Proteins in the cell lysates were resolved with SDS-PAGE, transferred to PVDF membranes and immunoblotted with indicated antibodies.

저농도의 발효도라지추출물에 의하여 유발되는 세포성장 및 세포이동은 Akt의 활성화를 통해 조절되는 현상임을 보여주는 실험결과

저농도의 발효도라지추출물이 Akt의 활성을 유발하였기 때문에, 저농도의 발효도라지추출물에 의하여 증가하는 세포증식이나 세포이동에 Akt의 활성이 중요한 역할을 할 것으로 추측된다. 이를 증명하기 위하여 BAEC에 Akt의 활성을 억제하는 wortmannin을 전처리한 후, 세포성장과 세포이동이 어떻게 변화하는 지 관찰하였다. Fig. 5A에서 보는 바와 같이, BAEC에 wortmannin을 전처리한 실험군에서 발효도라지추출물에 의하여 촉발되는 세포성장이 현저하게 감소하였다. 또한 wortmannin 전처리는 발효도라지추출물에 의하여 유발되는 세포이동도 통계적으로 의미있게 감소함을 알 수 있었다(Fig. 5B). 이러한 결과들은 Akt가 발효도라지추출물이 유도하는 세포성장과 세포이동을 조절하는 중요한 신호전달물질임을 의미한다.

Fig. 5.Wortmannin blocks PG-induced cell proliferation and migration. (A) BAECs were pretreated with or without 1 μM wortmannin (WORT) for 1 hr and then incubated with or without 0.1 μg/ml PG. Cell proliferation was measured with WST-1 reagent as described in Fig. 1B. Relative cell proliferation was plotted as bar graphs (means ± S.E., n=3). *p<0.05. (B) BAECs were pretreated with or without 1 μM wortmannin (WORT) for 1 hr and then incubated with or without 0.1 μg/ml PG. Cell migration was measured as described in Fig. 3. The migrated cells were counted in the same visual field. Bar graphs show mean± S.E. (n=3). *p<0.05.

 

고 찰

본 실험에 사용한 도라지 추출물의 경우, 총 saponin의 함량은 30 mg/g으로 기존에 알려진 도라지의 유효성분인 platycodin A, C, D, D2, polygalacin D, D2 등의 saponion들이 복합적으로 포함되어 있다. 따라서 본 실험에서 혈관내피세포에서 나타나는 효과는 도라지의 saponin 유효성분의 복합효과이거나 추출물에 포함되어 있는 saponin이외의 성분들에 의해서 나타난 효과일 가능성도 배제할 수 없다. 그러나 복합물에 의한 효과는 단일 물질의 효과와는 다르게 나타나거나, 혹은 같은 효과라도 훨씬 더 크게 나타날 수 있다[4, 13]. 따라서 우리 연구에서 나타난 발효도라지추출물의 혈관 효과는 도라지에서 추출한 특정 성분의 효능에서는 볼 수 없거나, 효과가 있더라도 작은 효과가 증폭되어 나타난 것일 수 있다.

고농도의 발효도라지추출물은 세포탈착을 유발함을 본 연구를 통해 알 수 있었다. 기존의 연구에서 세포탈착은 세포사와 밀접한 관련이 있었으나[29, 34], 발효도라지추출물의 경우는 세포의 탈착이 유발되었지만 세포사멸, 세포괴사, 오토파지 등과는 관련이 없는 것이 특이한 현상이었다. 고농도의 발효도라지추출물이 일으킨 세포탈착은 오히려 EMP와 관련이 있음을 본 연구를 통해 관찰하였다. 내피세포에서 형성되는 EMP에 관한 연구 보고는 최근에 많이 이루어졌다[8]. 기존의 연구에 의하면 EMP의 형성은 세포활성이나 세포사멸에 의하여 나타나는 것으로 알려져 있다[8]. 본 연구의 결과, BAEC의 세포사멸의 중요한 신호전달물중의 하나인 caspase-3의 활성화[14, 19, 34]를 고농도의 발효도라지추출물은 전혀 촉진시키지 않았으며 또한 Annexin V staining도 전혀 증가시키지 않는 점을 고려해 보면, 고농도의 발효도라지추출물이 유발하는 vesicle덩어리는 세포사멸체(apoptotic body)는 아니며, 세포활성 때문에 형성된 vesicle 덩어리(EMP라 칭함)로 보인다. 이렇게 형성된 EMP가 혈관에서 유익한 기능을 하는 지 혹은 유해한 기능을 하는 지는 아직까지 불명확하다. 어떤 보고에 의하면 EMP의 형성은 염증반응의 증가나 혈전형성의 증가와 관련이 있다는 보고가 있는 반면에[8, 24, 26], 혈액내의 EMP 증가는 혈중 lipid의 감소현상[36] 혹은 혈관에서 paracrine 혹은 autocrine의 작용을 하면서 세포간 소통을 하거나 물질교환을 하는 데에 필요하다는 보고[6]도 있다. 현재로서는 고농도의 발효도라지추출물이 형성시키는 EMP가 내피세포의 기능에 어떤 효과를 나타낼 것인지는 추가적인 연구가 필요한 실정이다. 다만 본 연구에서의 특이한 발견은 고농도의 발효도라지추출물이 EMP를 형성시키고 이렇게 형성된 EMP가 세포의 탈착을 유발한 것이다. 혈관내피세포의 탈착은 생리적인효능과 연계되기 보다는 병리적 현상과 더 밀접한 관계에 있다[17, 31]. 내피세포가 혈관으로부터 탈착되는 현상은 혈관의 상태를 불안정하게 만들 뿐만 아니라 탈착된 세포에 의하여 혈전증이 일어날 수 있기 때문이다.

고농도의 발효도라지추출물이 나타내는 혈관기능이 유익한 것인지 혹은 유해한 것인지 애매하였던 반면에 저농도(0.1 μg/ml)의 발효도라지추출물은 생리적인 효능이 비교적 뚜렷하게 나타났다. 농도와 연계하여 생리적으로 보다 실현 가능한 농도는 100 μg/ml의 고농도라기 보다는 100 ng/ml의 저농도이다. 따라서 저농도의 발효도라지추출물이 혈관에 나타내는 기능은 더욱 주목해서 보아야 할 것이다. 본 연구의 결과 저농도의 발효도라지추출물이 혈관내피세포에 미친 효능은 세포 성장과 세포 이동을 유발하는 효과였다. 세포성장과 세포이동 모두에게 영향을 미치는 천연물은 혈관신생과 상처치유를 촉진하는 효과를 가질 수 있다[3]. 적은 농도의 추출물이 이와 같은 효과를 나타내는 현상은 발효도라지추출물 내의 여러 성분이 복합적으로 작용하여 나타났을 수도 있고, 우리가 아직 밝혀내지 못한 특정 성분에 의하여 그 효과가 나타났을 수도 있다. 그에 관한 정확한 이해는 추후에 추가적인 연구를 통해 밝혀져야 할 것이다.

본 연구에서 한 가지 더 주목할 것은 저농도의 발효도라지추출물이 혈관에 미치는 효능은 Akt의 활성에 의하여 조절됨을 규명한 것이다. 혈관에서 염증반응이나 혈전 형성 등에 영향을 미치는 대표적인 물질이 nitric oxide (NO)인데, 발효도라지추출물은 NO를 생산하는 eNOS를 활성화시키지 않음이 관찰되었고, 또한 다양한 염증유발물질들의 전사를 촉발하는, IκB/NFκB 복합체에서 NFκB를 활성화시키기 위한 IκB 분해 현상도 관찰되지 않았다. Akt는 또 하나의 잘 알려진 혈관내피세포 조절인자인데, 이를 발효도라지추출물이 활성화시키는 것도 주목할 만하다. 그러나 발효도라지추출물에 의한 Akt의 활성은 농도 의존적이었고, 오히려 저농도의 발효도라지추출물에서는 Akt가 활성화되었지만, 고농도에서는 전혀 영향을 미치지 않았다. 농도에 따라 이렇게 다른 효과가 나타난 것은 발효도라지추출물이 복합물이기 때문에 나타난 현상으로 보인다. 추출물에 들어있는 복합물의 성분을 우리가 다 알지 못하지 때문에, 아직 알지 못하는 어떤 성분이 고농도에서는 Akt 활성을 방해하여 나타난 현상으로 추측된다. Akt 활성은 혈관형성에 중요한 매개체 중의 하나로 알려져 있기 때문에[32], 저농도의 발효도라지추출물이 내피세포 성장을 촉발하거나 세포 이동을 증진시키는 현상은 기존의 연구와 일치한다. 우리가 수행하였던 저농도의 발효도라지추출물이 나타내는 혈관기능을 조절하는 신호전달물질을 규명한 연구는 추후 기전 및 물질분석을 수행하는 연구에 기반 정보로 활용될 수 있을 것이다.