Effects of the mixture of fenugreek seeds and Lespedeza cuneata extracts on testosterone synthesis in TM3 cells oxidative stressed with H₂O₂

호로파와 야관문 복합추출물이 과산화수소로 산화적 스트레스가 가해진 TM3 세포의 테스토스테론 합성에 미치는 영향

This study investigated the effects of a mixture of fenugreek seeds and Lespedeza cuneata extracts on testosterone synthesis in TM3 cells that were oxidatively stressed with $H_2O_2$. In order to oxidatively stress TM3 cells, the cells were treated with $50{\mu}M$ hydrogen peroxide for 4 hr in serum-free media. Yagwanmun-horopa mixture (YHM) showed neither cytotoxicity nor increment of cell proliferation in the oxidatively stressed TM3 cells in any concentration. When the cells were treated with hydrogen peroxide, testosterone levels decreased, but the testosterone level was returned to that of the control level in the presence of YHM. In order to find out the reasons for the increase of testosterone, the expression of the genes involved in the synthesis or disintegration of testosterone. On the other hand, the levels of $3{\beta}$-HSD4 and 17, 20-desmorase, which are involved in testosterone synthesis, were decreased through the use of hydrogen peroxide and were recovered through YHM treatment. Aromatase and $5{\alpha}$-reductase2, which convert testosterone to estradiol and dihydrotestosterone, respectively, were increased through the use of hydrogen peroxide, and were returned to control level through YHM treatment. These results suggest that YHM does not affect TM3 cell proliferation. However, YHM increases the expression of testosterone-synthesizing enzyme, which was decreased through oxidative stress, and decreases the expression of testosterone- converting enzyme, which was increased through oxidative stress. Therefore, it is reasonable that YHM has strong recovery activity on testosterone to normal level, even in the oxidatively stressed TM3 cells which mimics the andropause state.

본 연구는 야관문과 호로파 복합추출물인 YHM이 과산화수소($H_2O_2$)로 산화적스트레스를 가한 TM3 세포의 테스토스테론 발현에 미치는 영향을 확인하고자 수행되었다. 세포독성 시험을 수행하여 YHM의 경우 $40{\mu}g/mL$을 최고 농도로 중농도 $20{\mu}g/mL$, 저농도 $10{\mu}g/mL$ 처리군을 설정하였고, TM3 세포에 산화적 스트레스를 주기 위해서는, serum free 배지에 $50{\mu}M$의 과산화수소를 4시간 동안 처리하였다. 산화적 스트레스가 가해진 TM3 세포에 YHM 시료를 처리하여 세포 생존률에 미치는 영향을 평가하였을 때 모든 농도 처리군에서 세포증식이나 독성이 없었다. 테스토스테론은 과산화수소를 처리하였을 때 감소하였다가 YHM 시료를 처리하였을 때 control 수준으로 회복되거나, control 보다 더 증가하였다. 또한 시료에 의한 테스토스테론 양의 증가원인을 확인하기 위하여, 테스토스테론 합성 및 분해에 관여하는 효소들의 발현량을 ELISA와 Real-time PCR을 통해 알아보았다. 테스토스테론 합성에 관여하는 $3{\beta}$-HSD4와 17,20-desmorase는 과산화수소 처리 시 감소하였다가, YHM을 처리하였을 때는 control 수준으로 회복하였다. 테스토스테론을 estradiol 및 dihydrotestosterone로 변환시키는 aromatase와 $5{\alpha}$-reductase2는 과산화수소를 처리하였을 때 증가하였다가 YHM 시료를 처리하면 control 수준이나 그 이하로 감소하였다. 이 결과들로 보았을 때 YHM 시료는 TM3 세포의 증식에는 영향을 미치지 못 하지만, 산화적 스트레스에 의해 감소된 테스토스테론 합성 효소의 발현을 증가시키고, 반대로 증가되는 테스토스테론 분해 효소의 발현은 감소시켜, 결국 산화적 스트레스에 의해 저하된 테스토스테론의 양을 회복시키거나 증가시키는 효과가 있는 것으로 판단된다.