재료 및 방법
실험재료 – 약용식물은 2012월 10월부터 2014년 5월까지 베트남에서 채취되어, 가천대학교 생명과학과 김주환 교수의 감정을 거친 후 실험 재료로 사용되었다(Table II). 사용한 실험 재료의 증거표본은 한국한의학연구원 표본실에 보관 중이다.
Table I.IC50 values were calculated from the dose inhibition curve.
Table II.Extracts numbers and collect localities of the herbal medicines from Vietnam
추출 및 시료조제 – 분쇄한 시료 200 g에 2 L의 에탄올을 넣고 실온상태에서 3일간 3회 추출하였다. 이를 여과하여 40℃의 수욕 상에서 감압농축을 실시한 후, 동결 건조기에서 건조하였다. 추출물은 실험 수행 전에 감압 하에서 P2O5를 이용하여 24시간 이상 재건조한 후 DMSO(Sigma, St. Louis, MO, USA)에 용해시켜 stock solution을 조제하였으며 DMSO의 최종 농도가 0.2%가 되도록 15% Tween 80(Sigma, St. Louis, MO, USA)용액으로 희석하여 사용하였다. 추출에 이용한 에탄올 및 그 외 시약은 1급 및 특급시약을 사용하였다.
In vitro에서 최종당화산물 생성저해 실험 – Vinson과 Howard21)의 방법을 변형하여 실험을 실시하였다. 본 실험에서는 10 mg/ml의 우혈청 알부민(bovine serum albumin, Sigma)을 0.2M phosphate buffer(pH 7.4)에 용해시키고, 0.2 M의 fructose와 glucose를 처리하였다. 이 때 0.2 M phosphate buffer에 0.02% sodium azide를 넣어 반응기간 동안 박테리아의 생성을 방지하였다. 이 반응액에 추출물 또는 최종당화산물 생성저해제인 aminoguanidine을 넣은 후 37℃에서 7일 동안 반응시켰다. 이때 시료의 IC50값을 구하기 위해 1, 2.5, 5, 10, 25, 50, 75 μg/ml의 7개 농도에서 실험 하였다. 배양 후에는 spectrofluorometric detector(Bio-TEK, Synergy HT, USA)를 이용하여 형광도를 측정하였다(Ex.: 350, Em.: 450 nm). 추출물의 최종당화산물 생성 저해활성 효과는 『최종당화산물 생성 저해 활성(%) = 100 − {(배양한 시료 형광도 − 배양하지 않은 시료 형광도) × 100/(배양한 시료 형광도 − 배양하지 않은 시료 형광도)의 평균(n=3)}』의 수식에 따라 산출하였다. 최종당화산물 생성 저해 활성 분석은 3반복을 1회로 하여 3회 이상 반복하였으며, 통계처리는 평균±표준오차(mean±SE)로 표기하였다.
결과 및 고찰
최근 당뇨병성 만성 합병증의 발생이 증가함에 따라 당뇨합병증의 원인 중 하나인 최종당화산물의 생성 억제제가 당뇨합병증의 예방 및 치료제로 제시되었다.22,23) 대표적인 최종당화산물 억제제인 aminoguanidine은 독성 문제가 제기되어 독성이 없는 안정한 천연물의 검색을 위해 많은 연구들이 진행되고 있다.24,25) 본 연구팀은 최종당화산물 생성을 강력하게 억제하는 천연물 소재를 발굴하기 위하여 많은 천연소재들의 효능을 검색 발표하였다.11-20)
본 연구에서도 베트남에서 자생하는 약용식물 80종의 에탄올 추출물을 이용하여 최종당화산물 생성 저해 효능을 측정하였다. 양성 대조 약물인 aminoguanidine의 IC50값(76.47±4.8 μg/ml)을 근거로 하여, 추출물이 IC50: <50 μg/ml 이면 효능이 있다고 판단하였다. 24종의 식물 추출물이 IC50: <10 μg/ml로 최종당화산물 생성 저해 효능을 보였고, 그 중에서 10종의 추출물 Strobilanthes pateriformis의 지상부(3.85±0.1 μg/ml), Rhodamnia dumetorum의 소지(3.88±0.1 μg/ml), Glochidion rubrum의 소지(2.38±0.0 μg/ml), Dipterocarpus obtusifolius의 소지(4.11±0.1 μg/ml), Bombax ceiba의 소지(4.11±0.0 μg/ml), Amesiodendron chinense의 소지(4.68±0.1 μg/ml), Bauhinia coccinea의 소지(3.93±0.0 μg/ml), Lithocarpus laouanensis의 소지(4.61±0.2 μg/ml), Bauhinia bracteata의 소지(4.56±0.2 μg/ml), Connarus paniculatus의 소지(2.75±0.3 μg/ml)는 IC50가 5 μg/ml 이하로 aminoguanidine보다 약 16-31배 이상의 우수한 효능을 보였다.
도금양과의 R. dumetorum의 소지와 뿌리는 HepG2 cell과 Vero cell에 대해 세포 독성이 있다고 보고되었다.26) 대극과의 G. rubrum는 복통 및 다양한 질병에 사용되었다고 기록되어 있으며,27) 가수분해성 타닌인 glochiin M1, glochiin M2, glochiin C1과 lignan, neolignan glucoside, tachioside 2’-O-4”-methylgallate가 함유되어 있다고 보고되었다.28,29) 이엽시과의 D. sifolius의 줄기에서 발견된 새로운 terpene은 암세포에 증식 억제 효과가 있다고 보고되었다.30) 판야과의 B. ceiba의 잎에서 새롭게 발견된 C-glycoside이 동물모델에서 혈압강하와 저혈당 활성이 있다고 보고되어 최종당화산물 생성 억제제로써 개발 가치가 매우 높다고 사료된다.31,32) 줄기에서 분리한 shamimicin 또한 동물모델에서 혈압을 강하시킨다고 보고되었다.33) 또한 당뇨모델 쥐에서 혈당을 강하시키고, 혈중지질을 감소시켜 항당뇨활성을 나타낸다고 보고되었다.34) 꽃의 추출물은 isoniazid와 rifampicin로 유도된 간독성에 대해 간보호 효과가 있으며,35) 다양한 phenolic 성분들이 함유되어 있어 phytochemcal로서 항산화효과가 있다고 보고되었다.36-38) 또한 옥살산칼슘 요로결석증에 대한 위험을 감소시킨다고 보고되었다.39) 쥐꼬리망초과의S. pateriformis, 무환자나무과의 A. chinense, 실거리나무과의 B. coccinea, 참나무과의 L. laouanensis, 실거리나무과의 B. bracteata, 콘나루스과의 C. paniculatus는 효능 및 성분에 관한 연구가 진행된 바 없으며, 위 언급된 10종의 약용 식물은 최종당화산물 생성 억제 효능이 보고된 바 없으며, 양성 대조 약물 보다 16-31배 이상 최종당화산물 생성 억제효능이 우수한 것으로 확인되었으므로, 전임상 실험을 통해 in vivo효능 확인이 필요하다고 생각된다. 본 연구 결과는 베트남 약용식물로부터 안전하고 효능이 좋은 최종당화산물 생성 저해제 후보를 발굴하기 위한 기초 자료로 활용될 수 있으며, 당뇨에 의해 나타나는 합병증 치료제 개발의 기반을 구축하는데 기여할 수 있을 것이다.
결 론
기원이 확인된 베트남 약용식물 80종의 에탄올 추출물을 대상으로 in vitro에서 최종당화산물 생성저해 효능을 검색하였다. 그 결과 24종이 양성대조군인 aminoguanidine 보다 우수한 효능이 있음을 확인하였고, 특히 S. pateriformis의 지상부, R. dumetorum의 소지, G. rubrum의 소지, D. obtusifolius의 소지, B. ceiba의 소지, A. chinense의 소지, B. coccinea의 소지, L. laouanensis의 소지, B. bracteata의 소지, C. paniculatus의 소지의 10종의 추출물은 양성대조군(aminoguanidine: IC50: 76.47±4.81 μg/ml) 보다 16-31배 억제 효능이 우수하므로 당뇨합병증 예방 및 치료제로 가능성이 있다고 판단하였다.